光質對紅陽獼猴桃愈傷組織生長速度和花青素合成的影響

解瀟冬，劉曉瑩，汪文杰，白 潔，李大衛，劉亞令

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.中國科學院武漢植物園獼猴桃產業技術工程實驗室，湖北武漢430000）

獼猴桃屬多年生木本雌雄異株藤本植物，種類繁多，目前市場上綠肉和黃肉的獼猴桃居多。紅陽獼猴桃是由四川省自然資源研究所和蒼溪縣農業局共同選育出的優良品種，果肉四周綠色，中間呈紅色，能夠刺激食欲，增加消費者的購買欲望，且肉質細嫩，口感鮮香甜美，極具佐餐價值；還有易成花、坐果率高、早產豐產等優點[1]，使得紅陽獼猴桃被大面積推廣。植物組織培養廣泛應用于科學研究，相比于在成熟植物體中進行試驗，組培技術的應用能大大加快試驗進程，且沒有季節限制。目前，關于獼猴桃快繁體系的研究大多聚焦于激素的種類及配比，且趨于完善，但仍未發現光照等因素對該體系影響的報道。

大量研究表明，不同波長的光對植物生長有不同的影響。例如，紅光可以增加番茄株高，但抑制根系活力。藍光抑制番茄幼苗生長，降低葉綠素含量，而含有紅藍光的混合光不僅能促進番茄植株生長，還能提高其光合效率[2]，在茄子中也得到了類似的結果[3]。有研究表明，混合光源對植物生長的影響比單色光更顯著，例如，對萵苣生長最有利的是紅光∶藍光為4∶1[4]；在混合光源（紅光∶藍光為2∶1，紅光∶藍光為1∶1）下，番茄幼苗根系表現出明顯的高效生長[5]；紅光∶藍光為4∶1時，香蕉組培苗生長最快[6]。

花青素是一種存在于植物中的天然色素，在食品染色和染料加工中有廣泛應用；同時花青素還是一種強力的自由基清除劑，比維生素C、維生素E的抗氧化能力高數十倍，在神經和心血管疾病防治方面效果顯著，在抗炎、抗癌保健方面也有很好的前景[7]。

近年來隨著研究的深入，花青素合成路徑逐步完善，該過程中許多相關酶基因的功能已經被證實[7]。另外，還有大量研究表明，由MYB、bHLH、WD40等轉錄因子組成的復合體對花青素的合成也有重要作用。例如，擬南芥中AtMYB11、At－MYB12、AtMYB111、AtTTG1對花青素合成的早期調控基因有激活作用[8]；蘋果MdMYB1、MdMYB16、MdTTG1對蘋果著色有重要作用[9]；此外，百合（LlMYB19）、牡丹（PsMYB58）、柿子（DkMYB10）、葡萄（VvMYBA1和VvMYBA2）以及草莓（FaMYB10）相繼被報道在花青素的合成中發揮作用[10-14]。

紅陽果肉中花青素的積累是果肉呈紅色的關鍵所在。已有研究表明，干擾AcMYB75和AcMYB123，紅陽果肉顏色會變淺[15-16]；還有AcMYB10、AcMYB110也與紅陽花青苷的積累相關[17-18]；此外，低溫可以使獼猴桃花青素合成相關基因AcMYB1-1和AcMYB5-1表達水平提高，進而使花青素含量升高，而高溫則會抑制花青苷的合成[19-20]。李貴生[21]在紅陽和金艷果實轉錄組比較分析中發現，MYB-A72只存在于紅陽的轉錄本中，bHLH-B36和WD40-A126可能參與MYB-bHLH-WD40復合體的形成，靶向調控CHI2、FLS1和CYP98A1等花青素合成相關基因。盡管已有大量研究，較為清楚地闡述了花青素的合成機制，但在獼猴桃中關于光在花青素合成中的作用仍未解釋清楚。

本研究在前人的基礎上，以光質為變量，紅陽獼猴桃愈傷組織為研究對象，測量并分析6種光質對紅陽獼猴桃愈傷組織生長速率、花青素含量以及相關基因表達量的影響，希望篩選出最適宜紅陽獼猴桃離體培養的光照條件，并探明光照對花青素合成的影響規律，同時發掘花青素合成相關基因中的主要光響應因子，為后期研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

紅陽獼猴桃材料取自中國科學院武漢植物園國家獼猴桃種質資源圃。

1.2 試驗設計

試驗于2019年8月在中國科學院武漢植物園獼猴桃產業技術工程實驗室中進行。以紅陽獼猴桃的新鮮葉片為外植體，經過植物組織培養誘導生成愈傷組織，然后將愈傷組織重新切分并置于6種LED燈下，分別為：白光（波長450～465 nm）、紅光（波長650～700 nm）、藍光（波長465～480 nm）、紅光∶藍光為1∶1、紅光∶藍光為1∶3和紅光∶藍光為3∶1（圖1），環境溫度設定在25℃下12 h光明/12 h黑暗。

培養基配方：4.42 g/L Murashige & Skoog with Vitamins＋0.9%瓊脂＋3%蔗糖＋1 mg/L TDZ（噻嗪?。?.5 mg/L IAA（吲哚-3-乙酸）。

1.3 愈傷組織直徑和芽長的測定

在6種LED光源下，測定紅陽愈傷組織第15、25、40、100天的直徑和芽長。愈傷組織的直徑用交叉法測量，每個樣本設40個重復。愈傷組織分化為芽后，測量愈傷組織的芽長，并統計每皿分化出芽的數量，計算平均值。每組設15個重復。

式中，L100為100 d時愈傷組織的直徑，L15為15 d時愈傷組織的直徑。

1.4 愈傷組織及葉片花青素含量測定

分別取培養30、60、90 d的愈傷組織及其分化形成的葉片，液氮冷凍并研磨成粉末狀，將0.1 g粉末狀組織樣品在600 μL提取緩沖液（含1%HCl的甲醇）中于4℃溫育6 h。提取后，向每個樣品中加入200 μL水和200 μL氯仿，然后在4℃下以14 000×g離心5 min以沉淀植物材料，并使用酶標儀在530、657 nm處讀取吸光度。

1.5 獼猴桃花青素合成相關基因表達分析

使用植物RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）分別提取不同光質處理的愈傷組織及其分化形成的葉片的總RNA，反轉錄成cDNA并稀釋3倍備用，終濃度為147.46 ng/μL。以獼猴桃中Actin為內參基因進行qPCR分析，實時熒光定量PCR檢測系統由Applied Biosystems公司提供，型號為7500FAST；反應體系中qPCR Mix加5 μL，正反向引物各加0.2 μL，cDNA加1 μL，加無菌水補齊到10 μL；反應步驟為：94℃預變性30 s，然后進行45個循環的94℃變性5 s、60℃退火30 s。所用引物如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR分析所用引物

1.6 愈傷組織花青素含量與相關基因表達量相關性分析

用Excle對花青素含量和相關基因表達量進行相關性分析，使用CORRE函數計算相關系數，并將結果用熱圖形式表現出來。

2 結果與分析

2.1 不同光質下愈傷組織及芽生長效率分析

將愈傷組織置于6種LED光源下進行培養，隨著培養時間延長，各種光質下愈傷組織生物量都有所增加，其中，白光和紅光增加最為明顯，且紅光照射誘導產生芽的數量明顯多于其他光照，愈傷組織的顏色相對于其他光質較淺（圖2）。由表2可知，15 d時，芽的數量呈紅光、紅光∶藍光為1∶3、藍光、紅光∶藍光為3∶1、白光、紅光∶藍光為1∶1依次遞減；培養至30 d時，各個光質下芽數量的增量大致相同，但其愈傷組織的直徑及芽的長度存在差異。

表2 不同光質下平均每皿芽的數量比較 個

從圖3可以看出，不同光質條件下愈傷組織的直徑和芽長均隨愈傷組織發育時間的延長而增加。在4個發育階段，紅光條件下愈傷組織直徑最大，紅光∶藍光為1∶3次之。在紅光照射下，各愈傷組織的芽長最長。通過計算愈傷組織直徑和芽長的平均生長速率，發現在6種光質下，紅光和紅光∶藍光為3∶1下愈傷組織直徑的平均生長速率最高。紅光處理下，芽的平均生長率高于其他處理；紅光∶藍光為3∶1處理下，芽的平均生長速率最低。白光和紅光∶藍光為1∶3下愈傷組織的直徑和芽生長速率處于較高水平，而藍光和紅光∶藍光為1∶1下愈傷組織的生長速率處于較低水平。通過統計發現，不同光質下不同芽長度占比存在差異。在紅光下，芽長占比最多為2～3 cm，占43%，說明紅光促進了芽的生長。而在藍光和紅光∶藍光為1∶1條件下，紅陽芽長在0～1 cm占比最大，說明這2種光都抑制了紅陽芽的生長。此外，100 d時紅光下0 cm處的芽長占比最小，大于3 cm處的芽長占比最大。由此可見，紅光下獼猴桃愈傷組織的生長速度最快。

2.2 不同光質下愈傷組織及葉片花青素含量分析

從圖4可以看出，隨著時間的延長，白光和紅光下葉片花青素的含量逐漸增加，而藍光、紅光∶藍光為1∶1、紅光∶藍光為1∶3處理則呈現先降后升的規律，紅光∶藍光為3∶1處理在3個時期花青素含量沒有明顯差異。以白光作為對照，藍光下30、90 d、紅光∶藍光為1∶1下30 d、紅光∶藍光為1∶3下90 d花青素含量與對照組相當，其他光照條件和其他時期花青素含量均明顯降低。愈傷組織中花青素含量較葉片中整體水平偏高；隨著時間的推移，白光和紅光∶藍光為3∶1下花青素含量小幅上升，紅光下花青素的含量在3個時期基本恒定；而藍光下，第1時期花青素含量遠高于平均水平，隨著時間延長大幅下降；紅光∶藍光為1∶3下花青素含量也呈緩慢下降的規律，紅光∶藍光為1∶3僅在60 d時，花青素含量躍升，而后又急劇降低。整體來看，相對于白光，紅光∶藍光為1∶3愈傷組織的花青素含量與之相當，紅光和紅光∶藍光為3∶1有明顯降低，而藍光和紅光∶藍光為1∶1則明顯升高。綜上，紅光和紅光∶藍光為3∶1能抑制葉片及愈傷組織中的花青素合成，而藍光和紅光∶藍光為1∶1能促進愈傷組織中花青素的合成，在葉片中效果不明顯。

2.3 不同光質處理愈傷組織花青素合成相關基因表達量分析

定量結果表明（圖5），每個基因在不同光質、不同時期的表達量都存在差異性。CHS主要在第1時期和第3時期發揮作用，第2時期表達水平整體偏低，白光、藍光以及紅光∶藍光為1∶1的組合中CHS在第1時期的表達水平都最高，而紅光∶藍光為1∶3和紅光∶藍光為3∶1處理，CHS在第3時期的表達水平明顯提高。F3′H在不同光質、不同時期的差異不明顯，僅在90 d的藍光處理中表達量提升2倍。DFR、ANS為前期主要的功能基因，它們在第1時期的表達量明顯高于其他2個時期，這2個基因在紅光下表達水平極低，并且紅光∶藍光為1∶3組合中表達量也不高。反之，CHI、UFGT、CRY則為后期的主要功能基因，它們的表達量隨著時間呈現上升或小幅回落而后上升的趨勢，其中，藍光能促進CHI、UFGT、CRY的表達，而紅光則有抑制作用，3種紅藍組合下CHI、UFGT、CRY的表達水平與白光一致。F3H在白光和紅光下表達水平都不高，相比較而言，紅光∶藍光為1∶1和紅光∶藍光為1∶3的表達量有小幅增加，藍光和紅光∶藍光為3∶1能明顯提升F3H的表達水平。作為紅陽獼猴桃調控紅色果肉形成的關鍵轉錄因子，MYB110基因的相對表達量整體偏低，主要在第2個時期發揮作用，不難看出，其在紅光及紅光∶藍光為3∶1的3個時期基因表達量保持一致，相對于白光而言，僅在紅光∶藍光為1∶3的組合中表達量有明顯提升，其余組合差異不明顯或略微減低。此外，葉片中各個基因的表達水平極低，不做分析。綜上，紅光抑制CHS、DFR、ANS、UFGT、CRY等基因的表達，進而影響花青素的合成，而藍光則能提升CHS、F3H、DFR、CHI、UFGT、CRY、F3′H等基因的表達水平進而促進花青素的合成，混合光紅光∶藍光為1∶3提升CHS、F3H、F3′H、MYB110的表達量以及抑制DRF、ANS的表達水平從而影響花青素的含量；紅光∶藍光為3∶1則促進CHS和F3H的表達，抑制UFGT的表達來調控花青素的合成。

2.4 不同光質下愈傷組織花青素含量和相關基因相關性分析

相關性分析結果表明（圖6），不同基因的表達量與花青素含量的相關性在不同光質下存在差異。CHS的表達量在白光下與花青素含量呈顯著負相關，而在藍光照射下呈顯著正相關，其他光處理沒有相關性或相關性不顯著；與之相反的是CHI和CRY，在白光下顯著正相關而藍光下顯著負相關，紅光∶藍光為1∶3下CRY的表達量與花青素負相關也達到顯著水平；DFR和ANS相關性分析結果類似，均為白光顯著負相關，藍光和紅光∶藍光為1∶3則高水平正相關，紅光為中等水平的負相關；紅光下的F3H和紅光∶藍光為1∶3下的F3′H的表達量與花青素含量呈顯著負相關，紅光∶藍光為1∶3下的F3H和紅光∶藍光為1∶1的F3′H相關性明顯，為正相關；UFGT的表達量在不同光質下與花青素含量中度相關或不相關；MYB110的表達量與花青素含量僅在紅光∶藍光為1∶1下顯著正相關，其余光質下相關性水平不高。

3 結論與討論

本研究探討了6種LED光組合下紅陽獼猴桃愈傷組織的生長效率，紅色照射下紅陽愈傷組織直徑和芽長的平均生長速率顯著高于其他光質下。單色紅光促進愈傷組織的生長，愈傷組織顏色變淺，推測紅光照射改變了紅陽愈傷組織的薄壁細胞，影響了其遺傳轉化活性。單色藍光對紅陽愈傷組織的生長速率和芽的伸長有抑制作用。該結果與之前的報道相似，紅光顯著促進了番茄幼苗株高的增加，但根系活力下降，強壯的幼苗指數下降；紅、藍光結合可增加番茄幼苗葉片光合色素含量，提高光合效率，促進植株生長[2]。不同比例的紅藍光還能提高黃瓜根系活力和葉面積，紅光∶藍光為4∶1最有利于生菜的生長等[22]。此外，與單色光質相比，紅光∶藍光為1∶1下愈傷組織的直徑和芽長均受到抑制。紅光∶藍光為1∶3組合對愈傷組織直徑和芽長有較強的促進作用，而紅光∶藍光為3∶1組合對愈傷組織直徑有顯著的促進作用，對芽長有顯著的抑制作用，這些結果與袁華玲等[23]研究的紅光∶藍光為3∶1的LED燈下對萼獼猴試管苗生長最好的結果有些出入，推測可能是品種不同，倍性不同所導致，值得進一步探究。

花青素含量與光有關已經被證實，紫薯塊根花青素的含量在黑膜下更高[24]。余敏[25]對獼猴桃果子著色的研究發現，強光能促進中華獼猴桃花青素的積累。在本研究中，紅光和紅光∶藍光為3∶1對葉片和花青素的合成均有所抑制，藍光和紅光∶藍光為1∶1對愈傷組織花青素的合成有促進作用。相較于余敏[25]的研究，本研究光源更為豐富，更清楚的解釋了不同光源對獼猴桃花青素含量的影響。前人研究表明，在草莓中，隨著光強的增加FaCHS、FaCHI、FaF3H、FaF3′H、FaDFR、FaANS、FaUFGT等基因表達水平下降[26]，本研究從不同光質的處理中發現，紅光對CHS、DFR、ANS、UFGT、CRY等基因表達抑制而使花青素合成受阻，而藍光則對CHS、F3H、DFR、CHI、UFGT、CRY、F3′H等基因表達有促進作用，花青素積累增加；紅光∶藍光為1∶3促進CHS、F3H的表達，但抑制UFGT的表達，紅光∶藍光為3∶1促進CHS和MYB110的表達，混合光對基因表達水平的影響同樣調控著花青素合成。張彬等[27]證實F3H、DFR、ANS、UFGT過表達會促進羽衣甘藍花青素積累增加而顏色加深[27]，這與本研究的結果一致。此外，花青素含量與相關基因表達量的相關性會隨著光質的變化而改變。

綜上所述，本研究探究了不同光質下紅陽獼猴桃愈傷組織及芽的生長速率，結果表明，紅光最適合紅陽獼猴桃離體培養，藍光和紅光∶藍光為1∶1組合最適宜花青素的積累，同時本研究將不同光質下花青素的含量與相關基因的表達量相關聯，發現不同基因對不同種類的光質響應程度不同。研究結果對獼猴桃快繁體系的優化有一定的參考意義，同時為花青素在不同光質下的調控研究提供了新的思路。