基于網絡藥理學及分子對接探討骨碎補-補骨脂藥對治療骨轉移癌痛的作用機制

賴桂花 王菲 周芳 向婷婷 文玲 伍卓珺 曹建雄

〔摘要〕 目的 采用網絡藥理學及分子對接技術探討骨碎補-補骨脂治療骨轉移癌痛的作用機制。方法 通過文獻查找、TCMSP 數據庫及BATMAN-TCM數據庫獲取骨碎補-補骨脂的活性成分及其對應的靶點，通過GeneCards數據庫獲得骨轉移癌痛相關的靶點，利用Venn在線軟件獲取“化合物-疾病”共同靶點，運用Cytoscape 3.7.1軟件構建“中藥-化合物-靶點-疾病”網絡圖，使用STRING數據庫繪制核心靶點PPI網絡，利用DAVID對核心靶點進行GO功能及KEGG通路富集分析，最后使用Auto Dockt Vina對骨碎補-補骨脂關鍵化學成分與核心靶點進行分子對接驗證。結果 骨碎補-補骨脂關鍵化合物為豆甾醇、異補骨脂素、補骨脂酚、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素等，核心作用靶點涉及AKT1、TP53、IL-6等;GO生物學過程分析表明骨碎補-補骨脂活性成分的基因功能主要表現在RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的正調控、信號轉導、細胞增殖的正調控等過程，KEGG結果表明骨碎補-補骨脂主要作用與AKT1、TP53、IL-6等核心靶點和癌癥通路等信號通路有關。分子對接結果表明豆甾醇、異補骨脂素、補骨脂酚、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素與AKT1、TP53、IL-6有很好的結合能力。結論 骨碎補-補骨脂活性成分豆甾醇、異補骨脂素、補骨脂酚、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素可能通過癌癥通路等信號通路作用于AKT1、TP53、IL-6等關鍵靶點而發揮治療骨轉移癌痛的功效。

〔關鍵詞〕 骨轉移癌痛;骨碎補;補骨脂;網絡藥理學;分子對接

〔中圖分類號〕R285? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.011

Mechanism of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） Drug Pair on Treatment of Bone Metastasis Cancer Pain Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

LAI Guihua1， WANG Fei1， ZHOU Fang1， XIANG Tingting1， WEN Ling1， WU Zhuojun1， CAO Jianxiong1，2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To use network pharmacology and molecular docking technology to explore the mechanism of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） for the treatment of bone metastasis cancer pain. Methods Through literature search， TCMSP database and BATMAN-TCM database， the active ingredients of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） and their corresponding targets were obtained， the targets related to bone metastasis cancer pain were obtained through GeneCards database， and the "compound-disease" common targets were obtained by using Venn online software. Cytoscape 3.7.1 software was used to construct “Chinese medicine-compound-target-disease” network diagram， STRING database was used to draw core target PPI network， DAVID was used to perform GO function and KEGG pathway enrichment of core target. Auto Dockt Vina was used to verify the molecular docking between the key chemical components of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） and their core target. Results The key compounds of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） were stigmasterol， isopsoralen， bakuchiol， kaempferol， β-sitosterol， luteolin， etc. The core targets involved AKT1， TP53， IL-6， etc. GO biological process analysis showed that the gene function of the active ingredients of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） was mainly manifested in the positive regulation of RNA polymerase II promoter， signal transduction， and positive regulation of cell proliferation. The results of KEGG showed the main role of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） was related to AKT1， TP53， IL-6 and other core targets and cancer signaling pathways. The molecular docking results showed that stigmasterol， isopsoralen， bakuchiol， kaempferol， β-sitosterol， luteolin had good binding ability with AKT1， TP53， and IL-6. Conclusion Active ingredients stigmasterol， isopsoralen， bakuchiol， kaempferol， β-sitosterol， luteolin of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） may act on AKT1， TP53， IL-6 and other key targets through signaling pathways such as cancer pathway to treat bone metastasis cancer pain.

〔Keywords〕 bone metastasis cancer pain; Gusuibu （Drynariae Rhizoma）; Buguzhi （Psoraleae Fructus）; network pharmacology; molecular docking

骨轉移癌痛（bone cancer pain， BCP）是惡性腫瘤轉移到骨引起的疼痛，嚴重影響患者的生活質量，發病機制復雜，其主要機制是由于腫瘤細胞的侵犯使骨穩態失衡，骨質得到破壞，引發BCP[1]?，F代醫學治療主要以病因治療和對癥治療為主，對癥治療以止痛藥物為主，止痛效果明確，但由于耐藥、藥物副作用、心理因素和個體差異等多方面的原因，臨床治療效果并不滿意，同樣抗腫瘤等病因治療也未能取得理想的長期治療效果[2-4]。如何對BCP進行有效合理的治療，是當今臨床亟需解決的問題。臨床及現代藥理研究[5-7]證實，中醫藥治療BCP是有效、安全的，且在協同增效、降低西藥毒性等方面發揮重要的作用。筆者前期基于數據挖掘對中醫內服方劑治療BCP文獻中的醫案及臨床研究進行分析和研究，發現骨碎補-補骨脂是中醫治療BCP方劑中頻率出現最高的組合[8]，其中骨碎補補腎強骨，補骨脂屬補腎壯陽之要藥，兩者配伍治療BCP，可在補益肝腎精血的同時又溫化腎陽，陰陽雙補從而起到壯骨強筋之用?，F代藥理學研究[9]表明，兩藥合用能促進成骨細胞的增殖，拮抗破骨細胞的過度激活，對BCP具有良好的止痛作用。實驗研究[10]表明，骨碎補、補骨脂具有類似雌激素作用，補骨脂具有抑制破骨細胞生成活性及減少溶骨性活動的功能;而骨碎補則在增加成骨細胞生成方面作用更為明顯，兩者在方劑中配伍使用可協同增效、相互兼治，從微結構改善骨組織、增加骨密度及增強骨質量。網絡藥理學是一門綜合了生物學、藥理學、計算機等多個學科的新興交叉學科，從整體水平、分子層面及多靶點、多通路深入探索藥物與疾病的關系，適應中藥復方多靶點的特性，體現了中藥組方的系統性，有助于闡明中藥的藥理作用[11]。近年來，運用網絡藥理學對中藥治療復雜性疾病的作用機制研究得到了中醫藥研究者的認可和應用[12]。因此，本文通過網絡藥理學方法，收集和分析疾病、藥物信息，從生物信息學角度探討骨碎補-補骨脂治療BCP的可能作用機制，并采用分子對接對關鍵化合物和核心靶點進行初步驗證，為進一步實驗研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1? 骨碎補-補骨脂的化學成分篩選及靶點預測

在TCMSP數據庫（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）收集骨碎補的化學成分，根據藥物動力學（absorption、distribution、metabolism、excretion， ADME）的特點將口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件獲得主要活性成分[13]，并基于TCMSP數據庫獲取骨碎補中篩選出活性成分的潛在作用靶點。由于TCMSP中未收集補骨脂相關信息，在BATMAN-TCM數據庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中以“Bu Gu Zhi”（補骨脂）為檢索詞，“Herb”（草藥）為輸入格式，檢索Score Cutoff設置為20，以P<0.05為有效靶點預測置信區間，檢索獲得補骨脂的活性成分及其作用靶點信息。并根據文獻檢索增加骨碎補、補骨脂中有明確藥理活性的主要成分，將檢索所得各個主要成分于TCMSP 數據庫、ETCM數據庫中檢索相關靶點。最后通過Uniprot數據庫（https//www.uniprot.org/）將兩者藥物的靶點名稱統一標準化處理，標準化命名為基因名稱。

1.2? 骨碎補-補骨脂中活性化合物治療BCP的靶點映射

利用Genecards數據庫（https：//www.genecards.org/）以“bone cancer pain”為關鍵詞篩選疾病BCP相關靶點基因。利用網絡在線繪圖軟件Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，將篩選出的骨碎補-補骨脂的作用靶點與獲取的BCP疾病靶點進行映射，獲得骨碎補-補骨脂治療BCP的關鍵作用靶點。

1.3? 構建“中藥-化合物-靶點-疾病”網絡

將相關數據輸入到Cytoscape（Version 3.7.1）中，構建“中藥-化合物-靶點-疾病”網絡。本研究通過自由度（degree）的大小來分析網絡中的節點，節點的degree值越大則其在網絡中的地位越重要，說明其參與的生物功能越多，生物學重要性越強[14]。

1.4? 構建交集靶點“蛋白與蛋白相互作用”網絡

采用在線STRING數據庫（http：//string-db.org/cgi/input.pl）構建骨碎補-補骨脂作用于BCP的靶點蛋白相互作用（PPI）網絡。并將該PPI導入Cytoscape

3.7.1的軟件中，利用該軟件的插件cytohubba，根據網絡拓撲結構篩選關鍵靶基因。

1.5? GO富集分析與KEGG通路分析

將獲得的骨碎補-補骨脂作用于BCP的預測靶基因導入在線的DAVID數據庫中（https：//david.ncifcrf. Gov），選擇“functional annotation”模塊進行GO功能富集分析以了解靶點主要作用過程，KEGG通路分析觀察靶點在通路中的分布情況。GO富集分析由生物過程（biological process， BP）、細胞組分（cellular component， CC）和分子功能（molecular function， MF）3個部分組成，本研究中GO分析和KEGG分析均以P<0.05、FDR<0.05作為篩選標準[15]。

1.6? 主要潛在活性成分-靶點分子對接

為了驗證靶點預測結果的可靠性，從“骨碎補-補骨脂”治療BCP作用靶點的PPI中選取核心活性化合物和核心靶點進行分子對接。通過 PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載核心活性化合物2D結構的SDF格式文件，并借助 ChemDraw軟件繪其化學結構式。使用Pymol軟件對原PDB文件進行去除水和原配體處理，AutoDockTools 軟件為靶蛋白受體分子加極性氫，通過AutoDock Vina和Python腳本實現分子對接[16]。

2 結果

2.1? 骨碎補-補骨脂活性成分與相應靶點

在TCMSP數據庫中查找出骨碎補的活性成分71個，以OB≥30%，DL≥0.18作為限定條件篩選出活性成分18個（見表1），靶點105個;在BATMAN-TCM數據庫中獲得補骨脂化合物14個，靶點268個。經文獻檢索出苦參黃素為骨碎補的主要活性成分[17]，另外黃芪苷、亞油酸、花翠素、補骨脂寧為補骨脂主要活性成分[18];但根據藥物ADME對文獻來源的有效化合物進行篩選，因OB與DL值過小未符合篩選條件，故不將其納入。

2.2? 成分和疾病共同靶點的獲取

通過GeenCards數據庫得到BCP相關靶點8 935個，使用Venny2.1軟件將骨碎補-補骨脂的活性化合物對應的353個藥物靶點與BCP對8 935個疾病靶點取交集，通過Venn圖的形式得到296個共同靶點。見圖1。

2.3? “中藥-化合物-靶點-疾病”網絡分析

在Cytoscape 3.7.1軟件中導入骨碎補-補骨脂的活性成分、靶點及BCP相關靶標，構建“藥物-疾病-成分-靶標”的可視化網絡圖，圖中可知網絡中共包括節點397個，邊1 105條。其中代表疾病的節點1個，代表藥物的節點2個，代表化合物的節點30個，代表疾病-藥物交集的靶點296個。見圖2。

2.4? PPI網絡分析

將中藥-疾病映射靶點導入STRING數據庫中，建立“骨碎補-補骨脂—BCP”靶點的PPI網絡，共得到296個節點，3 376條邊，平均節點度為 22.9;再將該結果以TSV格式導出，通過Cytoscape 3.7.1軟件對該網絡進行拓撲分析，以degree值≥46（根據degree平均值的倍數）為篩選標準，并刪除與骨轉移癌痛無關的靶點，得到24個核心靶點，處于核心位置的靶點（排名前10）有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、抑癌基因TP53、白細胞介素-6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、雌激素受體（ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、原癌基因JUN、腫瘤壞死因子（TNF），提示這些靶點蛋白在PPI網絡中發揮著關鍵作用。見圖3。

2.5? GO富集分析與KEGG通路富集分析

DAVID數據庫中GO富集分析表明，骨碎補-補骨脂治療BCP共涉及到395個BP，57個CC以及96個MF，BP中主要是對RNA聚合酶Ⅱ啟動子的正調控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、信號轉導（signal transduction）、細胞增殖的正調控（positive regulation of cell proliferation）等生物過程進行調節。CC中主要是對質膜（plasma membrane）、細胞核（nucleus）、細胞質（cytosol）等細胞組分有顯著作用。MF中主要是對蛋白結合（protein binding）、ATP結合（ATP binding）、鋅離子結合（zincion binding）等分子功能有顯著作用。本研究分別依據P值大小篩選排名前20位的 BP結果繪制氣泡圖，見圖4。

KEGG 通路富集分析表明，骨碎補-補骨脂治療BCP共涉及134條通路。富集靶基因最多的10條通路依次為癌癥（pathways in cancer）、神經活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、cAMP信號通路（cAMP signaling pathway）、乙型肝炎（hepatitis B）、非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease）、cGMP-PKG信號通路（cGMP-PKG signaling pathway3）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、多巴胺能突觸（dopaminergic synapse）、恰加斯?。–hagas disease）、心肌細胞的腎上腺素信號傳導（adrenergic signaling in cardiomyocytes）。見圖5。

2.6? 核心活性成分-靶點分子對接分析

將關鍵化合物為豆甾醇、異補骨脂素、補骨脂酚、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素與靶點AKT1、TP53、IL-6進行分子對接（見表2）。結果表明6個化合物與3個核心靶點均有有較好的結合能力，其中stigmasterol與AKT1的對接效果最好。見圖6。

3 討論

從本研究可知骨碎補-補骨脂中不同的靶標可對應相同的活性成分，同一靶標也可與不同的活性成分相對應，且30個活性化合物中每個化合物都至少與2個疾病靶點相互作用，可見骨碎補-補骨脂治療BCP具有多成分、多靶標的特點。該藥對治療BCP主要是木犀草素、山柰酚等黃酮類化合物及其苷類化合物，豆甾醇和β-谷甾醇等甾體類化合物以及異補骨脂素、補骨脂酚等香豆素類化合物。研究[19]表明木犀草素和山柰酚不僅具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性，而且還具有較好的保護骨的作用。木犀草素可潛在抑制RANLRP3炎性小體過表達、進一步降低Caspase-1、RANKL、VEGF和HIF-1α蛋白表達，并增強OPG蛋白表達起到骨關節保護作用[20]。山柰酚可通過mTORC1信號通路促進牽張力下小鼠骨髓間充質細胞成骨分化[21]。豆甾醇和β-谷甾醇等甾體類化合物在多種腫瘤中發揮重要作用[22]，實驗研究[23]發現其在小鼠的多種急、慢性疼痛模型表現出有效的鎮痛作用，因此，甾體類化合物對于BCP可能具有良好的治療作用。補骨脂素近年來被廣泛應用于骨科疾病的治療，不僅能夠促進骨髓間充質干細胞向骨細胞分化且能夠抑制破骨細胞分化[24-25]，從而起到防治骨科疾病的作用，對于骨癌痛中骨組織的破壞有重要的保護和修復作用。補骨脂酚是補骨脂的主要有效成分，現代醫學研究表明補骨脂酚具有良好的促進骨骼再生與重建的作用[26]。分子對接結果驗證了骨碎補-補骨脂中核心活性成分與AKT1、TP53、IL-6結合后均展現出良好的親和力，其結合能越低代表受體與配體的親和力越好，一般認為結合能小于-4.25 kcal/mol 提示配體與受體有一定的結合活性，小于-5.0 kcal/mol有較好的結合活性，小于-7.0 kcal/mol有強烈的結合活性[27]，說明骨碎補和補骨脂的活性成分與核心靶點均具有較好的結合性。因此，本研究從一定程度上揭示了骨碎補-補骨脂治療BCP的主要活性成分，為其治療BCP提供了一定的依據。

從拓撲出的關鍵節點來看，AKT1、TP53、IL-6、MAPK1、EGFR、VEGFA、ESR1、MAPK14、JUN、TNF等靶點蛋白在PPI網絡中發揮著關鍵作用，既是骨碎補-補骨脂的藥物作用靶點，又是BCP的疾病靶點，提示這些靶點可能是骨碎補-補骨脂作用于BCP的直接作用靶點。結合GO分析及KEGG分析結果，骨碎補-補骨脂治療BCP的可能作用機制與以下四個方面有關：（1）BCP的主要病理是骨組織的破壞，成骨細胞與破骨細胞的增殖與分化參與骨發育和骨代謝的生物學過程[28]，從KEGG通路結果可知富集基因數最多的通路是癌癥通路，其中癌癥相關通路包括經典的Wnt信號通路，該通路對調控成骨細胞與破骨細胞的平衡起著重要的作用[29-30];骨碎補與補骨脂為臨床補腎強骨要藥，文獻[31-32]表明骨碎補與補骨脂可通過多種代謝途徑保護骨組織，不僅可以促進骨髓間充質干細胞的成骨性分化及成骨細胞的增殖，還能抑制破骨細胞的的骨吸收。因此，骨碎補-補骨脂治療BCP可能通過調節成骨細胞與破骨細胞的平衡從而起到保護和修復骨的作用。（2）近年來，研究[33]發現小膠質細胞與BCP的產生具有緊密的聯系，當各種傷害性刺激引起外周敏化時，初級傳入神經末梢釋放P物質，特異性與小膠質細胞受體結合，小膠質細胞明顯增生肥大，并可以釋放大量的促炎性因子，參與并維持BCP的發生。從PPI網絡中的核心靶點可知，TNF與IL-6作為促炎細胞因子在BCP的發生和維持中起關鍵作用[34]。侯公瑾等[35]人通過建立BCP大鼠模型，發現蟾龍鎮痛膏可降低血清中TNF-α、IL-6，表明蟾龍鎮痛膏對BCP大鼠有鎮痛作用，其機制可能與抑制炎性因子釋放有關。另外MAPK被證實與小膠質細胞的活化相關，核心靶點中MAPK1與MAPK14均屬于MAPK，抑制MAPK信號通路可以顯著降低炎癥反應[36]。因此，骨碎補-補骨脂可能通過抑制小膠質細胞的活化衍生的促炎細胞因子和激活相關信號通路，有效緩解BCP。（3）神經病理性性疼痛是BCP的病理機制之一，從結果可知多個靶點和通路直接或間接參與神經病理性疼痛。研究[37-38]表明cAMP-PKA信號通路通過介導炎癥介質引起的外周痛覺敏化和神經病理性疼痛在大鼠BCP的產生和發展中起著重要的作用。此外，鈣的水平及其通道活動有助于疼痛的神經病理過程，因此，鈣信號通路的激活在BCP中有重要的作用[39]。HIF-1α是低氧適應性反應過程中的關鍵轉錄因子，HIF-1α通過上調SDF1-CXCR4信號進而參與神經性病理性疼痛的發生與維持[40]。因此，骨碎補-補骨脂可能通過抑制異常的神經元反應從而達到緩解BCP的目的。（4）BCP的主要病因是腫瘤自身引起，因此，抗腫瘤也是治療BCP的主要治療方法之一，骨碎補-補骨脂治療BCP的核心靶點和通路中包括多個腫瘤相關的靶基因，其作用機制可能是通過作用于腫瘤相關靶點直接或間接起到抗BCP的作用。一項VEGF家族在癌性疼痛中的外周感官神經元的功能作用的研究[41]表明BCP受腫瘤細胞-血管和神經之間的相互作用調節。EGFR在多種腫瘤中表達上調，相關研究[42]表明EGFR參與并維持神經病變及炎癥性疼痛，在多種疼痛動物模型中抑制EGFR可起到鎮痛作用。JUN基因屬于原癌基因之一，有研究[43]表明JUN是緩解神經病理性疼痛的關鍵上調基因之一。PI3K-AKT信號轉導通路為重要的抗腫瘤通路之一，研究[44-45]表明該通路可通過中樞敏化參與乳腺癌骨轉移大鼠BCP脊髓水平的調節，在大鼠BCP發生發展過程中起著重要作用。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學、分子對接等手段，從直觀的角度對藥對骨碎補-補骨脂治療BCP進行了整體的認識，并說明骨碎補-補骨脂可通過直接或間接靶點介導的多個主流信號通路網絡多靶點、多層次作用于BCP，為進一步深入研中藥干預BCP提供了重要參考，相比于傳統藥理學研究呈現出了一定的優勢。受限于本研究僅單純的考慮到中藥、活性化合物、靶點三者之間的數量關系，尚未兼顧到活性化合物與靶點產生的藥效強度因素，因此，藥物在體內的作用機制還需要通過進一步實驗驗證。

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