抑制石榴葉斑病菌的化學農藥和木霉菌株篩選

潘成蕊，魯海菊，張蓉蓉，胡 婕，李昱賢

（1.紅河學院生物科學與農學學院，云南蒙自 661199；2.蒙自海關綜合技術中心，云南蒙自 661199）

石榴是鮮食水果之一，在我國已有兩千多年的歷史，現已成為云南蒙自的主要特色水果之一，成為了蒙自市重要的經濟果樹，但隨著種植規模的不斷擴大，石榴病害隨著種植時間的延長而增加。1999 年周又生[1]報道了石榴干腐病，發病率約40%，造成重大經濟損失。2003年劉云龍[2]首次報道云南蒙自地區發生石榴枯萎病，發病率達到15%，經濟損失超過1500萬元[3]。1996年李夷波[4]等人報道蒙自地區石榴果腐病發生高達20%-30%，嚴重影響對外銷售。郭建偉[5]等人在石榴病原菌與病害研究綜述中提到石榴樹還會發生其他病害：如石榴根腐病、石榴瘡痂病、石榴褐斑病、石榴圓斑病、石榴葉霉病等，因而科學防治石榴病害是關鍵，提高果樹經濟價值已迫在眉睫。

目前，已發現由擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisspp.)引起的石榴葉斑病成為石榴生產上的重要病害之一，其病害多從葉尖或葉緣開始，初葉片正面為紅褐色小斑點，后擴大為圓形至橢圓形病斑，外圍有黃綠色暈圈，天氣潮濕時，溢出黃色黏液。嚴重時病斑連成片，引起焦枯，葉片脫落。對石榴造成了新的威脅，影響了石榴的產量和品質。通過初步調查蒙自市新安所鎮種植基地石榴葉斑病的發病率約為20%，給果農們帶來很大困擾。擬盤多毛孢可引起多種植物的葉斑病和灰斑病，曾引起印度南部茶葉灰斑病，導致產量下降了17%[6]。在浙江和福建楊梅上大面積引發楊梅凋萎病[7]。薛德勝曾報道棒狀擬盤多毛孢（P.clavispora）引起藍莓的枝枯病、葉斑病和根腐病[8-10]。Lisa等[11]報道小孢擬盤多毛孢菌引起番石榴的瘡痂??；張傳清[12]等報道小孢擬盤多毛孢菌會引起山核桃的黑斑??；Shen等[13]報道小孢擬盤多毛孢菌引起油棕葉斑??；Looby[14]曾報道擬盤多毛孢屬引起羅漢松頂端枯萎，病害的發生嚴重影響了作物自生品質和經濟價值。說明小孢擬盤多毛孢菌寄主多樣，導致眾多果樹及經濟作物發病，對石榴的威脅不容小覷。

化學防治是植物病害防治的重要手段，它憑借快速、高效、簡便、防效顯著等特點備受歡迎，對病害的預防、發生、流行在某種程度上起到決定性作用，目前已成為農戶的首選方案。毛忠順等[15]人報道三唑酮、百菌清、多菌靈等化學農藥對石榴病害有一定的抑制作用，但隨著病害種類增多、化學農藥不斷更新換代，同種藥劑表現出不同效果也是常見現象。通過歸納總結前人抑菌實驗結果，筆者選擇8種藥劑進行室內實驗，以期為大田試驗示范提供數據基礎。

長期廣泛使用農藥，病原菌易產生抗性，同時還會引起環境污染。近年來，綠色、無公害產品的呼聲越來越高，生物防治尤為重要。早在1981年西歐國家借助木霉制劑工序簡單、防治效果好的優點在生產中廣泛應用[16]。目前已有大量學者發現木霉菌(Trichodermaspp.)是一種良好的生防因子[17]，其繁殖速度快，能防治病害、增強抗性，是理想的生物防治資源之一。陳海龍[18]研究表明，木霉菌不僅對黃瓜枯萎病起到47%的防效，而且還具有增產作用。徐佳美等[19]曾報道哈茨木霉對擬盤多毛孢引起的草莓根腐病有抑制作用。魯海菊等[20]研究表明，枇杷內生木霉P3.9菌株對多種病原菌均有不同程度的抑制作用。木霉是否對石榴葉斑病有抑制作用尚未報道，待進一步探究。目前，石榴葉斑病日益嚴重，尚未見由擬盤多毛孢菌引起石榴葉斑病相關防治措施的報道，筆者采用菌絲生長速率法和對峙培養法，測定化學農藥和木霉生防菌株對石榴葉斑病病菌的抑菌效果，通過室內篩選，獲得抑菌效果最優的化學農藥和生防菌株，以期為石榴病害的研究提供參考依據。

一 材料與方法

（一）試驗材料

1.試驗器材

培養皿（88mm）、酒精燈、接種環、打孔器、封口膜、75%酒精、打火機、錐形瓶、無菌操作臺、鑷子、電子天平。

2.供試菌株

蒙自石榴種植園采集的葉斑病病葉，通過組織分離法、柯赫氏法則驗證，獲得擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.病菌菌株SY1；木霉Trichodermaspp.（GD1、Y2、GM6、PZ1、GD1抗三唑酮、Y2抗三唑酮、GM6抗三唑酮、GM6抗氟硅唑、PZ1三唑酮、PZ1氟硅唑）菌株，現保存于紅河學院生物科學與農學學院植物病理教學實驗室。

3.供試化學農藥

表1 供試化學農藥相關信息

將保存好的供試菌株SY1接種到配置好的PDA培養基內，置于25℃恒溫培養箱培養14d。用打孔器取直徑為5mm 的菌塊備用。

4.測定各供試化學農藥對石榴葉斑病病菌的抑制率

將各化學農藥按照使用說明上的濃度配制好注入到高壓滅菌冷卻至50℃左右的PDA培養基內，搖晃均勻后倒平板。待其冷卻后將供試菌株接入培養基正中央，用封口膜封好后置于恒溫培養箱內培養7d（溫度設置為28℃），以不加藥PDA培養基為對照，每個處理3個重復。最后觀察記錄菌絲生長量，用十字交叉法測量每皿菌落的直徑大小，計算其抑制率。公式如下：

抑制率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%[21]。

5.測定各供試木霉菌株對石榴葉斑病病菌的抑制率

采用對峙培養法[22]。將SY1與各供試木霉菌株兩兩組合接種到距離平板中央相等的兩個點上，以不接種木霉菌株的PDA培養基作為對照。每個處理3次重復，于28℃ 條件下恒溫培養。第3d對菌絲生長和產孢情況進行觀察并記錄；第7d測定病菌的菌落直徑，計算生長抑制率。

6.數據處理

利用SPSS 19.0和Excel 2003進行數據處理，采用Duncan’s多重比較進行差異顯著性檢驗。

二 結果與分析

（一）各供試化學農藥對石榴葉斑病病菌SY1菌株的抑制作用

由圖1可知，利用Duncan’s進行方差分析，顯示各供試化學農藥對石榴葉斑病病菌SY1菌株具有不同程度的抑菌作用。其中咪鮮胺、丙環唑對SY1抑制率差異不顯著，但與其余處理達到極顯著差異，抑菌率均為100%，抑制效果最好。其次是氟硅唑、苯醚甲環唑、百菌清、三唑酮4種農藥，抑制率均高于79%，抑菌效果較好。氟硅唑與苯醚甲環唑抑制率差異達到極顯著水平，其抑制率分別為86.8%、83.3%；百菌清與三唑酮差異不顯著，抑制率分別為79.9%、79.5%。甲基硫菌靈、多菌靈差異不顯著，抑菌效果最差，其抑制率分別為14.9%、13.3%。綜上所述，咪鮮胺和丙環唑可作為田間防治石榴葉斑病的首選農藥。氟硅唑、苯醚甲環唑、百菌清、三唑酮可作為備選農藥。

圖1 各供試化學農藥對石榴葉斑病病菌SY1的抑制效果圖

（二）各供試木霉菌株對石榴葉斑病病菌SY1菌株的抑制作用

由圖2可知，利用Duncan’s多重比較法進行方差分析，表明10株木霉菌株對石榴葉斑病病菌SY1菌株均有不同程度的抑制作用。其中，PZ1三唑酮和GM6抗氟硅唑、GD1和GD1抗三唑酮兩兩之間抑菌率差異不顯著，其余菌株之間差異顯著。10個木霉菌株根據抑菌率不同分為8組，抑菌率由高到低依次為PZ1>PZ1氟硅唑>GM6>PZ1三唑酮=GM6抗氟硅唑>Y2抗三唑酮>GM6抗三唑酮>Y2>GD1抗三唑酮=GD1。抑菌率分別為57%、54.5%、51.6%、51.6%、51.2%、49.6%、48.4%、41.9%、39.1%和38.7%。PZ1、PZ1氟硅唑、GM6、PZ1三唑酮和GM6抗氟硅唑5個木霉菌株抑菌率均高于50%，可以作為進一步開發利用的生防菌株?？顾幮阅久咕關Z1和GM6抑菌率低于原始菌株，抑菌作用衰退；抗藥性木霉菌株GD1抑菌率與原始菌株相同，抑菌效果不變；抗藥性木霉菌株Y2抑菌率高于原始菌株，抑菌作用增強。說明木霉GD1和Y2菌株可與農藥混配使用。

圖2 各供試木霉菌株對石榴葉斑病病菌SY1的抑制效果圖

三 討論

（一）化學農藥抑菌作用

1.同種藥劑對不同病原菌引起的石榴病害的防治效果

楊麗芬等[23]報道了由球毛殼菌 (Chaetomium globosum) 引起的石榴葉斑病使用濃度為13.33μg·mL-1，80%的甲基硫菌靈抑制率達100%；而筆者使用甲基硫菌靈抑制由擬盤多毛孢菌(P.eriobotryfolia)引起的石榴葉斑病抑制率約為14.9%，說明病原菌不同導致化學農藥的抑菌效果有差異。白海燕等[24]人報道由厚盤單毛孢（Monochaetia pachyspora）引起的石榴葉斑可用50%多菌靈1000倍液進行防治。而筆者的實驗結果表明多菌靈的抑菌率約為13.3%，抑菌效果差，造成這一差異的原因可能是病原菌不同、地域差異及抗藥性產生。2017年土耳其地中海石榴種植園內發現由膠孢炭疽菌（Colletotrichium gloeosporioides）引起的炭疽病，此文獻未提及化學農藥防治[25]。2013年云南省建水植保站的張榮勝曾在《致富天地》期刊上報道過石榴葉斑病又稱為黑斑病、褐斑病、角斑病，此文獻未提及病原菌[26]。李廣強等[27]報道由石榴生尾孢霉菌(Cercospora punicae)侵染引起的石榴黑斑病可用80%退菌特可濕性粉劑600-800倍液防治，說明引起石榴葉斑病的病原菌至少有5種，同種農藥對不同病原菌的抑制效果不同，在防治時要根據病原菌的種類來選擇最佳農藥進行防治。

2.同種藥劑對擬盤多毛孢菌的抑制效果

管斌等[28]報道25%咪鮮胺乳油對引起紅葉石楠葉斑病病原菌小孢擬盤多毛孢 (Pestalotiopsis microspora) 的抑菌率達到71.11%；溫浩[29]報道可將咪鮮胺作為草莓棒孢擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）葉斑病化學防治的推薦藥劑；姜琬[30]報道25%咪鮮胺乳油的833倍液對枇杷擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis eriobotrifolia）引起的枇杷灰斑病的防效最佳，抑制率達83.08%；筆者實驗結果表明咪鮮胺對擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsis.sp.)引起的石榴葉斑病的抑制效果高達100%。說明咪鮮胺對擬盤多毛屬均有抑制作用。

（二）木霉菌株抑菌作用

在大力防控農藥殘留的局勢下，生物防治越來越受到重視，魯海菊等[31]報道，木霉菌株對枇杷根腐病病菌有抑制作用；張婷等[32]人報道了木霉種衣劑包衣玉米種子對玉米彎孢霉葉斑病菌有抑制作用；茆振川[33]等人報道木霉菌抑制蘋果輪紋病菌。但篩選木霉菌株抑制石榴葉斑病尚屬首次。在響應綠色環保的主題下采用綜合防治是關鍵，通過木霉與化學農藥混配后的協同作用來降低藥劑施用劑量和次數，從而達到有效防治病害。段銀芝等[34]報道了吡蟲啉、咪唑乙煙酸、咪唑煙酸對哈茨木莓菌的菌絲生長及產孢具有促進作用。田連生等[35]報道了木霉菌株與多菌靈混配后施用，對灰霉病的防治具有協同增效作用。仁鳳山[36]研究表明防治蘋果輪紋病采用2000倍液的中生菌素與T2木霉菌混配起到增效作用。魯海菊等[37]人報道紫外線誘變能夠提高木霉菌株的耐藥性，從而減少殺菌劑對木霉菌株的影響，具有針對性的進行防治。在未來的發展中大量投入綜合防治也是打造綠色防控的關鍵。

除上述文獻之外，我們同組組員的研究結果顯示：丙環唑對擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsissp.)引起的石榴葉斑病和鏈格孢菌（Alternaria）引起的石榴褐斑病抑制效果最好，抑制率均達100%，說明丙環唑具有廣譜性，這也給不能正確辨別致病病原菌的農戶提供便利，一種農藥可以防治不同病害，大大降低了成本。PZ1三唑酮菌株對上述兩種病原菌抑制率均高于50%，開發利用前景廣闊，可作為大田防治的備選菌種資源。菌-藥復配的增效作用能減少化學農藥使用量，降低多年生植株的抗藥性。故抗藥性木霉PZ1菌株與咪鮮胺、丙環唑2種農藥復配對石榴葉斑病的抑制效果將是下一步研究的方向。

綜上知，準確識別診斷病害，選擇合適的藥劑能夠有效防治病害，迄今為止，對石榴病害的防治，學者們也篩選出了許多有效農藥，但大多都集中在單劑藥劑對病原菌抑制的研究上，至于化學農藥與生物農藥混配使用的研究報道少之又少，這也將是后續研究的一個方向。