小肽對凡納濱對蝦生長、抗氧化能力、非特異性免疫及腸道菌群結構的影響

吳遠彩，李日美，申光榮，黃 放，楊奇慧，譚北平，遲淑艷

（1.廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；2.深圳市裕農科技股份有限公司，廣東 深圳 518110）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）對鹽度和溫度的適應范圍較廣，其蝦肉品質好，生長迅速，是我國乃至世界上養殖產量最高的對蝦之一[1-2]。小肽（Small peptide）是蛋白質分解時的產物，是由2～ 4 個氨基酸構成的一種高活性肽。研究發現人類組織可完整地利用小肽而直接參與蛋白質合成[3]。小肽與氨基酸的吸收是兩個獨立的系統，且小肽的吸收比氨基酸快，避免了兩者的吸收競爭，進而影響蛋白質的代謝[4]。小肽可與礦物質和金屬離子等物質結合，形成小肽螯合物[5-6]，推動礦物質和金屬離子在機體內的吸收和沉積[7]。此外，小肽還有保護腸道健康和促進腸道發育的功能。飼料中添加適量小肽有利于提高水產動物生長，改善飼料效率，增強抗逆能力，從而提高成活率[8-9]。飼料中添加小肽可有效提升星斑川鰈（Platichthys stellatus）幼魚的生長性能[10]。適量大豆小肽蛋白替代魚粉對黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）的生長指標、酶活和抗氧化能力無不良影響[11]。添加小肽可有效提升凡納濱對蝦的生長和抗病能力[12-13]。但不同小肽產品，促生長效果可能不盡相同。本研究分析飼料中添加小肽后，凡納濱對蝦幼蝦生長性能、抗氧化能力、非特異性免疫、腸道菌群組成，評估小肽在對蝦飼料中的應用效果與適宜添加水平，為凡納濱對蝦飼料中小肽應用研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

小肽購自深圳裕農生物技術有限公司，是酶解豆粕蛋白，分子質量范圍見表1。在基礎飼料中分別添加0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%小肽（分別記為L0、L1、L2、L3、L4 和L5 組），配制成6 種飼料（表2）。全部飼料原料均過孔徑180 μm的篩，用模具粒徑為1.0 mm 和1.5 mm 的制粒機制成顆粒飼料，陰涼處風干，于-20 ℃冰箱保存待用。

表1 小肽分子質量分布Table 1 Molecular mass of small peptides

表2 基礎飼料組成及營養水平（干物質基礎）Table 2 Composition and nutrient levels of basal diets(DM basis)

1.2 試驗動物與養殖管理

凡納濱對蝦幼蝦由廣東海興農集團有限公司提供，購進后暫養30 d，蝦苗養殖全程使用購置的商品飼料。挑選體質量為（0.47±0.01）g 的幼蝦960 尾，在0.3 m3的玻璃纖維桶中飼養8 周。設6個處理組，4 個重復組。實驗前3 周每日按照幼蝦初始體質量的8%～ 10%，以3∶2∶2∶3 的比例分別在7:30、12:00、16:30、21:00 投料，隔天換水1/3～ 1/2。后5 周根據蝦體大小和水質調整投食量，每天換水1/3～ 2/3。養殖期間pH 為7.8～ 8.2，水溫在28.4～ 31.2 ℃，氨氮質量濃度小于0.03 mg·L-1，連續充氣，溶解氧大于6.7 mg·L-1，海水鹽度26～ 28。

1.3 樣品采集

養殖試驗結束時，對蝦饑餓處理24 h，統計數量和質量。隨機取對蝦10 尾，圍心腔抽血，離心，取上清，保存在-80 ℃，用于血清抗氧化和非特異性免疫的檢測；活蝦置于冰上剖取全腸，分別于凍存管中，保存在-80 ℃超低溫冰箱，用于腸道菌群分析。每個重復組隨機取蝦5 尾，保存于-20 ℃冰箱，用于全蝦體成分分析。

1.4 指標測定

1.4.1生長性能指標 主要為增重率（Weight gain rate，WGR）、飼料系數（Feed conversion rate，FCR）、特定生長率（Special growth rate，SGR）、成活率（Survival rate，SR）、蛋白質效率（Protein efficiency ratio，PER）。

增重率（%）=（mt－m0）/m0，

飼料系數=攝食量干質量/（mt－m0），

特定生長率=（lnmt－lnm0）/t，

成活率（%）=終末數量/ 初始數量，

蛋白質效率=（mt－m0）/ 蛋白質攝入量。

式中，mt為終末均體質量（g）；m0為初始均體質量（g）；t為試驗持續時間（d）。

1.4.2飼料常規及全蝦體成分分析 飼料和全蝦常規分析參照AOAC（1995）[14]的方法。于105 ℃恒溫烘箱中烘干，測定飼料及全蝦樣品水分含量；粗蛋白質含量用凱氏定氮法測定（KjeltecTM8400，Sweden）；用索氏抽提法（石油醚作為提取溶劑）測定粗脂肪含量；粗灰分含量使用550 ℃馬弗爐灰化法測定。

1.4.3血清中非特異性免疫指標和抗氧化酶活的測定 血清中溶菌酶 (LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)、總蛋白（TP）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、總抗氧化（T-AOC）、丙二醛（MDA）、酚氧化物酶（PO）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力分別用南京建成生物研究所相應的試劑盒測定，按照試劑盒說明書進行。

1.4.4凡納濱幼蝦腸道菌群的測序分析 腸道微生物菌群結構由蘇州金唯智生物科技有限公司進行16S rDNA 測序分析。使用Magen Hipure Soil DNA Kit（Qiagen,Germany）試劑盒提取基因組DNA，用檢測合格的PCR 引物擴增原核生物16S rRNA 基因上包括V3 和V4 兩個高度可變區，采用包含“CCTACGGRR BGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物擴增V3 和V4 區。PCR 產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。構建 Meta Vx?文庫，使用Illumina MiSeq 測序，通過對讀數（Reads）拼接過濾、聚類，并進行對蝦腸道微生物有效操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）統計，分析物種多樣性及腸道菌群結構，探討飼料中添加小肽對凡納濱對蝦腸道菌群的影響。

1.5 數據處理

試驗數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示，數據分析采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析，用Duncan’s 進行多重比較，存活率數據則先進行反正弦平方根轉換再進行統計分析，設α=0.05。

2 結果

2.1 小肽對凡納濱對蝦幼蝦生長性能的影響

由表3 可知，與L0 組相比，飼喂不同水平的小肽飼料對凡納濱對蝦幼蝦的成活率、特定生長率、蛋白質效率均無顯著影響（P＞ 0.05）；L1、L4 和L5 組幼蝦增重率顯著高于L0 組（P＜ 0.05）；L1 組飼料系數顯著低于L0 組（P＜ 0.05），其余各組與L0 組無顯著差異（P＞ 0.05）。

表3 小肽對凡納濱對蝦幼蝦生長性能的影響Table 3 Effects of small peptides on growth performance of juvenile Litopenaeus vannamei

2.2 小肽對凡納濱對蝦幼蝦體成分的影響

由表4 可知，小肽對凡納濱對蝦幼蝦粗脂肪含量、水分含量無顯著影響（P＞ 0.05）；小肽組幼蝦粗蛋白含量顯著高于L0 組（P＜ 0.05）；L3 組與L0 組幼蝦粗灰分含量差異無統計學意義（P＞0.05），均顯著高于其余小肽組（P＜ 0.05）。

表4 小肽對凡納濱對蝦幼蝦體成分的影響Table 4 Effects of small peptides on body composition of juvenile Litopenaeus vannamei %

2.3 小肽對凡納濱對蝦幼蝦血清非特異性免疫指標的影響

由表5 可知，小肽組幼蝦血清總蛋白（TP）含量、酚氧化物酶（PO）和酸性磷酸酶（ACP）活力顯著高于L0 組（P＜ 0.05）；L0 組的堿性磷酸酶（AKP）活力與L5 組無顯著差異（P＞ 0.05），顯著低于其余小肽組（P＜ 0.05）。

表5 小肽對凡納濱對蝦幼蝦血清生化指標的影響Table 5 Effects of small peptides on serum biochemical indexes of juvenile Litopenaeus vannamei

2.4 小肽對凡納濱對蝦幼蝦血清抗氧化指標的影響

由表6 可知，小肽組幼蝦超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力和總抗氧化（T-AOC）均顯著高于L0 組（P＜ 0.05）；小肽組幼蝦丙二醛（MDA）含量顯著低于L0 組（P＜ 0.05）。

表6 小肽對凡納濱對蝦幼蝦血清抗氧化能力的影響Table 6 Effects of small peptides on serum antioxidant activity of juvenile Litopenaeus vannamei

2.5 小肽對凡納濱對蝦腸道微生物OTUs 數的影響

由表7 可知，經過拼接、質量控制后每個樣品平均產生153 392 條讀數，質量值大于等于30 的堿基數均超過總堿基數的90%，測序結果準確；各樣品覆蓋指數均在0.998 以上，滿足測序質量要求。

表7 凡納濱對蝦腸道測序序列數據量及測序質量Table 7 Data quantity and sequencing quality of intestinal sequences of Litopenaeus vannamei

由圖1 可知，飼料中添加不同水平小肽對凡納濱對蝦全腸OTUs 數目無顯著影響（P ＞0.05）。全腸OTUs 數目最高值出現在L4 組。

圖1 小肽對凡納濱對蝦幼蝦全腸OTUs 數目的影響Fig.1 Effects of small peptides on the number of OTUs in whole intestine of juvenile Litopenaeus vannamei

2.6 凡納濱對蝦腸道微生物α 多樣性指數統計

如表8 可知，凡納濱對蝦全腸Ace、Chao1、Shannon、Simpson 指數均無顯著差異（P＞0.05）。

表8 小肽對凡納濱對蝦全腸α 多樣性指數的影響Table 8 Effects of small peptides on α diversity index in whole intestine of Litopenaeus vannamei

2.7 凡納濱對蝦幼蝦全腸菌群組成

如圖2(a)所示，在門水平上，豐度較高的主要有變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、軟壁菌門（Tenericutes）和厚壁菌門（Firmicutes）等。L0 組和L2 組的腸道細菌群落組成類似，兩個組別的優勢菌群的豐度相對一致。各組間相比，L0 組幼蝦腸道中變形菌門、厚壁菌門相對豐度最高，L3 組幼蝦腸道中擬桿菌門相對豐度最低，軟壁菌門豐度最高。

圖2(b)表明，在綱水平上，主要優勢菌有擬桿菌綱（Bacteroidia）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、柔膜菌綱（Mollicutes）和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）。與L0 組相比，小肽組腸道中α-變形菌綱豐度增加，γ-變形菌綱豐度減少，并在L1 組最低。與其他處理組相比，L3 組腸道擬桿菌綱豐度降低，柔膜菌綱豐度增加。

圖2(c)表明，在屬水平上，除部分無法鑒別的菌屬（Unclassified）外，魯杰氏菌（Ruegeria）、Motilimonas菌、弧菌 (Vibrio)、Hopperia為優勢菌屬。

圖2 凡納濱對蝦腸道細菌種群門(a)、綱(b)、屬(c)水平分布Fig.2 Distribution of bacterial population in gut of Litopenaeus vannamei at taxonomic level of phylum(a),class(b) and genus(c)

由圖3 可知，L1 組弧菌豐度顯著降低（P＜0.05），其余各組間無顯著差異。

圖3 凡納濱對蝦腸道中弧菌屬豐度組間差異Fig.3 Differences between groups in the abundance of Vibrio spp.in gut of Litopenaeus vannamei

3 討論

3.1 小肽對凡納濱對蝦生長性能的影響

傳統的蛋白質消化、吸收理論認為，蛋白質在腸道內，在胰蛋白酶和糜蛋白酶作用下生成游離氨基酸和小肽，小肽在肽酶的作用下被完全水解成游離氨基酸，并以游離氨基酸形式進入血液循環[15]。多種生物活性小肽（磷酸肽、阿片肽、內啡肽、促泌肽等）可在消化過程中釋放出來，促進消化道的蠕動，改善消化機能，促進動物生長[16]。本研究中，小肽添加組增重率均高于對照組，且L1 組最大，表明在凡納濱對蝦飼料中添加小肽可提高其生長性能。在星斑川鰈幼魚（Platichthys stellatus）[10]、牙鲆幼魚（Paralichthys olivaceus）[17]、雙棘原黃姑魚（Nibea diacanthus）[18]、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[19]研究中也得出類似的結果。

3.2 小肽對凡納濱對蝦體成分的影響

研究表明，在飼料中添加適量小肽對水產動物體內蛋白質的合成有促進作用[11,20]，血液循環中的小肽可直接參與組織蛋白質的合成[21]。本研究中，添加小肽組全蝦粗蛋白均顯著高于對照組，表明飼料中添加小肽可提高凡納濱對蝦的蛋白質合成。此外，各小肽添加組全蝦水分和粗脂肪與對照組無顯著差異，而各添加小肽組粗灰分均低于對照組，可能是因為酪蛋白磷酸肽 (CPP) 在動物小腸內可與鈣結合而阻止磷酸鈣沉淀的形成，從而導致全蝦粗灰分減少[15]。在星斑川鰈幼魚[10]的研究中也發現，隨著飼料中小肽添加水平的上升，全魚的粗灰分出現下降趨勢，與本研究一致。

3.3 小肽對凡納濱對蝦血清生化與非特異性免疫的影響

血液指標是評價動物機能狀態的重要指標之一。血清中TP 除與機體合成蛋白質的能力有關，還與血液的代謝運輸，維持滲透壓等息息相關[22]，是機體非特異性免疫中極其重要的一部分[23]。本研究中，與L0 組相比，小肽組幼蝦血清總蛋白含量顯著提高，隨小肽添加量的增加，總蛋白含量呈先升后降的變化趨勢，L3 組最高，這與全蝦粗蛋白趨勢相似，兩者成正相關的關系。說明一定量的小肽提高了凡納濱對蝦體內蛋白質沉積以及對蝦的免疫能力。AKP 是溶酶體的重要組成部分，可促進磷酸物質的水解和轉運，在對蝦機體免疫反應中發揮重要作用[24-25]，此外，AKP 與骨骼[26-27]和性腺[28]的發育有關。酸性條件下，ACP 對磷酸單酯進行催化水解，生成無機磷酸，同時也對機體能量平衡和信號轉導等有重要作用[29-30]。本研究中，小肽組幼蝦血清ACP 活力顯著高于L0 組，而血清中AKP活力L0 和L5 組之間沒有顯著差異，顯著低于其余各組，總體呈現先升高后降低的趨勢。表明添加一定量的小肽可增強對蝦的酸、堿性磷酸酶活力，這反映對蝦機體對外源性物質污染防御強度，體液、細胞免疫綜合能力的提高。劉文斌等[31]在研究酶解豆粕對異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）的免疫酶活力時發現，添加適量小肽可有效提高AKP 與ACP 酶的活力，與本研究一致，可能是因為小肽在魚、蝦血清中酸、堿性磷酸酶的調節機制有相似性。

PO 是一種氧化酚類物質的酶，其誘導產生的黑色素及中間代謝產物可殺死入侵蝦體的微生物和寄生蟲，機體缺乏抗氧化酶會導致機體代謝紊亂和阻礙信號傳導，嚴重時還會導致機體死亡[32-33]。陳永康等[34]用富含小肽的酵母水解物飼料飼喂低溫脅迫條件下的凡納濱對蝦，有助于提高其血清中的PO 活力，增強機體的抵抗力。楊奇慧等[35]研究表明，飼料中添加富含小肽的酶解植物蛋白時，凡納濱對蝦血清中PO 的活力隨著添加水平的提高呈現先上升后下降的趨勢。本研究中，添加小肽可提高凡納濱對蝦血清的PO 活力，增強其抵抗外界侵染的能力，與前人的結果基本一致。

3.4 小肽對凡納濱對蝦抗氧化酶活力的影響

機體內的SOD與GSH-Px形成具有抗氧化能力的保護系統，可抵御氧化物的干擾和損傷[36-37]。SOD 有抗炎、抗病毒及抗氧化等多種功能，是機體內常見的抗氧化酶，主要清除超氧陰離子。GSH-Px可消除機體內過多的過氧化物，使體內自由基保持在低水平，維持生物膜的功能。脂質過氧化時產生的MDA 會導致機體生物膜的結構異變與功能紊亂，MDA 含量一定程度上可反映機體受自由基損害的程度。研究表明，飼料中添加小肽可提高在低溫脅迫條件下的小黃魚（Larimichthys polyactis）的GSH-Px 活力[38]，飼料中添加大豆酶解蛋白可顯著提高凡納濱對蝦血清中SOD 活力[39]，凡納濱對蝦血清MDA 含量在適量添加酵母培養物后下降，抗氧化能力有所提高[40]。本研究中，小肽組SOD、GSH-Px 以及T-AOC 顯著升高，MDA 的含量顯著降低，其中添加質量分數0.1%小肽的L1 組SOD、GSH-Px 以及T-AOC 最高，表明在凡納濱對蝦飼料中添加小肽，可提高機體抗氧化酶活力，提高自身免疫能力，形成完善的抗氧化系統，減輕過氧化物對機體的損傷。

3.5 小肽對凡納濱對蝦腸道菌群的影響

腸道菌群在動物消化吸收過程中有至關重要作用，其分泌的各種代謝產物還直接或間接影響動物的機體健康[41-43]。在腸道菌群研究中，Ace 指數、Chao1 指數、Shannon 指數、Simpson 指數等α 多樣性指數可指示腸道微生物的豐富度[44]。本研究中，4 種α 多樣性指數均無顯著差異，表明在飼料中添加小肽，對凡納濱對蝦腸道微生物群豐富度無顯著影響?？赡苁且驗閷ξr腸道對微生物系統提供一定的庇護作用，微生物群落的整體豐富度和多樣性不易改變[44-45]。

對蝦腸道中主要細菌類群在門水平上為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門[46]，在綱水平上為γ-變形菌綱和α-變形菌綱[47]。本研究有類似結果，凡納濱幼蝦腸道菌群結構在門水平上的變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和綱水平上擬桿菌綱、γ-變形菌綱、α-變形菌綱占主要優勢。在屬水平上，凡納濱幼蝦腸道主要優勢菌為魯杰氏菌、Motilimonas菌、弧菌和Hopperia菌?；【呛Ｑ笾械膬瀯菥鷮?，也是海水養殖動物的主要致病菌之一[48]。何遠法等[49]研究發現，增加酵母培養物可降低凡納濱對蝦腸道的弧菌數量。本研究有類似結果，L1 組弧菌相對豐度顯著降低，表明在飼料中添加質量分數0.1%小肽可降低凡納濱對蝦腸道弧菌數量，可在一定程度上抑制弧菌毒性，降低凡納濱對蝦感染腸炎的風險。

4 結論

本研究表明，飼料中添加質量分數0.1%的小肽可提高凡納濱對蝦的增重率，降低飼料系數，促進凡納濱對蝦生長，提高抗氧化能力和非特異性免疫力，降低弧菌數量，減輕不良菌群對腸道的侵害作用。