貽貝殼在不同方法下合成羥基磷灰石多孔微球的性能研究

李超群 ,顧忠旗 ,黃 繼 ,石 娟 ,周麗萍 ,王 晴 ,婁永江*

（1.寧波大學 食品與藥學學院,浙江 寧波 315832;2.嵊泗縣海洋科技研究所,浙江 舟山 202450）

羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)是自然界中天然存在的礦物質,廣泛存在于脊椎動物的牙齒和骨骼中[1-2].作為一種典型的生物材料,其具有良好的生物相容性、生物活性和離子交換性[3].目前HA 主要應用于藥物控釋[4]、基因傳遞[5-6]、組織工程[7]、骨組織修復[8]以及其他生物醫學領域[1].張月等[9]闡述了納米HA 在口腔骨缺損中的臨床應用.Tank 等[10]成功地用鈷摻雜的納米HA 進行抗菌和溶血研究.同時,HA 具有很強的吸附作用,可以用來吸附重金屬和其他污染物,也可以用來制備復合物、殺菌劑和催化劑等[3,11-16].Singh 等[17]研究了鈣磷鹽在微波和水熱及有無表面活性劑條件下合成HA 納米棒.Aggarwal 等[18]以鈣磷鹽為原料,用水熱法合成HA 介孔顆粒.HA 具有介孔特性,使其具備較強的吸附和載體作用,因此更具有合成HA 類復合材料的優勢.傳統制備HA 采用硝酸鈣和無機磷酸鹽合成.但是近年來無機鈣鹽和磷酸鹽的礦物原料受限,而以貝殼為原料制備納米帶狀HA、多孔HA 具備低成本、低污染以及富含微量元素等優勢[19].且有研究表明[20-21],生物來源的HA 相較于化學合成的HA 具有更佳的空間網狀結構和相互交通.

近幾年來,貝類加工的副產物產生的廢棄貝殼每年多達數10 萬t[3],除以貝殼為原料制備成各種食藥級鈣劑外,利用貝殼制備HA 鮮有報道[22].利用廢棄貝殼開發生物材料可以解決資源缺乏問題,提高副產物的附加值,經濟效益巨大[20].此外,球形多孔HA 相比于其他形狀,具有比表面積大、更多的藥物和金屬負載量、良好的力學性能和流變性能,更有利于合成具有特殊功能的材料[23].但是對于植物來源或者蛋殼類,因其主要成分為CaCO3,因而大多采用高溫分解CaCO3后與磷酸鹽前驅體反應制備HA,這種方法存在產物的形狀和尺寸難以控制的問題[21].

本文選用舟山嵊泗的貽貝殼作為CaCO3原料,采用水熱法、沉淀法、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)模板劑法以及反相微乳液法制備HA,并對合成的HA 進行結構表征,開展了貝殼合成球形、多孔HA 的技術研究,且選用銀離子驗證貽貝殼HA 的吸附作用.研究表明:該方案可行,并有助于解決廢棄貝殼環境污染問題;同時,對實驗室及工業生產HA 上具有減少成本、提高HA 藥物和重金屬吸附量以及合成功能性材料等作用.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HNO3、HCl、NaOH、Na2CO3為分析純,購于阿拉丁試劑有限公司;貽貝殼取自舟山市嵊泗枸杞貽貝養殖區;(NH4)2HPO4、NH4H2PO4為分析純,購于上海麥克林生化科技有限公司;Na2HPO4?12H2O、無水乙醇、曲拉通X-100(Triton X-100)、吐溫80(Tween 80)為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為分析純,購于北京索萊寶科技有限公司.

JE-OLJSM6700 型X 射線能譜(EDS)和掃描電子顯微鏡(SEM),產自日本電子株式會社;D8 Advance 型X 射線粉末衍射儀(XRD),產自德國布魯克公司;Nicolet 6700 智能型傅里葉紅外光譜(FTIR),產自美國賽默飛世爾;ASAP20202 HD88全自動比表面積及微孔孔隙分析儀(BET),產自美國麥克儀器公司;SPECTRO ARCOS 電感耦合等離子體發射光譜(ICP-OES),產自德國斯派克分析儀器公司.

1.2 方法

1.2.1 碳酸鈣的制備

貝殼洗滌烘干后,取25 g 研磨過30 目的貝殼粉,加入500 mL 1 mol?L-1的HCl 溶液,反應48 h,將得到的濾液用1 mol?L-1的NaOH 溶液調節pH 至7,定容至1 000 mL 容量瓶中;取100 mL 該溶液,快速倒入100 mL 0.25 mol?L-1的Na2CO3溶液中,攪拌2 h,分別用無水乙醇和純水洗滌、過濾,烘干制得貝殼CaCO3.然后用EDS 進行元素分析.

1.2.2 多孔HA 的制備

(1)水熱法(樣品a):取2.50 g CaCO3、0.86 g(NH4)2HPO4和0.99 g NH4H2PO4(鈣磷摩爾比1.67),放入聚四氟乙烯內襯中,加30 mL 純水,調pH 至10,密封后置140 ℃干燥箱控溫24 h,反應結束可見上層液體澄清透明,離心得沉淀物分別用乙醇和純水各洗滌3 次,約60 ℃干燥制得樣品[16].

(2)沉淀法(樣品b):在30 mL 純水中加入1 g CaCO3、2 g Na2HPO4·12H2O,磁力攪拌直到產生白色懸濁混合溶液,調pH 至11,超聲30 min,密封后在50 ℃下反應80 h,離心得沉淀物,分別用乙醇和純水各洗滌3 次,約60 ℃干燥制得樣品.

(3)CTAB 模板劑法(樣品c):取CTAB 0.25 g,加入20 mL 純水攪拌至溶液澄清,加入Na2HPO4?12H2O 0.79 g,攪拌30 min 至溶液澄清,調pH 至10,標記為溶液1.將2.36 g CaCO3溶于10 mL 水,調pH 至11,標記為溶液2.將溶液2 滴加到溶液1中,攪拌24 h,離心得沉淀物分別用乙醇和純水各洗滌3 次,約60 ℃干燥6 h,接著550 ℃煅燒6 h 制得樣品.

(4)反相微乳液法(樣品d):以鈣磷質量比為5:3配置CaCO3溶液和Na2HPO4?12H2O溶液.將Triton X-100 和Tween 80 溶于環己烷中,加入體積比為5:4 的正己醇和正丁醇,然后滴加CaCO3懸濁液,攪拌中加入等體積數Na2HPO4?12H2O 溶液,調pH至11,攪拌10 min,密封沉淀24 h,無水乙醇破乳,離心得沉淀物分別用乙醇和純水各洗滌3 次,約80 ℃干燥6 h,接著550 ℃煅燒6 h 制得樣品.

1.3 吸附銀離子實驗

4 種樣品分別取4 g 加入100 mL 水,超聲震散,再加入100 mL 2 g?L-1硝酸銀,常溫反應7 h,過濾,去離子水洗滌,60 ℃烘干,研磨過300 目篩,得到納米級載銀羥基磷灰石(AgHAp).ICP-OES 表征測試4 種產物中銀離子的吸附含量.

1.4 表征方法

SEM 和EDS:粉末樣品涂在樣品臺上,噴金后分析.

XRD:標識X 射線、Cu Kα 輻射,波長0.154 06 nm,電壓40 kV,電流40 mA,掃描范圍5°～90°,每步掃描時間0.2 s,溫度20 ℃,相對濕度50%.

FTIR:KBr 壓片,掃描范圍400～4 000 cm-1,掃描次數32 次?min-1.

BET:樣品預熱至100 ℃后,置入氮氣氣氛中12 h,BET 比表面積在相對壓力0.05～0.20 之間計算,樣品介孔分布由等溫曲線脫附分支運用孔徑分布測試(BJH)方法計算,總孔容在相對壓力為0.974時得到.

ICP-OES:將制得的樣品各取0.5 g,根據國標法溶解于100 mL 硝酸(V硝酸:V水=5:95)中,溶解后取1 mL 定容至250 mL,之后利用ICP-OES 測試溶液中元素的濃度[19].

1.5 數據處理

采用Origin 9.0 軟件進行數據分析和處理.

2 結果與討論

2.1 碳酸鈣的EDS 表征

圖 1 為貝殼碳酸鈣的EDS 圖像,從圖1 可知,貽貝殼制備的CaCO3為方解石型,形狀為球形和少量立方體型,主要組成元素為O、C 和Ca,含有微量的Na.采用舟山貽貝碳酸鈣水熱法制備HA,反應結束后上層溶液澄清透明.王潤南等[16]選擇連云港海灘的貝殼粉采用水熱法制備HA,反應后上層溶液為淺黃色,表明貽貝碳酸鈣中含有微量或沒有有機質,純度較好.

2.2 4 種方法制得產物的表征

2.2.1 SEM 表征觀察形貌

圖 2 為不同方法制得的HA 樣品的SEM 圖譜,其中水熱法制得HA 為球狀.4 種樣品表面富集針狀納米粒子,詳見表1.

圖2 4 種方法制得樣品的SEM 圖譜

表1 4 種樣品SEM 表征結果

2.2.2 XRD 表征分析產物結構

圖 3 為4 種方法制得的樣品的XRD 圖譜.從圖3 可知,樣品a 有明顯的HA 特征峰且無雜峰,表明貝殼CaCO3已經轉化為HA;此外,HA 特征峰強度大、峰線窄且非常尖銳,說明產物具有良好的結晶度[3],這與文獻[24]得到的結果相似.樣品b 同樣含有HA 的特征峰,但有雜峰,文獻[25]中CaCO3的XRD 圖譜可以佐證樣品b 含有CaCO3雜峰.樣品c也有明顯的HA 特征峰和雜質峰,參考文獻[1]中CaCO3/HA顆粒的XRD 圖譜,可以推測樣品c有未轉化的CaCO3,且轉化率低;根據文獻[26-27]中CaCO3的XRD 圖譜,可以判斷樣品c 為方解石型CaCO3/HA 復合材料.樣品d 與樣本品c 基本一致,均為CaCO3/HA 復合物.對照文獻[19]中CaCO3/HA 復合生物材料的XRD 圖譜可知,用反相微乳液法制HA 的轉化度不高,CaCO3殘留量大.

圖3 4 種方法制得樣品的XRD 圖譜

2.2.3 FTIR 表征進行定性分析

圖 4 為4 種方法制得樣品的FTIR 圖譜.從圖4 可知,樣品a 在波數3 450.62 cm-1附近的寬吸收帶對應為H2O(3 400～3 500 cm-1)中O-H 的拉伸模式[3,28-29].在波數為1 039.50、603.20、565.96 cm-1附近檢測到PO43-基團的伸縮振動峰,表明樣品中含有HA,這與XRD 分析結果一致[3,19,28-29].樣品b在波數3 446.40 cm-1處的吸收峰為H2O 的特征峰.在1 038.44、603.89、567.06 cm-1處是PO43-官能團的特征峰[3,30].在1 420.66、874.53、711.98 cm-1處為CaCO3中CO32-的特征吸收峰[22].出現這些峰的原因可能是實驗過程中吸收了空氣中的CO2,使磷酸鹽被碳酸鹽替換;抑或CaCO3未反應完全[31].樣品c 在波數為3 571.92 cm-1處的吸收峰對應HA 中-OH 產生的伸縮振動峰[32].在3 469.74 cm-1處的吸收峰為H2O 中O-H 的特征峰.而在1 046.66、602.61、570.66 cm-1處的吸收峰是HA中PO43-的特征峰[29,32-33].在1 419.98、1 091.07、874.78、711.94 cm-1處為CaCO3紅外光譜吸收峰.根據文獻[22]的研究結果判斷為方解石CaCO3,這與XRD判斷一致.樣品d在波數3467.75cm-1處的吸收峰為H2O 的 O-H 特征峰.1 047.72、1 091.53、962.35 cm-1處的吸收峰為P-O 的伸縮振動峰[31],在603.23、570.38 cm-1處為O-P-O 的彎曲振動峰[34].參考文獻[22]研究結果,在1 421.01、874.60、847.56、712.05 cm-1處出現明顯的CaCO3的CO32-特征峰.CaCO3的振動吸收峰強度大,即大部分CaCO3未轉化成HA[28],這與XRD 的分析結果一致.

圖4 4 種方法制得樣品的FTIR 圖譜

2.2.4 BET 表征產物介孔結構

圖 5 和圖6 為4 種方法制得樣品的BET 圖譜.

圖5 4 種方法制得樣品的氮氣吸附-脫附等溫曲線

圖6 4 種方法制得樣品的孔徑分布

從圖5 和圖6 可知,4 種樣品均出現明顯的回滯環,吸附-脫附等溫曲線屬于Ⅳ型等溫線[35].在接近飽和蒸氣壓P0時出現急劇上升,這是介孔結構的特征[1].

4 種樣品的BET 表征數據見表2.從表2 可知,4 種樣品的比表面積大小為:樣品a>樣品c>樣品b>樣品d;孔體積大小為:樣品a>樣品c>樣品d>樣品b;孔徑大小為:樣品b>樣品a>樣品c>樣品d;平均孔徑大小為:樣品a>樣品c>樣品d>樣品b.綜上表明:樣品a 的介孔結構和比表面積較好,更有利于吸附重金屬、有機物以及藥物等.

表2 4 種方法制得樣品的BET 表征數據

2.2.5 ICP 表征測定元素含量

通過表3 數據計算可知,樣品a 中的鈣磷比為1.84.XRD 和FTIR 表征結果表明:樣本a 全部為HA,推測樣品a 的HA 為缺磷型羥基磷灰石[36].樣品b 的鈣磷比為9.62,樣品c 的鈣磷比為5.81,樣品d 的鈣磷比為5.70,假設這3 種樣品中的羥基磷灰石為普通型,鈣磷比為1.67,3 種樣品中CaCO3轉化為HA 的程度由大到小依次為:樣品d＞樣品c＞樣品b.

表3 4 種樣品中鈣磷元素含量 mg·L-1

通過ICP-OES 表征測得樣品a、樣品b、樣品c 和樣品d 在相同條件下吸附的銀含量的質量分數分別為3.62%、3.24%、1.00%和0.93%.計算可知:樣品a 的吸附率為75.10%,樣品b 的吸附率為66.95%,樣品c 的吸附率為20.20%,樣品d 的吸附率為18.75%.吸附力從大到小排序為:樣品a>樣品b>樣品c>樣品d,樣品a 的吸附率最大,即羥基磷灰石比CaCO3/HA 復合材料的負載量多.在加入鈣磷比1.67 且采用水熱法制備HA 的條件下,貽貝殼AgHAp 粉體的銀含量略優于陳華軍等[37]用鈣磷鹽制備的AgHAp 粉體的銀含量,驗證了有關生物來源的HA 較化學合成HA 具有相互交通的空間網狀結構的結論[20].

3 結論

(1)舟山市貽貝殼中的 CaCO3為方解石型,EDS 分析得出其安全性良好,無有害金屬,確定貝殼制備HA 方案安全可行.

(2)以貽貝殼為鈣源時用水熱法易合成出HA多孔微球,反應完全;用沉淀法、CTAB 模板劑法和反相微乳液法易合成出方解石型CaCO3/HA復合材料.

(3)HA 多孔微球比方解石型CaCO3/HA 復合材料的比表面積和孔徑結構更優異,有利于合成更多特殊功能的復合材料.

(4)水熱法制備的貽貝殼HA 載銀的質量分數為3.62%,吸附率達75.10%,吸附作用略優于化學合成HA,且成本低,可實現貽貝殼的高值化利用.