乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力及多位點序列分型分析

王晗晟，阮紅日，付琳清，劉 夢，靳育琦，葛延松，宋 軍

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶163316）

奶牛乳房炎（bovine mastitis）是奶牛最常見的疾病之一，會引起棄奶、奶制品質量下降及患病牛淘汰等[1-2]。引起奶牛乳房炎的病因復雜，其中金黃色葡萄球菌是引起接觸傳染型奶牛乳房炎的主要病因之一。金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有傳染性強、治愈率低、復發率高的特點。同時，抗生素的濫用導致金黃色葡萄球菌的耐藥性愈來愈強，嚴重阻礙我國奶牛養殖業的健康發展[3]。

細菌生物被膜是細菌及其自生分泌的胞外聚合物組成的細菌聚集膜樣物。形成生物被膜的細菌具有較高的代謝能力，隱蔽在生物被膜的細菌難以被抗生素清除，生物被膜對抗生素的抗性問題日趨嚴重[4-6]。生物被膜的形成受多種因子的調控。Ica操作子（icaADBC）編碼的細胞間多糖黏附素在生物被膜的形成過程中起決定性的作用[7]。Ica操作子主要由IcaA、IcaB、IcaC和IcaD組成，能夠誘導葡糖胺轉移酶的合成，從而促進生物被膜的黏附過程。Ica的表達又受到IcaR、σ因子sigB的調控。此外，Eno、Atl、aap、Bap等基因對于生物被膜形成過程中的初始黏附有著重要的影響[8-9]。近年來，金黃色葡萄球菌的耐藥菌株不斷出現，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA）[10]。MRSA是一種具有多重耐藥性、流行性強、病死率高的病原菌。目前，分子分型已被證明是研究MRSA流行病學的重要工具?，F已開發出多種技術來分型MRSA分離株，包括脈沖場凝膠電泳（PFGE）、金黃色葡萄球菌染色體mec盒（SCCmec）、A蛋白（spa）分型和多位點序列分型（MLST），均具有較高的鑒別能力[11]。本試驗通過分析乳源金黃色葡萄球菌的生物被膜形成能力、被膜相關基因和MLST，為控制乳源金黃色葡萄球菌感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

55株臨床分離的金黃色葡萄球菌由黑龍江八一農墾大學牛病防制重點實驗室提供。菌株經鑒定后，由本實驗室保存。S.aureusATCC 43300購自美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC），實驗室保存。

1.1.2 試劑及材料

試劑：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、胰蛋白胨大豆培養基、瓊脂粉、結晶紫、PBS緩沖液、2×Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL-2000、瓊脂糖、50×TAE緩沖液。

儀器：超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）、電熱恒溫振蕩器（上海森信實驗儀器有限公司）、臺式室溫離心機（德國Eppendorf公司）、分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（松下健康醫療器械（上海）有限公司）、PCR擴增儀（美國BIO-RAD）、電泳儀（美國BIO-RAD）、凝膠成像系統（美國BIO-RAD）、電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株復蘇

將-80℃冰箱中保存的金黃色葡萄球菌接種至LB固體培養基，于37℃過夜培養。次日，挑取LB固體培養基上一個形態較好的菌落，接種于1 mL液體LB培養基中，37℃、180 r/min振蕩培養8～10 h，4℃儲存備用。

1.2.2 結晶紫半定量法測定乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力

將1.2.1中復蘇的55個臨床分離株再次轉接到2 mL TSB培養基中，37℃振蕩培養6～8 h至對數生長期，并調整菌液濃度至OD600nm為0.5（細菌濃度約為109CFU/mL）。取96孔細胞培養板，每孔加入180μL液體TSB培養基和20μL對數生長期的菌液，每個菌株重復3孔。每一培養板中同時設標準菌株組和空白對照組（只含培養液）各3孔。將加過樣品的96孔板于37℃靜置培養48 h。棄去培養基，每孔用200μL無菌PBS洗3次。每孔加入95%的甲醇溶液200μL，固定30 min。棄去固定液，每孔用PBS沖洗3次，自然風干。每孔加入250μL 1%的結晶紫染色液，室溫靜置30 min。棄去染色液，用流水沖洗每孔3～5次，徹底洗去未結合的染色液，放入烘箱烘干。每孔加入33%的乙酸溶液250μL，搖床上振蕩15 min，充分釋放生物被膜中結合的染色液，最后用酶標儀測定600 nm波長的OD值。

判斷方法：以空白對照孔所測得OD600nm的兩倍作為臨界點ODc。當ODc＞OD時，判斷細菌無生物被膜形成能力（-）；當ODc≤OD≤2×ODc時，判定細菌生物被膜形成能力較弱（+）；當OD＞2×ODc時，判定細菌形成生物被膜的能力較強（++）。

1.2.3 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關基因的分布情況

將1.2.1中復蘇的55株金黃色葡萄球菌和標準菌株轉接到2 mL LB液體培養基中，37℃振蕩8～10 h。按照細菌DNA提取試劑盒說明書步驟提取細菌DNA。以ATCC 43300作為標準菌株，根據GenBank上的DNA序列設計IcaA、IcaD、IcaR、Eno和Bap等生物被膜形成相關基因，由北京擎科生物科技有限公司合成，引物信息見表1。使用提取好的細菌DNA作為模板，根據近岸蛋白質科技有限公司2×Taq DNA聚合酶說明書設計PCR反應體系和反應程序，反應體系（總體積20μL）：2×Taq DNA聚合酶10μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH2O 7μL。PCR反應程序：94℃預變性90 s，94℃變性30 s，退火（溫度根據引物設定）30 s，72℃延伸30～60 s，以上3個步驟循環30次，最后72℃延伸5 min，4℃保存，以ATCC 43300作為陽性對照。取PCR產物5μL進行瓊脂糖凝膠電泳，之后放于凝膠成像系統成像。

表1 生物被膜形成相關基因引物Tab.1 Biofilm formation-related gene primer

1.2.4 乳源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌多位點序列（MLST）分型

將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因（mecA）引物mecA F：5'GTGAAGATATACCAAGTGATT3'和mecA R：5'ATGCGCTATAGATTGAAAGGAT3'送至北京擎科生物科技有限公司合成，利用PCR擴增mecA基因，PCR體系同1.2.3所用反應體系。PCR反應程序：94℃預變性90 s，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，以上3個步驟循環30次，最后72℃延伸5 min，4℃保存，以ATCC 43300作為陽性對照。

取PCR產物5μL進行瓊脂糖凝膠電泳，之后放于凝膠成像系統成像，如果為陽性則表示該細菌屬于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。

根據MLST數據庫中金黃色葡萄球菌數據庫（https://pubmlst.org/saureus/）提及的管家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL）對本試驗分離的MRSA進行檢測。相關引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。金黃色葡萄球菌管家基因引物信息見表2。使用之前提取好的細菌DNA作為模板，使用近岸蛋白質科技有限公司2×Taq DNA聚合酶，PCR體系同1.2.3所用反應體系。反應程序94℃預變性90 s，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30～60 s，以上3個步驟循環35次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。以ATCC 43300作為陽性對照。

表2 金黃色葡萄球菌管家基因引物Tab.2 Primer sequences of MLST PCR

取PCR產物3～5μL進行瓊脂糖凝膠電泳，放于凝膠成像系統成像，觀察目的條帶。將PCR產物送至北京擎科生物科技有限公司測序。將測序后的結果使用DNASTAR進行拼接，上傳至金黃色葡萄球菌多位點分型數據庫中比對，即得到相應的基因型和序列型（STs）。

2 結果與分析

2.1 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力（見表3）

由表3可知，55株金黃色葡萄球菌中34株生物被膜形成能力較強，17株生物被膜形成能力較弱，4株無生物被膜形成能力。

表3 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力Tab.3 Formation ability of milk-derived Staphylococcus aureus biofilm

2.2 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關基因的分布情況（見表4）

由表4可知，Eno和Alt檢出率分別為89%和60%，表明乳源金黃色葡萄球菌具有較強的黏附能力。IcaA、IcaD和IcaR基因的檢出率分別為44%、36%和27%，表明大多數生物被膜的形成都由ica系統參與調節。sigB基因的檢出率為25%，Bap的檢出率為18%，aap檢出率為42%。統計結果發現，生物被膜形成能力強的菌株都攜帶多個生物被膜形成相關基因，說明生物被膜的形成過程可能是受多個基因共同調節。

表4 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關基因分布情況Tab.4 Results of detection of genes related to the formation of milk-derived S.aureus biofilm

2.3 乳源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌多位點序列（MLST）分型（見圖1、表5）

圖1 部分金黃色葡萄球菌MILS分型PCR結果Fig.1 Part of S.aureus MILS typing PCR results

由圖1可知，通過PCR擴增mecA基因，發現55株臨床分離金黃色葡萄球菌中有17株為MRSA。

由表5可知，對這17株MRSA進行MLST分型，結果顯示，17株金黃色葡萄球菌分為9個不同ST，但均屬于已發現的ST型，其中ST97型5株，ST398型4株，ST239型2株，ST1、ST5、ST9、ST2157、ST5796和ST5817型各1株。本試驗對這9個ST型進行了聚類分析，發現9個ST共聚類為5種克隆復合群，包括CC1、CC5、CC8、CC97和CC398。

表5 金黃色葡萄球菌的MLST分型Tab.5 MLST typing of S.aureus

3 討論

結晶紫可對細菌細胞以及生物被膜基質中的一些成分進行染色，非常適合量化生物被膜，因此常被用于測定各種細菌生物被膜形成能力。本研究中，34株（62%）生物被膜能力較強，17株（31%）生物被膜形成能力較弱，4株（7%）無生物被膜形成能力，說明乳源金黃色葡萄球菌普遍具有較強的生物被膜形成能力。Ica操縱子主要包括IcaA、IcaD和IcaBC，可以調控胞間多糖黏附素（PIA）的表達，能夠促進生物被膜的形成，而IcaR能夠抑制ica系統的表達，起到調控生物被膜生長的作用[12]。本試驗中，IcaA、IcaD和IcaR基因的檢出率分別為44%、36%和27%，表明大部分金黃色葡萄球菌都具有ica操縱子。本試驗中，Eno、Atl、aap和Bap的檢出率分別為89%、60%、42%和18%，表明乳源金黃色葡萄球菌具有較強的黏附能力。本研究中，生物被膜形成能力較強的菌株都攜帶多個生物被膜相關基因，但也有生物被膜形成能力較弱的菌株攜帶多個基因的現象，說明生物被膜的形成是個復雜生物過程。這些基因在形成過程中可能發揮一定的作用，但也會受其他因素的影響，如細菌密度、環境脅迫等[13]。

由于臨床乳房炎致病菌的耐藥性問題愈發嚴重，本研究檢測乳源金黃色葡萄球菌攜帶mecA基因的情況，發現55株細菌中有17株（31%）攜帶該耐藥基因，說明乳源致病菌的耐藥性已十分嚴重。對這部分MRSA進行MLST分型，17株金黃色葡萄球菌分為9個ST型，但都屬于已發現的ST型，其中ST97和ST398為優勢株，與王登峰[14]調查牛源金黃色葡萄球菌優勢流行菌株結果相似，表明引起奶牛乳房炎的細菌型別相對較集中。但是，也有研究顯示，不同地區養殖場的金黃色葡萄球菌ST分型存在較大區別，可能是致病菌在某一區域擴散，從而使其在這一區域流行[15-16]。已有文獻報道，ST398型金黃色葡萄球菌可以在人和動物之間傳播[17]。本研究中，ST398也為優勢菌株，說明在本地區乳源金黃色葡萄球菌可能會引起人畜共同感染。

4 結論

本試驗通過對55株乳源金黃色葡萄球菌被膜形成能力及多位點序列分型分析，發現本地區的乳源金黃色葡萄球菌普遍具有較強的生物被膜形成能力，并且分型主要集中在ST97和ST398。