溶藻弧菌T3SS exsD 基因敲除突變株構建及其表型特征

王俊霖，招 茵，蘇茵茵，周詩慧，曾福源，謝 妙，王 娜，簡紀常，龐歡瑛

（1.廣東海洋大學水產學院// 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室// 廣東省教育廳水產經濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）為嗜鹽嗜溫性的革蘭陰性菌[1-2]，普遍存在于海洋環境和多種海洋動物中，是魚、蝦、貝等海水養殖動物的主要致病菌之一[3]。此外，該菌可導致人類的食物中毒、中耳炎、頭痛、乏力以及敗血癥等多種疾病[4]。

III 型分泌系統 (Type III secretion system，T3SS)是多數革蘭陰性菌的重要毒力因子，其功能是將細菌效應蛋白注射至宿主細胞中，最終導致宿主細胞死亡[5-6]。近年來，關于細菌T3SS 的結構、裝配以及致病機理研究取得較大進展，研究較為深入的有副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）[7]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[8]、哈維弧菌（Vibrio harveyi）、嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)[9]等。有關溶藻弧菌T3SS 的研究主要集中在裝置蛋白[10-12]、效應蛋白[13-15]，而對調控蛋白的研究報道較少。

在銅綠假單胞菌中，ExsD 是T3SS 的負調控因子[16]，對T3SS 分泌相關蛋白、調節蛋白和效應蛋白有顯著抑制作用[17-18]。副溶血弧菌的T3SS1 主要受ExsACDE 操縱子調控，在誘導條件下，ExsA 通過結合T3SS1 結構基因和效應蛋白基因的啟動子來介導T3SS1 的細胞毒性，ExsD 蛋白可直接與ExsA 蛋白結合，阻斷T3SS1 的分泌；ExsC 蛋白可直接與ExsD 蛋白結合，從而免去其對ExsA 蛋白的抑制作用，促進T3SS1 的表達，即ExsA 和ExsC是T3SS1 的正向調控子，ExsD 是T3SS1 的負向調控子[8]。然而，目前尚鮮見有關溶藻弧菌T3SS 調控蛋白ExsD 表型的研究報道。

本研究通過overlapPCR 和同源重組技術，構建缺失株ΔexsD，并比較其生長、泳動能力、胞外酶活性、生物膜形成能力、藥物敏感度、毒力等與野生株HY9901 的差異，為進一步研究溶藻弧菌ExsD蛋白的功能和T3SS 的致病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質粒 溶藻弧菌野生株HY9901 為廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室保存；同源重組菌株S17-1λpir (TPR，SMR，ΛPIR)，Biovector Co.,LTD；大腸桿菌感受態BL21(DE3)，北京全式金生物公司；自殺質粒 pDM4(SACB，CMR)，Biovector Co.,LTD，引物見表1。

表1 實驗用引物Table1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1缺失株的構建 參照Milton 等[19]方法，用引物ExsD-A1-F/ExsD-A1-R 和ExsD-A2-F/ExsD-A2-R對exsD編碼序列上下游同源臂進行擴增。除BglII和SalI 限制位點序列外，兩個擴增片段均含有10 bp的重疊序列。將這些產物作為“splicing by overlap extension”(SOE) PCR 的模板，利用引物ExsD-A1-F和ExsD-A2-R 擴增融合片段。全片段用BglII 和SalI酶切，連接到自殺載體 pDM4(酶切)，生成pDM4-exsD-A1F+A2R。將所得質粒電穿孔至大腸桿菌 S17-1，通過電轉法轉入溶藻弧菌菌株HY9901。用氨芐西林和氯霉素在TSA 板上篩選成功轉入質粒的單克隆菌株。取若干插入突變單菌落，劃線于LB平板 (4 g/LL-阿拉伯糖) 中，置28 ℃下培養18 h。挑取平板上菌落，以引物ExsD-A1-F/ExsD-A2-R 檢測單菌落，野生型溶藻弧菌作為對照。單菌落純化后，再次進行擴增驗證，測序結果驗證缺失株ΔexsD是否構建成功。

1.2.2缺失株ΔexsD的驗證 參照馮建儒等[20]的方法，提取野生株HY9901 和缺失株ΔexsD的RNA，反轉錄成cDNA，利用引物ExsD-F/ExsD-R 進行PCR 擴增驗證。

1.2.3突變株的遺傳穩定性檢驗 將缺失株ΔexsD在TSB培養基上連續傳代30次，用引物ExsD-A1-F/ExsD-A2-R 進行PCR 及電泳檢測，確定ΔexsD是否可穩定遺傳。

1.2.4生長曲線測定 挑選溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD單菌落，接種于新鮮TSB培養基，在D(600 nm)=0.5 時按照1∶100 的比例接種到新鮮培養基中繼續培養24 h。在此期間，每2 h取樣1 次。以時間點為橫坐標，D(600 nm)為橫坐標繪制兩株菌株的生長曲線。每個樣品設3 個重復。

1.2.5細菌泳動實驗 配制LBS 培養基（在LB 培養基中添加20 g/L 的NaCl、3 g/L 的瓊脂[21]，分別用牙簽挑取溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD單菌落以垂直的方式插入到上述平板，注意彼此之間的距離。于28 ℃條件下靜置培養7 h，測量泳動圈的直徑。

1.2.6胞外蛋白酶活性檢測 將高壓滅菌后烘干的玻璃紙平鋪在含有1.5%瓊脂的TSA 平板上。吸取D(600 nm)=0.5 的溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD各100 μL，涂布于含有玻璃紙的TSA 平板，于28 ℃培養箱中培養18 h。用4 mL 無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）緩慢吹打、洗滌玻璃紙，洗滌液于4 ℃、10 000g條件下離心0.5 h。將上清液過0.22 μm 的微孔濾網，得到細菌的胞外產物，4 ℃下保存。

分別取溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD的胞外產物100 μL，分別加入100 μL 0.5 g/L 的偶氮酪蛋白溶液，混勻。補加pH 8.0 的Tris-HCl 溶液，于37 ℃下孵育0.5 h。加入100 g/L 的三氯乙酸400 μL，室溫下孵育0.5 h，終止反應。以12 000g離心5 min，取上清液，加入0.525 mol/L 的NaOH 溶液800 μL 進行顯色反應，用酶標儀測定D(442 nm)。用煮沸后樣品作為空白對照，實驗重復3 次。

用軟件SPSS12.0 進行單因素方差分析，用Duncan 多重比較，根據P值確定顯著性。

1.2.7藥敏實驗 用紙片擴散法測定菌株對30 種抗生素的敏感性。測定抑菌圈直徑，通過比對說明書判讀結果。

1.2.8半數致死量LD50測定 分別接種 HY9901、ΔexsD的單克隆至TSB 中，搖床振蕩培養18 h，以1∶100 比例重新接種到新的TSB 中，培養至D(600 nm)=1.00，以5 000 r/min 離心3 min，收集菌體，用PBS 清洗2 次，并調節至梯度濃度108、107、106、105、104，以PBS 為空白對照，實驗用斑馬魚（Danio rerio）共180 尾，隨機分組，每組10 尾。實驗組以肌肉注射方式每尾注射5 μL 菌液。對照組以同樣方式注射等量PBS。每組設置3 個重復組。記錄7 d 內魚體死亡數，直至死亡情況穩定。用寇氏法計算半數致死量。

1.2.9生物膜厚度檢測 結晶紫染色。挑取溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD單菌落接種于5 mL 新鮮的TSB，培養至D(600 nm)=0.5。按照1∶10 比例稀釋菌液，分別接種于無菌的96 孔板，每孔加100 μL，28 ℃下分別培養6、12、24、48、72 h。72 h 后用無菌PBS 300 mL 輕輕洗掉菌液，重復3 次，倒置晾干。加150 μL 甲醇固定20 min，倒置30 min，晾干。用每孔加150 μL 的結晶紫草酸銨溶液，染色15 min；用自來水輕輕沖洗掉，倒置晾干。每孔加入150 μL 的體積分數95%乙醇，室溫放置30 min，在D(570 nm)條件下測定，以新鮮的TSB 溶液為陰性對照。實驗重復3 次。

共聚焦顯微鏡觀察及測定[22]。將野生株HY9901 及缺失株ΔexsD接種到新鮮TSB 培養基，于28 ℃下震蕩培養24 h，將菌液D(600 nm)調至0.5，以1∶50 比例加至NEST 玻底培養皿中，37 ℃下靜置培養24 h。用8.5 g/L 生理鹽水清洗3 次，加入質量分數10% SYTO9 綠色熒光染料，置黑暗處染色20 min。用生理鹽水清洗3次，加入100 μL 40% 生理鹽水-甘油，進行共聚焦顯微鏡觀察。激發波長為488 nm，掃描從底部至頂部的生物膜，測定膜厚度。

1.2.10T3SS 相關基因的表達分析 用高糖培養基（Dulbecco’s Modified Eagle，DMEM）誘導T3SS分泌，T3SS 相關基因的引物如表1 所示，16S rRNA用作內部參考。根據Li 等[23]方法提取RNA，用合成cDNA 和實時熒光定量PCR 分析T3SS 的hop基因[14-15]在不同時段的表達量。

1.2.11數據統計與分析 實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 缺失株ΔexsD 的構建及驗證

圖1 可見，正確的缺失突變克隆擴增產生948 bp 片段，野生型擴增片段長1 788 bp。

圖1 缺失株ΔexsD 的構建Fig.1 Construction of the mutant strain ΔexsD

克隆純化后，再次擴增驗證，并遞交PCR 產物測序，測序結果證實，exsD缺失突變株構建成功。

野生株和缺失株ΔexsD接種培養18 h 后，成功提取到完整的RNA（圖2(A)）。特定引物ExsD-F/ExsD-R 擴增結果表明，野生株HY9901 處有981 bp的條帶，缺失株ΔexsD擴增不出條帶（圖2(B)），證明已成功構建缺失株ΔexsD。

圖2 缺失株ΔexsD 的驗證Fig.2 Verification of the mutant strain ΔexsD

2.2 突變株的遺傳穩定性

野生株HY9901 及缺失株ΔexsD均經連續傳代30 代，野生株可檢測到1 788 bp 的片段，缺失株ΔexsD得到948 bp 的片段，表明溶藻弧菌HY9901在缺失基因exsD情況下依舊可穩定遺傳（圖3）。

圖3 ΔexsD 的遺傳穩定性分析Fig.3 Genetic stability detection of deletion mutant ΔexsD

2.3 生長曲線

比較野生株HY9901 和缺失株ΔexsD在TSB中的生長曲線（圖4）可知，兩株菌生長基本一致，說明ΔexsD基因缺失不會影響菌株生長。兩株菌的繁殖速度均較快，2～ 6 h 時達到指數生長。

圖4 缺失株ΔexsD 與HY9901 生長曲線Fig.4 Growth rates of HY9901 ΔexsD and HY9901

2.4 泳動能力

圖5 可知，與溶藻弧菌野生株HY9901 比較，缺失株ΔexsD泳動能力極顯著上升（P＜ 0.01）。

圖5 泳動能力Fig.5 Swimming motility

2.5 胞外蛋白酶活性

圖6 表明，與溶藻弧菌野生株比較，缺失株ΔexsD的酶活性顯著上升（P＜ 0.05）。

圖6 胞外蛋白酶活性Fig.6 Activity of ECPase

2.6 藥敏試驗

表2 可見，溶藻弧菌野生株HY9901 與缺失株對多數抗生素耐藥，相較于野生株，exsD基因的缺失，使菌株對米諾環素、慶大霉素、卡那霉素、多西環素、新霉素的敏感性從耐藥變成中度敏感。

表2 藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity test results of the HY9901 and HY9901 ΔexsD

2.7 半數致死量LD50

由表3 可知，與野生株比較，突變株ΔexsD對斑馬魚的半數致死劑量下降，是前者的1/3.68，表明exsD基因缺失影響了溶藻弧菌的致病性，導致毒力上升。

表3 溶藻弧菌HY9901、突變株ΔexsD 對斑馬魚的LD50Table 3 LD50 of HY9901 and ΔexsD for zebrafish

2.8 生物膜厚度

圖7 可見，溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株ΔexsD形成生物膜的能力在前48 h 略有不同，48 h后則差別不大，在24 h 時缺失株ΔexsD生物膜（0.62）明顯厚于野生株HY9901（0.36）（P＜ 0.05）。

圖7 野生株、缺失株ΔexsD 的生物膜Fig.7 Biomembrane thickness of HY9901 and its ΔexsD

共聚焦電鏡（24 h）的結果如圖8 所示，相對于野生株HY9901，缺失株ΔexsD生物膜厚度顯著增加（P＜ 0.05），與結晶紫染色結果相符。

圖8 野生株、缺失株ΔexsD 的生物膜（共聚焦電鏡）Fig.8 Measurement of biofilm by LSCM

2.9 mRNA 表達差異

圖9 表明，與HY9901 野生型相比，ΔexsD組hop的表達量在18、24、36、48、72 h 時均極顯著上升（P＜ 0.01）（圖9）。

圖9 HY9901 和ΔexsD 在DMEM 中T3SS 效應蛋白基因hop 的mRNA 表達Fig.9 Expression of T3SS effector protein gene hop of HY9901 and ΔexsD induced by DMEM

3 討論

細菌毒力因子T3SS 表達與分泌受環境和相關調控蛋白ExsAD 的影響，部分細菌exsD基因有負調控T3SS 的作用，但調控機制復雜。如銅綠假單胞菌可與真核細胞接觸，或在特定環境條件下誘導T3SS 表達分泌[16]。T3SS 由ExsA 蛋白直接調控，而ExsCDE 三個蛋白可感應胞外Ca2+濃度來調控ExsA 的轉錄活性[8,24-25]。為檢測銅綠假單胞菌ExsD 對轉錄的影響，Michelle 等[16]通過LacZ 報告基因融合實驗表明，exsD基因的缺失顯著促進了T3SS 分泌，及調節蛋白和效應蛋白的表達。又如，Zhou 等[26-27]發現，副溶血弧菌在LB-S 培養基生長時，exsD基因的缺失激活T3SS1 基因的轉錄，而野生株exsD基因的回補抑制了其基因的轉錄；當在DMEM 中生長時，副溶血弧菌ExsD 在NY-4 中的過表達阻止了T3SS1 基因的轉錄，表明ExsD 為負向轉錄調控；ExsD 直接與ExsA 結合，并可能阻止ExsA 與T3SS1 基因的啟動子區域結合。Liu 等[28]確定，經典的銅綠假單胞菌ExsACDE 蛋白-蛋白調控模型適用于溶藻弧菌，并在溶藻弧菌中證實ExsA和ExsC 正調控T3SS，ExsD 和ExsE 負調控T3SS。然而，溶藻弧菌T3SS ExsD 蛋白的表型與具體調控機制還未充分闡明，本研究敲除溶藻弧菌T3SS 的調控基因exsD，并分析其表型特征，可為進一步闡明exsD功能提供依據。

端生鞭毛及眾多周生鞭毛是細菌表面附屬結構的重要組成部分，影響弧菌的泳動力，鞭毛調控蛋白可直接影響細菌泳動能力[29-30]。劉文竹[31]報道，溶藻弧菌tssj基因的缺失可影響溶藻弧菌鞭毛的生成，減弱突變株的泳動能力。本研究中，野生株HY9901 與缺失株ΔexsD泳動能力差異極其顯著（P＜ 0.01），exsD基因的缺失增強了突變株的泳動能力，表明ExsD 蛋白與溶藻弧菌的泳動能力之間相互關聯，推測exsD基因對溶藻弧菌鞭毛的生成或鞭毛蛋白的表達以及泳動能力為負調控影響。

胞外酶是一類多種活性酶的總稱，也是病原菌致病的主要毒力因子之一，可以特殊形式在宿主體內增殖，輕者破壞宿主免疫系統，重者使宿主細胞發生溶解進而死亡[32]。致病性弧菌的胞外產物有多種酶活性，許兵等[33]用杯碟法測出溶藻弧菌的胞外產物，且對對蝦有致死作用，其中蛋白酶成分是決定病原菌致病性的重要因素。本研究中，缺失株ΔexsD的蛋白酶活性相對于野生株HY9901 顯著上升（P＜ 0.05），推測ExsD 蛋白可通過調控其他效應蛋白，或與其他調控蛋白協同作用降低溶藻弧菌的蛋白酶活性。然而ExsD 蛋白如何影響溶藻弧菌蛋白酶活性，還需進一步實驗驗證。

目前，對溶藻弧菌病防治以抗生素為主，但長期大量使用抗生素會使溶藻弧菌產生耐藥性[34-35]。另一方面，細菌的耐藥性也可通過耐藥質粒接合、轉導的傳播作用或從其他攜帶耐藥基因的鐵載體上獲得[36-37]。溶藻弧菌存在耐藥基因[38-39]，胡夢華等[39]研究發現，溶藻弧菌菌株VA-76 攜帶arr-2、drfA27、strA、strB、floR、cat和qnrvC耐藥基因，既有一定的致病能力，且對多種抗生素耐藥。本研究中，溶藻弧菌HY9901 與缺失株ΔexsD也對大多數抗生素耐藥，與野生株相比，exsD基因的缺失，使其對米諾環素、慶大霉素、卡那霉素、多西環素、新霉素五種抗生素的耐藥性從耐藥變成中度敏感。這可能說明exsD可直接或間接調控相關耐藥基因的表達。而細菌的生物膜可促進細菌抵御抗生素，在臨床上引起多重耐藥性[40]，本研究中，在6 h 前，ΔexsD形成生物膜能力弱于野生株，這也可能是細菌對抗生素的耐藥性從耐藥到敏感的原因之一。

細菌可特異性和選擇性地在介質表面黏附，生成一層生物膜，有減輕抗生素干擾并在宿主免疫防御中保護自身作用[41]。本研究通過結晶紫染色和共聚焦掃描兩種方法證明，缺失株ΔexsD形成生物膜能力在24 h 時高于野生株，說明exsD基因在細菌生長的穩定期對生物膜形成負調控。Sara 等[42]與夏飛等[43]報道，細菌在致病過程中，密度感應系統發揮重要作用，有4%～12%基因受其調控，并直接控制多種毒力因子表達，包括生物膜形成。因此，ExsD蛋白在細菌生長的穩定期顯著影響生物膜厚度可能與密度感應現象有關，這需進一步實驗驗證。

細菌的毒力體現在產毒力和侵染力，它會與宿主發生一系列的相互作用，最終產出毒素并侵染宿主[44]。Phan 等[45]發現，副溶血弧菌缺失株ΔHUs（Δvp0920、Δvp2911）與野生株相比，exsA、exsD、vp1680、vp1671等T3SS1 相關基因的表達水平降低，另外在ΔHUs 株中exsD基因額外的缺失，恢復了T3SS1 相關基因的表達水平和細胞毒性。在張杰等[46]所構建的殺香魚假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）exsA突變株對大黃魚（Larimichthys crocea）的毒力實驗中，與exsA突變株相比，野生株對大黃魚的毒力提高190 倍；殺香魚假單胞菌ExsA 正向調控T3SS 相關蛋白的表達。本研究的缺失株ΔexsD毒力相較于野生株升高了3.68 倍，與殺香魚假單胞菌和副溶血弧菌的毒力實驗結果一致。

調控蛋白對T3SS 的調控主要是對效應蛋白的調控[47]。Liu 等[28]研究發現，溶藻弧菌ExsD 對效應蛋白Va1686 和Va1687 起負向調節作用。Zhou等[48]研究表明，TyeA 可調節溶藻弧菌T3SS，可能參與調節效應蛋白的表達，在缺失tyeA基因的情況下，顯著上調效應蛋白VopS 和Hop 的mRNA 表達量。本研究中，exsD基因的缺失同樣也會增加T3SS效應蛋白Hop 的mRNA 表達量，可能ExsD 與TyeA蛋白一樣，通過某種方式來負調控T3SS 相關基因的轉錄，從而增加溶藻弧菌效應蛋白的表達?？梢?，溶藻弧菌T3SS ExsD 蛋白有負調控相關效應蛋白的功能，但具體調控機制是否與副溶血弧菌、銅綠假單胞菌相似，還需要進一步探究。本研究可為后續T3SS 的調控機制研究奠定基礎。

4 結論

本研究采用同源重組和OverlapPCR 技術成功構建溶藻弧菌HY9901 突變株ΔexsD，分析表明，溶藻弧菌exsD基因的缺失，對溶藻弧菌的遺傳穩定性、生長速度影響不顯著；但導致其泳動能力、對斑馬魚的致病性極顯著上升，胞外蛋白酶活性和24 h 形成生物膜的能力顯著上升，對丁胺卡那、慶大霉素、多西環素、新霉素、氯霉素五種抗生素藥物敏感度從耐藥上升至中等敏感，上調了T3SS 效應蛋白Hop 的表達。