4 種重金屬離子對海水青鳉胚胎發育及仔魚的急性毒性研究

楊志艷 ,薛雅芳 ,徐永健*

（1.寧波大學 海洋學院,浙江 寧波 315832;2.寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室,浙江 寧波 315832）

水污染是當今社會面臨的主要環境問題之一,已引起了全球的特別關注[1-3].在海洋環境污染物中,重金屬有著來源廣、持久性、長期毒性和生物蓄積性等特征[4-5],被稱為環境中有潛在危害性、高度危害性和難治理性的重要污染物[6].海洋生物能夠直接或間接地從水和食物鏈中積累重金屬,當積累到一定濃度時,重金屬會嚴重破壞水域生態平衡[7],并且各種重金屬也會嚴重影響海洋生物的生長發育、生理功能、死亡和繁殖[8].

對于海域環境重金屬污染的監測,與過程復雜繁瑣、儀器昂貴、檢測數據不具代表性的常規化學分析方法相比,生物監測具有靈敏度高、快速、價格低廉、能反映污染物活性部分的生物學效應及污染物之間交互作用的優點,能充分反映出重金屬在水環境中的動態情況.在生物監測中,可以采用活的生物體來指示環境污染的不利影響,這些生物個體對環境的變化反映敏感是環境污染的指示生物.魚類被廣泛用作生物監測的指示生物,也被認為是評估污染物毒性的有用動物[9].其中,海水青鳉(Oryzias melastigma)是近些年被認可的用于海水生態毒理學研究的模式物種之一[10].

海水青鳉作為鹽水及咸淡水中少數的幾種模式生物種類之一,具有個體小,產卵率高,世代周期短,受精卵透明,易于觀察且不易破碎,基因組小以及鹽度適應廣等特點[11].近些年,有很多工作涉及該物種的環境生態毒理研究和應用[12-13],尤其是側重于胚胎和幼體的毒理研究,也可用以評估環境污染物對魚類的影響[14-15].本文主要通過研究海水青鳉在汞、鎘、銅、鉛等4 種重金屬離子脅迫下的胚胎發育和仔魚生長情況,以期了解海水青鳉在這個階段中對重金屬的特殊敏感時期及敏感濃度,為進一步開展海水重金屬的生物監測提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

試驗動物海水青鳉為寧波大學校內水產養殖基地培育.養殖條件:鹽度30‰、溫度(27.5±0.5)℃、光強約100 lx、光周期14L:10D.讓親魚自然受精后產出受精卵,用虹吸方法分離受精卵并轉移至孵化缸中,用于后述胚胎發育毒性試驗.受精卵在鹽度30‰、溫度(27.5±0.5)℃、光周期14L:10D條件下,孵化約9 d 后,青鳉仔魚密集出膜,用于后述仔魚生長毒性試驗.

1.1.2 試驗試劑

氯化汞(HgCl2)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、氯化鉛(PbCl2)、氯化鎘(CdCl2·H2O)均購于上海國藥集團,均為化學純級別.上述4 種重金屬鹽預先用消毒海水分別配置成母液,0.1 μm 微孔濾膜過濾后保存備用.實驗用海水采用海水晶(海佳牌,上海)加蒸餾水配制,煮沸消毒并濾膜過濾備用.

1.2 試驗方法

1.2.1 重金屬離子濃度設計

根據海水青鳉胚胎及仔魚預實驗結果和各金屬離子在海水體系中的溶解度,設計海水青鳉魚胚胎及仔魚24 h 急性試驗濃度,推算出4 種重金屬24 h 的最小全致死(100%死亡)濃度和最大全不致死濃度的大致范圍.在此范圍內,由于海水青鳉胚胎中濃度范圍相差較小,故按等對數間距設置4 個濃度組,仔魚期按等對數間距設置6 個濃度組,同時均分別設置1 個空白對照組,每組3 重復.取不同體積各試劑母液,稀釋成相應表1 實驗濃度.

表1 各重金屬離子的實驗質量濃度設置 mg·L-1

1.2.2 胚胎急性毒性試驗

通過解剖鏡鏡檢判斷海水青鳉胚胎發育的8個不同時期,分別為受精卵激活期(I)、胚盤形成期(II)、卵裂期(III)、囊胚期(IV)、原腸胚期(V)、神經胚期(VI)、器官形成期(VII)、孵化出膜期(VIII),各期胚胎發育特征參照陳漪等[16]的研究.分別從各期中挑選發育同期的10 枚胚胎細胞,均放置于14 cm 培養皿,各濃度梯度的試驗溶液20 mL,每個濃度梯度設置3 個平行.胚胎急性毒性試驗采用半靜態暴露方式,同時設置人工海水組的空白對照組.各試驗組中胚胎在重金屬離子中的暴露時間為24 h,觀察各個發育時期處理中的胚胎發育及生命活動情況,統計胚胎死亡數.以受精卵不透明、心跳停止等特征作為胚胎急性毒性試驗中的測定和判斷胚胎死亡的依據.計算各期胚胎的死亡率及24 h 半數致死濃度(24 h LC50).

1.2.3 仔魚急性毒性試驗

收集8:00～10:00 時間段內孵出的初孵仔魚,作為仔魚1 期(1 日齡),轉移到消毒后的水族玻璃缸中培育,再從中分別挑選健康有活力的1～10 d 的10 期仔魚進行急性毒性試驗.每個燒杯中放入10條仔魚,試驗溶液為150 mL,每期設置3 個平行.同樣采用半靜態暴露試驗方式,以人工海水作為空白對照組.試驗在光照培養箱中進行,條件仔魚暫養.各試驗組中仔魚在重金屬離子中的暴露時間為24 h,試驗期間每天(10:00)投喂初孵鹵蟲無節幼體,投喂密度約為1 個·mL-1.每天定時觀察各試驗組仔魚的生長情況及生命活動,分別統計各期試驗組中的仔魚死亡數,計算各組中仔魚死亡率及相關半數致死濃度(LC50).

1.3 數據處理

根據機率單位法原理,利用Excel 對結果進行分析,并計算半數致死濃度,公式如下[17-18]:

式中:Z為權重系數公式中的參數;Y為校正死亡率的正態等差.

式中:w為權重系數;P為死亡率,Q=1-P.

2 結果與分析

2.1 胚胎毒性試驗結果

胚胎暴露于Hg2+中(圖1).在胚胎發育的8 期中,除出膜期(VIII 期)外,其他各期對Hg2+表現出敏感.第一階段(第I～III 期),大概是胚胎發育開始的前5 h,受精卵對Hg2+異常敏感,表現為各期的24 h LC50值很低(<15 μg·L-1),最低是I 期,僅為2.34 μg·L-1,表明該期對Hg2+最為敏感.隨著胚胎的發育,受精卵對Hg2+敏感的濃度在逐漸增加,至第二階段(第IV～VI 期),各期Hg2+的24 h LC50值都在100 μg·L-1左右,遠遠高于第一階段(P<0.05),但各組兩兩間差異不顯著(P>0.05).至第三階段的第VII 期達到最大的24 h LC50值,為173.65 μg·L-1,顯著高于第二階段各期(P<0.05).

圖1 海水青胚胎發育各期暴露于Hg2+的24 h LC50值

胚胎暴露于Cu2+中(圖2).僅在發育的第二階段,即囊胚期(第IV 期)、原腸胚期(第V 期)、神經胚期(第VI 期)對Cu2+較為敏感.試驗中發現,第一階段的3 期(I～III)都對Cu2+基本無表現,這3 期中各組胚胎的死亡率與對照組相比差異不顯著(P>0.05);在敏感的IV～VI期中,各組24 h LC50值隨著胚胎發育而顯著提高,即胚胎對Cu2+的敏感性逐漸降低.IV～VI 期的24 h LC50值分別為0.72、4.13、8.86 mg·L-1,各期兩兩間存在顯著性差異(P<0.05).胚胎發育的第三階段對Cu2+也不敏感.

圖2 海水青胚胎發育各期暴露于Cu2+的24 h LC50值

胚胎暴露于Pb2+中(圖3).發育的第一階段表現最為敏感,尤其是其中的I 期和III 期,其24 h LD50值都較低,分別為22.65 和45.78 μg·L-1,而第II 期為163.37 μg·L-1,遠高于I 期和III 期(P<0.05);但總體上都低于第二階段的各期,第IV 至VI 期的24 h LC50值分別為247.65、608.47、792.34 μg·L-1,各期兩兩間存在顯著性差異(P<0.05).至第三階段,即器官形成期(第VII 期)和孵化出膜期(第VIII 期),該階段對Pb2+不敏感.

圖3 海水青胚胎發育各期暴露于Pb2+的24 h LC50值

胚胎暴露于Cd2+(圖4)中的表現類似于Pb2+,區別在于胚胎對于Cd2+敏感性是隨著發育時期逐漸降低的,即各期的24 h LC50值在逐漸上升.第I期最低(27.32 μg·L-1),至第 VI 期最高(1 283.34 μg·L-1),各期兩兩間存在顯著性差異(P<0.05).與Pb2+相類似,第3 階段的胚胎對Cd2+也不敏感.

圖4 海水青胚胎發育各期暴露于Cd2+的24 h LC50值

2.2 仔魚毒性試驗結果

仔魚暴露于Hg2+中(圖5).其中前3 d情況也延續了胚胎發育后期的特點,試驗濃度范圍內對仔魚基本上無影響,直到第4、5 天時才略有毒性效應,但24 h LC50值比較大.到后5 d 階段,尤其是暴露于Hg2+中的7～9 日齡仔魚有異常敏感反應,24 h LC50值都在0.02 mg·L-1左右,遠低于前5 d 值(P<0.05),與胚胎發育第VII 期的24 h LC50值接近(P>0.05).

圖5 海水青仔魚各期暴露于Hg2+的24 h LC50值

仔魚暴露于Cu2+中(圖6).前5 d 階段類似于Hg2+的反應,其中前4 d 延續胚胎期特點基本無影響,5 日齡時略有毒性效應,不過其24 h LC50值超過了10 mg·L-1.后5 d 階段,其中5 日齡～9 日齡的仔魚對Cu2+較敏感.期間隨著仔魚生長增加,24 h LC50值逐漸降低,至8 日齡時出現最低值(0.48 mg·L-1),而后,9 日齡仔魚又有大幅上升,最后10日齡基本上也是不敏感.

圖6 海水青仔魚各期暴露于Cu2+的24 h LC50值

仔魚暴露于Pb2+中(圖7).在前5 d 階段,僅2、3 日齡的仔魚對Pb2+有所敏感,其24 h LC50值都在10 mg·L-1以上;其余1、4、5 日齡仔魚對Pb2+都無表現.至后5 d 階段,尤其是6～8 日齡仔魚表現為對Pb2+較敏感,最低24 h LC50值出現在6 日齡組,為1.87 mg·L-1;而后逐漸升高,7、8 日齡組為4 mg·L-1,9 日齡組約10 mg·L-1.

圖7 海水青仔魚各期暴露于Pb2+的24 h LC50值

仔魚暴露于Cd2+中(圖8).仔魚對Cd2+敏感從第3 日齡開始表現,3～5 日齡仔魚隨著日齡增加,24 h LC50值逐漸降低,5 日齡最低(1.86 mg·L-1);而后5～8 日齡仔魚的24 h LC50值又呈顯著升高的趨勢.經比較,3 日齡和7 日齡間差異不顯著(P>0.05),其余各組間兩兩有顯著性差異(P<0.05),至8 日齡時有最高的24 h LC50值(21.66 mg·L-1).

圖8 海水青仔魚各期暴露于Cd2+的24 h LC50值

3 討論

重金屬是目前較為關注的一類環境污染物,生物毒性大.長期處于低濃度重金屬暴露下的生物,其生長、發育、繁殖和代謝等都受嚴重影響,并且重金屬還能在一些重要器官富集,產生一系列毒性效應[19].不同的生物對不同重金屬開展的毒性研究報道很多,由于生物生理和重金屬特性差異,所得結果往往難以與實際應用比較.此外,哪怕是同一生物對于同一種重金屬的毒性試驗,結果也是難以應用到實際工作中,進而開展有效的生物監測.個中原因可能是難以把握重金屬作用的敏感時間點及敏感濃度.

一般來說,魚類的早期發育階段對重金屬特別敏感.王洪盼等[20]報道日本青鳉(Oryzias latipes)在胚胎期對重金屬最為敏感,比仔魚和成魚易感染有毒物質[21].此外,研究者對胚胎發育不同時期的敏感性也有研究,一般認為在受精初期到原腸期階段,卵膜的透性高,易受重金屬影響.如虹鱒(Oncorhynchus mykiss)胚胎在眼點形成期和孵化期都對Mn 離子較為敏感[22];且在氯化鎳作用下,其胚胎受精初期比眼點形成期還要敏感[23].可以說受精初期對重金屬是最為敏感的時間點.本文得出海水青鳉胚胎對Hg2+、Cu2+、Pb2+、Cd2+各離子的最低24 h LC50值分別為2.34 μg·L-1(I 期)、0.72 mg·L-1(IV 期)、22.65 μg·L-1(I 期)、27.32 μg·L-1(I期).結果發現重金屬離子在海水青鳉受精卵激活期的24 h LC50最低,遠低于仔魚期(除Cu 外),說明胚胎發育最初始階段對于重金屬離子最為敏感,最易受重金屬傷害.現有很多工作也得出相同的結論[24-26].但胚胎發育初期階段持續時間過短的不足給研究工作帶來了許多不便,造成開展生物監測應用的難度很大.

此外,通過比較4 種重金屬最低LC50,我們可以得出4 種重金屬對海水青鳉的胚胎發育毒性大小的排序為Hg2+>Pb2+>Cd2+>Cu2+.有報道指出魚類對常見重金屬離子的敏感性大小為Hg2+>Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+>Cr6+[27].此前該方面研究工作開展較多[24-33],但所得結果卻差異大.其中有客觀的原因,如試驗物種不同[28,30]、金屬離子間相互影響等[34],也有一些主觀性的原因造成不同結果間可比性不強.但是,各研究對重金屬作用機理的推測較一致.在早期胚胎形成階段,重金屬對胚胎的作用是通過與絨毛膜結合或改變細胞膜通透性而產生毒性.那么明確絨毛膜最薄時刻就是重金屬作用最敏感的時間點,也能測出相應的敏感濃度.本試驗中海水青鳉胚胎的受精卵激活階段是敏感時間點,是因為此時的受精卵卵殼外絨毛膜逐漸變薄和硬化,重金屬離子最易于透過而進入胚胎[35].因而該期所得的24 h LC50值為敏感濃度.敏感濃度一般為敏感期的最低LC50或EC50值.總體上看,4種重金屬離子Hg2+、Cu2+、Pb2+、Cd2+都能影響海水青鳉的胚胎發育,但不同的重金屬所作用的胚胎發育期有所不同,所作用的敏感濃度也有所不同.也就是說青鳉胚胎發育的不同時期對不同重金屬的敏感性不一樣,最小作用濃度也有所不同.但不管如何,對胚胎影響的有效濃度基本上是隨著胚胎發育的進展而逐漸上升的.

重金屬對于仔魚影響的研究也很多,影響的主要表現有影響初孵仔魚的個體大小、多種器官的畸形率(頭顱、卵黃囊、脊柱、眼部、尾部)、卵黃囊的吸收作用以及初孵仔魚的生長發育速率等,進而影響到初孵仔魚正常游泳和行為,甚至會導致魚類完全吸收卵黃囊的營養后而死亡.本研究中測得4 種重金屬離子對海水青鳉仔魚的最低24 h LC50值分別為0.018 mg·L-1(7 日齡)、0.48 mg·L-1(8日齡)、1.87 mg·L-1(6 日齡)、1.86 mg·L-1(5 日齡),對海水青鳉仔魚生長的毒性大小排序為Hg2+>Cu2+>Cd2+>Pb2+.總體上看,4 種重金屬離子Hg2+、Cu2+、Pb2+、Cd2+都能影響海水青鳉仔魚發育,但不同重金屬的作用不同,敏感濃度也不同.從結果看,重金屬離子對仔魚的作用期主要在6～8 日齡階段,也就是主要發生在后5 d 階段(除Cd2+外).與胚胎期比較發現,除Cu2+的24 h LC50值略有降低外,其余3 種重金屬的24 h LC50值都大幅度提高,升高了10～ 85 倍.一般來說,仔魚對于重金屬的敏感性不如胚胎.不過本試驗中的Cu2+在海水青鳉仔魚期(8日齡)出現了最低的24 h LC50值.說明對于Cu2+脅迫來說,仔魚期比胚胎期更為敏感.也有少量工作支持此結果[30,36].這可能是因為水環境中Cu2+的濃度過高,仔魚直接接觸Cu2+離子,不像有卵膜保護的胚胎有足夠時間發育來降低重金屬的毒害作用.此外,仔魚不同發育階段對重金屬毒性的敏感性也不同,如外源性營養階段極易受外界環境的影響[37].本試驗中發現,最開始幾天的青鳉仔魚能延續胚胎狀態,而后才顯示出毒性效應,因此仔魚對重金屬的敏感期在第5～8 天(5～8 日齡),且不同金屬種類各有相應的敏感時間點.5～8 d 時間段內,一般是卵黃囊油球剛剛全部消耗完成,開始從內源性營養轉向外源營養的過渡階段.而此時的仔魚生長需要營養支撐,但身體的各項功能尚未發育完全,因而在獲得營養的同時給了污染物可趨之機,致使重金屬對鰓上皮細胞造成損害,造成中毒死亡[38].

綜上,本研究通過海水青鳉胚胎及仔魚急性毒性實驗結果,明確了海水青鳉早期發育階段的敏感期及敏感濃度,這對于海水魚類在海洋環境的生物監控具有重要意義,但對其機理的研究需要進一步深入.