紅豆樹葉總黃酮提取工藝優化及抗氧化性研究

全穎萱，黃冰冰，貝佳炎，鄭 威，李林海，倪 林，2*，徐會有**

（1.福建農林大學植物保護學院，福建福州350002；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建福州350002）

紅豆樹（Ormosia hosieiHemsl.&E.H.Wilson）為豆科紅豆屬的植物，是我國二級保護植物，主要分布在福建、廣東、廣西等?。?］，是珍稀藥用觀賞樹種。其根、莖、葉和種子均可入藥［2-3］，可用于治療跌打損傷、風濕性關節炎和血滯經閉等［4］，福建部分畬族聚居區常用紅豆樹枝葉煎湯代水飲防治心血管疾?。?］。1975 年，福建省把紅豆樹作為福建省主要珍貴鄉土樹種進行造林推廣，截止目前為止，紅豆樹在全省50 余個縣（市、區）、30 余個國有林場（采育場）、10 余個國有林業苗圃均有大面積種植［2］，資源比較豐富。

本課題組一直致力于紅豆樹植物資源藥用價值的開發與利用研究，前期從紅豆樹的根、莖、葉、種子中分離鑒定包括生物堿、黃酮、三萜、木脂素等多種成分［5-9］，并證實紅豆樹葉富含黃酮類成分且具有較好的抗氧化活性。

因此，在前期研究的基礎上，為更好地利用紅豆樹葉資源，本研究通過單因素試驗和響應面法優化超聲輔助提取紅豆樹葉總黃酮，并對提取物的抗氧化活性進行研究，為紅豆樹葉的深入研究和開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

紅豆樹葉（標本號20191003）于2020 年10 月采自在福建省福州市閩清縣美菰國有林場（118.5°E，26.2°N；海拔735 m）中隨機選取的多棵20 年生紅豆樹，經福建農林大學林學院鄒雙全教授鑒定為豆科紅豆屬植物紅豆樹（Ormosia hosieiHemsl. & E. H.Wilson）的葉子，并將紅豆樹葉標本保存于福建農林大學植物保護學院制藥工程系。標本采集后在陰涼處干燥，粉碎過20目篩備用。

1.2 試劑與儀器

槲皮素標準品（批號：B1920061，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；紫外可見分光光度儀（島津儀器有限公司）；CPA225D 型電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；分析純乙醇等（國藥化工有限公司；TQ-400Y 高速多功能粉碎機（永康市天祺盛世工貿有限公司）。

1.3 槲皮素標準曲線的繪制

參照文獻［10］的研究方法繪制了標準曲線，配制不同濃度的槲皮素標準液，以65%乙醇為原料進行標準曲線的空白對照，在波長為510 nm 處測得其吸光度A值。以不同的標準液濃度作為曲線的橫坐標（X），根據其所得出的吸光度A作為曲線的縱坐標（Y），繪制相應的標準曲線，所得的標準曲線的方程為：Y=13.655 4X－0.359 2 ，R2=0.999 9。

1.4 提取工藝

1.4.1 提取工藝的基本方法

精密稱取0.2 g 的紅豆樹葉粉末，按照所設定的液料比、乙醇濃度和超聲時間等3 個因素［11］進行超聲輔助提取，取該溶液的上層清液定容，用同一濃度定容至10 mL，搖勻靜置。取樣后加入顯色劑，通過紫外可見分光光度儀平行測定3組數據?？傸S酮提取率的計算公式為：

式中：E為總黃酮提取率（%）；c為根據標準曲線回歸方程求出的黃酮質量濃度（mL/g）；n為提取液的稀釋倍數；v為離心液定容的體積（mL）；m為樣品質量（g）。

1.4.2 液料比的影響

稱取0.2 g 紅豆樹葉粉末，固定乙醇濃度為50%，超聲時間為40 min，按照1.4.1的方法測定總黃酮的提取率，分別采用液料比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1及40∶1（mL/g）進行超聲輔助提取。

1.4.3 乙醇濃度的影響

稱取0.2 g 紅豆樹葉粉末，固定液料比為20∶1（mL/g），超聲時間為40min，按照1.4.1的方法測定總黃酮的提取率，分別采用乙醇濃度50%、60%、70%、80%及90%進行超聲輔助提取。

1.4.4 超聲時間的影響

稱取0.2 g 紅豆樹葉粉末，固定液料比為20∶1（mL/g），乙醇濃度為50%，按照1.4.1 的方法測定總黃酮的提取率，分別采取超聲時間20、40、60、80、90、120 min進行超聲輔助提取。

1.5 響應面優化提取工藝

設定3個單因素試驗，自變量分別為超聲時間、乙醇濃度和液料比。根據試驗研究結果得到最佳提取工藝條件為液料比20∶1（mL/g），超聲時間為90 min，乙醇濃度 70%。依據 Box-Benhnken［12］原理設計實驗因素與水平，采用Design Expert 8.0.6 軟件進行分析［13］，選擇乙醇濃度、液料比和超聲時間3個影響因素進一步考察，通過響應面法進一步優化超聲輔助提取紅豆樹葉總黃酮的工藝。

1.6 體外抗氧化試驗

1.6.1 DPPH自由基清除作用

對于總黃酮對DPPH 自由基的清除效果，采用不同濃度梯度的樣品溶液進行驗證。各取1 mL 樣品溶液和2 mL DPPH 溶液，兩種溶液搖勻混合后，靜置30 min；用無水乙醇進行吸光度調零，設定波長為517 nm，在此條件下所測量到的吸光度值為A1。再依次取1 mL 的無水乙醇和2 mL DPPH 溶液進行搖勻混合后，同樣靜置30 min；用無水乙醇進行吸光度調零，同樣設定波長為517 nm，在此條件下所測量到的吸光度值為A2。各取1 mL 的樣品溶液和2 mL 的蒸餾水醇混合均勻后，同樣靜置30 min；用無水乙醇進行吸光度調零，同樣設定波長為517 nm，在此條件下所測量到的吸光度值為A3；同時將維生素C（VC）作為抗氧化活性測定的陽性對照組。根據下列DPPH 清除率公式可以計算出總黃酮的清除效果［14-15］。

式中：A1為樣品溶液和DPPH 溶液；A2為無水乙醇和樣品溶液；A3為蒸餾水和DPPH溶液

1.6.2 ABTS自由基的清除作用

各取 5 mL ABTS 溶液（7 mmol/L）和 5 mL 過硫酸鉀溶液，按照1：1體積比充分混合均勻，黑暗靜置12 ~16 h 后留做 ABTS 工作液［16］。先取混合液，在734 nm 處測吸光度A，再加蒸餾水稀釋至在734 nm處A=0.7±0.002，即配制成ABTS工作液，應注意該溶液需現配現用。取2 mL 樣品溶液，隨后加入4 mL ABTS 工作液，使得總體積為6 mL?；靹蚝笤?7℃的溫度下反應6 min，以無水乙醇進行吸光度調零，設定波長為734 nm，在此條件下所測得吸光度值為A1。2 mL 的樣品溶液和4 mL 無水乙醇，混勻后在37℃的溫度下反應6 min，以無水乙醇進行吸光度調零，同樣波長設定為734 nm，在此條件下測得吸光度值為A2。再取2 mL 蒸餾水，加入ABTS 自由基工作液4 mL，混勻后在37℃的溫度下反應6 min，以無水乙醇進行吸光度調零，同樣設定波長為734 nm，在此條件下所測得吸光度值為A3。

式中：A1為樣品溶液和ABTS 自由基工作液；A2為無水乙醇和樣品溶液；A3為蒸餾水和ABTS 自由基工作液

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比的影響

其他條件固定為：超聲時間40 min、乙醇濃度50%。分別采用液料比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1 及40∶1（mL/g）進行超聲輔助提取，測定總黃酮的提取率。由圖1（a）可知，剛開始總黃酮提取率隨著液料比的增大而有所增加，但幅度相對較??；液料比為20∶1（mL/g）時，總黃酮提取率達到最大值為15.93%；液料比繼續增大，總黃酮提取率則顯著降低。推測由于乙醇溶液用量逐步增加，使得物料和溶劑的接觸面積增大，黃酮類物質的溶出量變大，總黃酮提取率提高；但當乙醇溶液用量不斷增加，物料將被溶劑充分包裹，再繼續增大乙醇溶液用量達到一定限額時，可能會造成其他雜質溶出，最終導致總黃酮提取率下降［17］。同時溶劑用量越大提取成本也越高。綜合提取效果與提取成本，故確定最佳液料比為 20∶1（mL/g）。

2.1.2 乙醇濃度的影響

其他條件固定為：超聲時間40 min、液料比20∶1（mL/g）。分別采用乙醇濃度50%、60%、70%、80%及90%進行超聲輔助提取，測定總黃酮的提取率。如圖1（b）所示，乙醇濃度為70%時，總黃酮提取率達到峰值為19.49%。濃度小于70%時，增大乙醇濃度，總黃酮提取率隨之升高；濃度大于70%時，增大乙醇濃度，總黃酮提取率逐漸降低。推測由于乙醇濃度的增大，使得溶劑的滲透能力增強，黃酮類物質的溶出量變大，總黃酮提取率提高；但提取液中脂溶性雜質的含量也隨著乙醇濃度的不斷增大而增加，最終致使總黃酮提取率下降［18］，故確定乙醇最佳濃度為70%。

2.1.3 超聲時間的影響

其他條件固定為：液料比20∶1（mL/g）、乙醇濃度 50%。分別采用超聲時間 20、40、60、80、90 及120 min 進行超聲輔助提取，測定總黃酮的提取率。由圖1（c）結果可知，增大超聲時間，總黃酮提取率先降低隨后逐漸增大，當超聲時間為90 min 時，總黃酮提取率達到最大值為22.62%，之后又降低。推測由于黃酮類物質的化學結構因超聲時間過長而被破壞，使得總黃酮提取率下降［19］，故確定最佳超聲時間為90 min。

圖1 不同條件對紅豆樹總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of different conditions on extraction of total flavonoids from the leaves of Ormosia hosiei

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面分析

根據Box-Benhnken 中心組合設計的基本原理［20-21］，以 2.1 單因素試驗結果為根據，選擇 3 個影響因素設計響應面試驗，試驗設計方案及結果如表1 所示，并利用Design Expert 8.0.6 軟件進行二次多項式回歸擬合結果分析，建立總黃酮提取率對液料比（A）、乙醇濃度（B）和超聲時間（C）的二次多元回歸模型：

表1 響應面設計方案與結果Table 1 The program and experimental results of response sur?facemethodology

對上述模型進行方差分析，結果見表2。由表2 可知，模型F回歸值=61.57 ，P＜1.00×10-4，說明該回歸模型極顯著，即各因素液料比、乙醇濃度和超聲時間之間的線性關系極顯著，實驗模型是可行的，具有顯著性。其中，一次項A極顯著（P= 3.00×10-4<0.01），B極顯著（P= 1.9×10-3<0.01），C顯著（P=4.59×10-2<0.05），說明影響總黃酮提取率的因素依次為液料比、乙醇濃度、超聲時間；二次項A2極顯著（P<1.00×10-4即<0.01），B2極顯著（P=1.00×10-4<0.01），C2極顯著（P<1.00×10-4即<0.01）；交互項AB交互作用不顯著（P=3.57×10-1>0.05），AC交互作用顯著（P=4.15×10-2<0.05），BC交互作用極顯著（P= 1.3×10-3<0.01）?？偠灾?，3 個影響因子對總黃酮提取率的影響較為復雜，不是簡單的線性關系，曲面效應顯著［22］。模型失擬項顯著（F失擬值=11.63 ，P=1.91×10-2＜0.05），需要進一步進行驗證性試驗。

表2 回歸方程方差分析表Table 2 Variance analysis of mathematical regression model

2.2.2 兩因素間的交互影響

液料比與乙醇濃度、液料比與超聲時間、乙醇濃度與超聲時間之間交互作用的三維空間響應面圖和二維等高線圖如圖2 所示。曲線趨勢表明對總黃酮提取率的影響，即曲線趨勢越平滑，表示對總黃酮提取率的影響越??；曲線趨勢越陡，表示對總黃酮的提取率影響越大［23］。由圖2可知，乙醇濃度與液料比的曲線趨勢較平緩，且等高線圖呈類圓形結構，表明乙醇濃度與液料比的交互作用不顯著，對總黃酮提取率的影響較??；液料比與超聲時間和乙醇濃度與超聲時間的曲線趨勢較陡，且等高線圖呈較明顯橢圓形，表明其交互作用顯著，對總黃酮提取率的影響較大。

圖2 兩因素交互作用對紅豆樹葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of interaction between two factors on extraction of totalflavonoids from the leaves of Ormosia hosiei

2.2.3 驗證試驗

根據試驗條件，經軟件分析得最優工藝條件為：液料比20.15∶1（mL/g），乙醇濃度69.45%，超聲時間90.17 min。在該條件下，總黃酮提取率可達23.85%。結合實際應用，各工藝條件可調整為液料比20∶1（mL/g），乙醇濃度70%，超聲時間90 min，此時總黃酮提取率為23.87%，兩者的相對標準偏差（RSD）為0.06%，與理論值接近，表明采用響應面法所建立的回歸模型與真實試驗結果的擬合程度較高，優化的工藝條件準確可靠。

2.3 抗氧化活性試驗

2.3.1 清除DPPH自由基活性

圖3（a）反映的是DPPH 自由基在不同濃度的紅豆樹葉總黃酮提取液及陽性對照組VC中的清除率。由圖3（a）可知，紅豆樹葉總黃酮提取液和VC均有清除DPPH 自由基的效果。在其他條件均相同的情況下，隨著紅豆樹葉總黃酮提取液濃度的不斷增大，DPPH 自由基清除率也逐漸增大，兩者之間呈現線性關系且為正相關。當紅豆樹葉總黃酮提取液濃度為1.5 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率達到最大值為87.70%。從整體上看，紅豆樹葉總黃酮對DPPH自由基的清除能力要小于VC。

2.3.2 清除ABTS自由基活性

圖3（b）反映的是ABTS 自由基在不同濃度的紅豆樹葉總黃酮提取液及陽性對照組VC中的清除率。由圖3（b）可知，紅豆樹葉總黃酮提取液及VC均有清除ABTS 自由基的效果。紅豆樹葉總黃酮提取液濃度在達到0.075 mg/mL 前，隨著提取液濃度的增大，ABTS 自由基清除率的增加幅度由大變??；總黃酮提取液濃度達到0.075 mg/mL 后清除率增幅又增大；在濃度為0.125 mg/mL 時，ABTS 自由基清除率達到最大值為99.26%。從總體上看，在其他條件均相同的情況下，隨著紅豆樹葉總黃酮提取液濃度的增大，ABTS 自由基清除率也逐漸增大，兩者之間呈現線性關系且為正相關；而陽性對照組VC溶液在相同濃度范圍內，ABTS 自由基清除率接近100%，表明 VC對 ABTS 自由基的清除效果更好［24］。

圖3 紅豆樹葉總黃酮對不同自由基清除率的影響Fig.3 Effects on Different free radical scavenging rates of totalflavonoids from the leaves of Ormosia hosiei

3 結論

首次采用超聲輔助法，以單因素試驗為依據，進行響應面設計實驗及數據分析，克服了各因素之間的交互作用，彌補了交互效應和其他混合效應的缺陷。該工藝中的總黃酮提取率可達23.85%，且優化后的提取工藝穩定可行，為紅豆樹資源利用及開發奠定基礎。

首次發現紅豆樹葉總黃酮對DPPH 自由基和ABTS自由基有較好的清除能力，清除率最高分別可達87.70%及99.26%，其抗氧化能力與陽性對照Vc相當，這為紅豆樹葉的資源利用和開發提供新思路。