基于線粒體凋亡通路探究益氣活血方對肝纖維化模型大鼠的干預效果

王立業 孟萍

〔摘要〕 目的 探究益氣活血方對肝纖維化模型大鼠的干預效果及相關作用機制。方法 選取27只SD健康雄性大鼠，其中9只為正常組，其余18只建立肝纖維化模型，并隨機分為模型組、益氣活血方組，每組9只，益氣活血方組大鼠使用4 mL益氣活血方灌胃干預，正常組、模型組大鼠使用4 mL生理鹽水灌胃干預，各組大鼠均連續干預8周。計算各組大鼠肝臟系數、脾臟系數、肝纖維化程度評分，全自動生化分析儀檢測肝功能指標[天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）]、肝纖維化指標[透明質酸酶（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、層粘連蛋白（LN）]水平，酶聯免疫吸附實驗法檢測炎癥因子[白介素-3（IL-3）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α））]、氧化應激反應指標[過氧化氫酶（CAT）、晚期氧化蛋白產物（AOPP）]水平，Western blot法檢測TGF-β/Smads通路蛋白及線粒體凋亡通路蛋白相對表達量。結果 與正常組比較，其他兩組大鼠肝臟系數、脾臟系數較高;與模型組比較，益氣活血方組大鼠肝臟系數、脾臟系數、肝纖維化程度評分較低（P<0.05）。與正常組比較，其他兩組大鼠AST、ALT、HA、PCⅢ、LN、IL-3、TNF-α、AOPP水平較高，CAT水平較低;與模型組比較，益氣活血方組大鼠AST、ALT、HA、PCⅢ、LN、IL-3、TNF-α、AOPP水平較低，CAT水平較高（P<0.05）。與正常組比較，其他兩組大鼠Smad3、Smad2、TGF-β1、Bcl-2相對表達量較高，Bax、Caspase-3相對表達量較低;與模型組比較，益氣活血方組大鼠Smad3、Smad2、TGF-β1、Bcl-2相對表達量較低，Bax、Caspase-3相對表達量較高（P<0.05）。結論 使用益氣活血方對肝纖維化模型大鼠進行干預，改善大鼠肝功能，減輕肝纖維化程度及炎癥反應、氧化應激反應，其作用機制可能為益氣活血方干預能夠調控TGF-β/Smads通路及線粒體凋亡通路蛋白表達，從而起到肝臟保護作用。

〔關鍵詞〕 肝纖維化;益氣活血方;線粒體凋亡通路;肝功能;氧化應激

〔中圖分類號〕R256.4? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.005

To Explore the Intervention Effect of Yiqi Huoxue Formula on Liver Fibrosis

Model Rats Based on Mitochondrial Apoptosis Pathway

Wang Liye， MENG Ping

（Shijiazhuang Hospital of Traditional Chinese Medicine， Shijiazhuang， Hebei 050051， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the intervention effect and related mechanism of Yiqi Huoxue Formula on liver fibrosis model rats. Methods 27 SD healthy male rats were selected， 9 of which were in the normal group， and the remaining 18 were established to model liver fibrosis， and were randomly divided into model group， Yiqi Huoxue Formula group， 9 rats in each group. Rats in Yiqi Huoxue Formula group were given 4 mL Yiqi Huoxue Granule intragastric intervention， while rats in normal group and model group were given 4 mL normal saline intragastric intervention， rats in each group were continuously intervened for 8 weeks. The scores of liver and spleen coefficient and liver fibrosis degree were calculated. The levels of liver function indexes [aspartate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT）] and liver fibrosis indexes [hyaluronidase （HA）， procollagen type Ⅲ （PCⅢ）， laminin （LN）] were detected by automatic biochemical analyzer. The levels of inflammatory factors [interleukin （IL-3）， tumor necrosis factor-alpha （TNF-α）] and oxidative stress indexes [catalase （CAT）， advanced oxidation protein products （AOPP）] were detected by ELISA. The relative expression levels of TGF-β/Smads pathway protein and mitochondrial apoptosis pathway protein were detected by Western blot. Results Compared with normal group， liver coefficient and spleen coefficient of the other two groups were higher. Compared with model group， liver coefficient， spleen coefficient and liver fibrosis degree score of rats in Yiqi Huoxue Formula group were lower （P<0.05）. Compared with the normal group， the levels of AST， ALT， HA， PCⅢ， LN， IL-3， TNF-α and AOPP in the other two groups were higher， and the level of CAT was lower. Compared with model group， the levels of AST， ALT， HA， PCⅢ， LN， IL-3， TNF-α and AOPP in Yiqi Huoxue Formula group were lower， and the level of CAT was higher （P<0.05）. Compared with the normal group， the relative expression levels of Smad3， Smad2， TGF-β1 and Bcl-2 were higher in the other two groups， while the relative expression levels of Bax and Caspase-3 were lower in the other two groups. Compared with model group， the relative expression levels of Smad3， Smad2， TGF-β1 and Bcl-2 in Yiqi Huoxue Formula group were lower， while the relative expression levels of Bax and Caspase-3 were higher （P<0.05）. Conclusion Yiqi Huoxue Formula was used to intervent liver fibrosis model rats can improve the rat liver function， reduce the degree of liver fibrosis and inflammation， oxidative stress， its mechanism may be that Yiqi Huoxue Formula intervention can control TGF-β/Smads pathway and mitochondrial apoptosis protein expression， thereby playing a protective role in liver.

〔Keywords〕 hepatic fibrosis; Yiqi Huoxue Formula; mitochondrial apoptotic pathway; liver function; oxidative stress

肝纖維化并不是獨立的疾病種類，而是一種較為復雜的生理病理過程[1-2]。研究[3]表示，機體肝臟組織受到損傷后修復過程中均會伴有肝纖維化過程，但是若肝損傷未能短時間內恢復，肝纖維化現象持續存在，可能會進一步惡化，發展為肝硬化甚至肝癌，嚴重威脅患者身體健康和預后。臨床常用的治療肝纖維化的手段為針對原發病的治療以及針對肝纖維化的治療，但效果不能使人滿意。研究[4]表示，中醫藥在肝纖維化的治療過程中具有一定的優勢，益氣活血方為我國著名肝病專家南月敏教授所創方劑，有學者在研究中將益氣活血方應用于肝纖維化的治療[5]，但是關于益氣活血方治療肝纖維化的機制尚不明確。本研究使用益氣活血方干預肝纖維化大鼠，旨在探究益氣活血方對肝纖維化的干預效果及作用機制。

1 材料

1.1? 動物

選取27只SD健康雄性大鼠，由河南省實驗動物中心提供（生產許可證號：SCXK（豫）2017-0001），年齡9～10（9.5±0.4）月;體質量228～252（240.5±9.6）g。在相對濕度50%～55%、溫度（22.8±2.1）℃的環境中喂養1周，光照12 h/d。

1.2? 主要試劑

兔抗大鼠過氧化氫酶（catalase，CAT）抗體（美國Hyclone公司，批號：A25291）;兔抗大鼠晚期氧化蛋白產物（adanced oxidation protein products，AOPP）抗體（美國Hyclone公司，批號：A23652）;小鼠抗大鼠白介素-3（interleukin-3，IL-3）抗體（美國BD公司，批號：N3667）;小鼠抗大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（美國BD公司，批號：N4237）;小鼠抗兔轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）抗體（美國Invi?trogen公司，批號：C1358）;小鼠抗兔Caspase-3抗體（美國Invitrogen公司，批號：C1592）;大鼠抗小鼠透明質酸酶（hyaluronidase，HA）抗體（美國Selleck公司，批號：S8753）;大鼠抗小鼠Ⅲ型前膠原（procollagen Ⅲ，PCⅢ）抗體（美國Selleck公司，批號：S2357）;大鼠抗小鼠層粘連蛋白（laminin，LN）抗體（美國Selleck公司，批號：S1675）;小鼠抗兔Bcl-2抗體（丹麥Dako公司，批號：D8569）;小鼠抗兔Bax抗體（丹麥Dako公司，批號：D9231）;大鼠抗小鼠Smad3抗體（美國Gibco公司，批號：A2317）;大鼠抗小鼠Smad2抗體（美國Gibco公司，批號：A3552）;兔抗小鼠天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）抗體（美國Sigma公司，批號：D9423）;兔抗小鼠丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）抗體（美國Sigma公司，批號：D9251）。

2 方法

2.1? 模型建立及分組干預

隨機選取9只大鼠為正常組，其余18只大鼠建立肝纖維化模型[6]。將18只模型大鼠隨機分為模型組、益氣活血方組各9只，均使用3 mL/kg 30% CCl4橄欖油溶液（上海麥克林生化科技有限公司，批號：H20120225）進行灌胃，2次/周，連續8周。益氣活血方組大鼠自造模起使用益氣活血方（由黃芪、丹參、茯苓、豆蔻、郁金組成，配方顆粒由廣東一方制藥有限公司提供）灌胃，1次/d，4 mL/次，正常組、模型組大鼠使用生理鹽水灌胃處理，1次/d，4 mL/次。實驗期間所有大鼠均在相同環境中，使用標準飼料進行喂養，每日稱各組大鼠體質量。末次給藥后禁食12 h，稱量體質量后麻醉處死，采集所需標本進行實驗。

2.2? 觀察指標

2.2.1? 臟器系數? 對各組大鼠進行麻醉處理后，頸椎脫臼法處死，取大鼠肝臟、脾臟組織，稱量濕質量后對臟器系數進行計算，臟器系數=濕質量（g）/體質量（kg）[7]。將所取肝臟組織固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規石蠟包埋及連續切片，將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察。

2.2.2? 肝纖維化程度[8]? （1）0級：未發現纖維化，計0分;（2）1級：肝組織匯管區出現纖維化擴大，小葉內、局限竇周出現纖維化，計1分;（3）2級：匯管區四周出現纖維化，纖維間隔形成，肝小葉結構保留，計2分;（4）3級：纖維間隔伴小葉結構紊亂，但未出現肝硬化情況，計3分;（5）4級：出現嚴重纖維化、早期肝硬化情況，計4分。

2.2.3? 肝功能、肝纖維化指標檢測? 取各組大鼠麻醉處死前腹部靜脈血3 mL，400 g離心處理15 min后分離上清液，在-80 ℃環境中保存待檢。采用全自動生化分析儀對肝功能指標AST、ALT及肝纖維化指標HA、PCⅢ、LN水平進行檢測，檢測過程嚴格按照全自動生化分析儀操作說明書進行。

2.2.4? 炎癥因子、氧化應激反應指標檢測? 酶聯免疫吸附實驗法檢測炎癥因子IL-3、TNF-α及氧化應激反應指標CAT、AOPP水平。設置10個標準孔，設置1個空半空及若干待測樣品，在10 μL待測樣品中加入40 μL樣本稀釋液，封板膜封板，置于37 ℃水浴箱溫育30 min，清洗反應板5次，每次間隔30 s，拍干，在除空白孔以外的各孔中加入酶標液50 μL，封膜溫育30 min，清洗反應板5次，每次間隔30 s，拍干，在各孔中加入顯色A液、B液各50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光環境下顯色15 min，在反應孔內加入終止液50 μL/孔以終止反應，450 nm波長測量每孔吸光度，檢測IL-3、TNF-α、CAT、AOPP水平。

2.2.5? TGF-β/Smads通路蛋白及線粒體凋亡通路蛋白表達檢測? Western blot法檢測TGF-β/Smads通路蛋白Smad3、Smad2、TGF-β1及線粒體凋亡通路蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3相對表達量。提取50 μg蛋白，煮沸5 min使蛋白變性后用SDS-PAGE凝膠電泳，然后依據蛋白分子大小把凝膠切開并轉移至PVDF膜上，用Western blot封閉液把待測蛋白和內參蛋白封閉90 min在室內，按1∶1 000加到待測蛋白抗體，內參抗體以1∶2 000加入抗體，孵育過夜，使用Western blot洗滌液洗滌5次，10 min/次。按1∶5 000加入稀釋山羊抗兔IgG，孵育60 min室溫水平搖床，洗滌5次Western blot洗滌液，10 min/次。經過ECL顯色和曝光后，進行BIO-RAD成像，使用Image J圖像分析系統檢測條帶的灰度值，以內參條帶灰度值與蛋白比值為結果統計分析。

2.3? 統計學處理

采用SPSS 26.0統計軟件進行統計分析。計量資料用“x±s”表示，若資料滿足正態性及方差齊性，則用單因素方差分析，進一步采用LSD法對各組間有統計學意義的數據進行組間比較，反之則采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組大鼠肝組織病理學觀察

正常組大鼠肝組織細胞結構清晰，肝細胞索自中央靜脈向四周放射排列，排列緊密且大小均一;模型組大鼠肝組織細胞出現明顯結構損壞情況，伴有纖維結締組織增生、炎性細胞浸潤、細胞壞死現象，排列較為雜亂、疏松;益氣活血方組大鼠肝組織細胞結構損壞情況明顯緩解，纖維結締組織增生、炎性細胞浸潤、細胞壞死現象明顯減輕，細胞結構較為清晰，排列較為整齊。見圖1。

3.2? 各組大鼠肝臟、脾臟系數、肝纖維化程度評分比較

與正常組比較，模型組、益氣活血方組大鼠肝臟系數、脾臟系數較高（P<0.05）;與模型組比較，益氣活血方組大鼠肝臟系數、脾臟系數、肝纖維化程度評分較低（P<0.05）。見表1。

3.3? 各組大鼠肝功能、肝纖維化指標水平比較

與正常組比較，模型組、益氣活血方組大鼠AST、ALT、HA、PCⅢ、LN水平較高（P<0.05）;與模型組比較，益氣活血方組大鼠AST、ALT、HA、PCⅢ、LN水平較低（P<0.05）。見表2。

3.4? 各組大鼠炎癥反應、氧化應激指標水平比較

與正常組比較，模型組、益氣活血方組大鼠CAT水平較低，IL-3、TNF-α、AOPP水平較高（P<0.05）;與模型組比較，益氣活血方組大鼠CAT水平較高，IL-3、TNF-α、AOPP水平較低（P<0.05）。見表3。

3.5? 各組大鼠TGF-β/Smads通路蛋白表達比較

與正常組比較，模型組、益氣活血方組大鼠Smad3、Smad2、TGF-β1相對表達量較高（P<0.05）;與模型組比較，益氣活血方組大鼠Smad3、Smad2、TGF-β1相對表達量較低（P<0.05）。見表4、圖2。

3.6? 各組大鼠線粒體凋亡通路蛋白相對表達量比較

與正常組比較，模型組、益氣活血方組大鼠Bcl-2相對表達量較高，Bax、Caspase-3相對表達量較低，差異具有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，益氣活血方組大鼠Bcl-2相對表達量較低，Bax、Caspase-3相對表達量較高，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表5、圖3。

4 討論

肝纖維化是一種臨床較為常見的持續肝損傷的病理表現，在機體肝臟組織慢性損傷過程中持續存在，若得不到及時控制改善，肝纖維化可能會進一步發展惡化，因此，尋找一種安全有效的控制肝纖維化的手段具有重要意義[9]。臨床常用的治療肝纖維化的手段為西醫藥物治療，但是臨床療效并不理想。我國傳統中醫認為肝纖維化癥狀的主要發生機制為血瘀氣虛、肝脾同病，認為治療肝纖維化應以健脾、補肝、活血、益氣為原則[10]。益氣活血方由黃芪、丹參、茯苓、豆蔻、郁金組成，其中黃芪具有益氣、健脾的功效;丹參具有活血祛瘀的作用。

本研究中設計實驗，建立肝纖維化大鼠模型，并使用益氣活血方進行干預，結果顯示，使用益氣活血方進行干預的肝纖維化大鼠肝臟、脾臟系數、肝纖維化程度評分下降（P<0.05），說明益氣活血方干預有效緩解肝纖維化大鼠結締組織異常增生，減輕大鼠肝纖維化嚴重程度，從而發揮干預效果。

肝纖維化的發生發展與機體肝功能損傷密切相關，大量臨床研究表明，減輕肝纖維化嚴重程度，對患者肝功能恢復、預后改善具有重要意義[11-13]。楚振榮等[14]設計動物實驗，建立肝纖維化大鼠模型，檢測大鼠肝功能指標AST、ALT水平，并通過病理學觀察對大鼠肝纖維化程度進行評價，認為肝纖維化的發生發展與肝功能、肝纖維化指標水平變化密切相關。本文研究結果顯示，肝纖維化模型大鼠AST、ALT、HA、PCⅢ、LN水平異常升高，使用益氣活血方對肝纖維化模型大鼠進行干預，肝纖維化大鼠AST、ALT、HA、PCⅢ、LN水平下降（P<0.05），說明肝纖維化大鼠出現一定程度的肝功能損傷，使用益氣活血方進行干預后，肝纖維化大鼠纖維化指標HA、PCⅢ、LN水平受到調控，肝纖維化程度得到減輕，肝功能也得到一定程度的改善。

肝纖維化的發生發展伴隨著炎癥反應、氧化應激反應[15-16]。許瓊梅等[17]等設計動物實驗，建立肝纖維化大鼠模型，其研究結果認為肝纖維化的發生發展與肝組織氧化應激損傷、炎癥反應具有密切聯系。本文研究結果顯示，肝纖維化大鼠IL-3、TNF-α、CAT、AOPP水平出現明顯異常，使用益氣活血方對肝纖維化模型大鼠進行干預，肝纖維化大鼠IL-3、TNF-α、AOPP水平下降，CAT水平上升（P<0.05），說明使用益氣活血方進行干預能夠抑制炎癥因子釋放，減輕肝纖維化大鼠肝組織炎癥反應、氧化應激反應嚴重程度，從而起到肝臟保護作用，可能是因為益氣活血方中茯苓具有抗自由基、抑制脂質過氧化的作用。

TGF-β/Smads信號通路在機體組織纖維化發展過程中起到重要作用[18-19]。有研究表示，肝星狀細胞激活是肝纖維化發生發展的細胞學基礎，TGF-β/Smads信號通路在肝星狀細胞激活過程中起到關鍵作用。TGF-β1具有調節免疫的作用，其表達異常變化能夠誘導細胞分化，促進肝星狀細胞激活及細胞外基質形成，Smads蛋白為TGF-β的受體后蛋白，在肝纖維化發生發展過程中發揮重要作用。本文研究結果顯示，肝纖維化大鼠肝臟組織中Smad3、Smad2、TGF-β1呈現異常高表達，使用益氣活血方對肝纖維化模型大鼠進行干預，肝纖維化大鼠Smad3、Smad2、TGF-β1相對表達量明顯下調（P<0.05），說明使用益氣活血方干預能夠有效抑制TGF-β1表達，促進肝實質細胞再生，阻斷TGF-β受體Smad3、Smad2表達，抑制肝纖維化進程，從而起到肝臟保護作用。

肝臟組織細胞凋亡是慢性肝損傷、肝纖維化發展過程中的主要特征[20-21]。Bcl-2、Bax是線粒體細胞凋亡通路中的重要基因，二者表達的變化與細胞凋亡密切相關。Caspase-3作為Caspase家族重要成員，其表達變化與機體組織細胞凋亡能力變化密切相關。本文研究結果顯示，肝纖維化大鼠肝臟組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3表達出現明顯異常，使用益氣活血方對肝纖維化模型大鼠進行干預，Bcl-2表達下調，Bax、Caspase-3表達上調，說明使用益氣活血方進行干預能夠調控細胞線粒體凋亡通路蛋白表達，抑制肝臟組織細胞凋亡，從而起到抑制肝纖維化發展的作用。

綜上所述，使用益氣活血方對肝纖維化模型大鼠進行干預，改善大鼠肝功能，減輕肝纖維化程度及炎癥反應、氧化應激反應，其作用機制可能為益氣活血方干預能夠調控TGF-β/Smads通路及線粒體凋亡通路蛋白表達，從而起到肝臟保護作用，為肝纖維化的臨床治療提供新的研究方向。

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