合成四氫姜黃素結構表征及體外抗氧化性

杜淑霞 單 旺 徐 麗 滕曉煥 譚奇坤

(1. 廣東輕工職業技術學院輕化工技術學院，廣東 廣州 510300；2. 南海油脂工業〔赤灣〕有限公司，廣東 深圳 518000；3. 暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632)

四氫姜黃素是姜科植物姜黃根莖中分離出的姜黃素的氫化衍生物，無色無臭，因其良好的抗氧化、抗腫瘤和抗動脈粥樣硬化的作用和安全性，在食品工業中被用作食品添加劑，在制藥工業中可作為新型的醫藥原料和中間體。

目前國內外主要應用姜黃素通過化學法或微生物法制備四氫姜黃素[1-2]，但姜黃素需從植物中提取，成本較高，而以大宗化工中間體香蘭素作為起始原料成本相對較低，但未見相關報道。在活性研究方面，目前在綜合評價四氫姜黃素體外抗氧化能力、探討其在油脂中的抗氧化能力等方面也未見相關報道。

試驗擬以香蘭素、乙酰丙酮為起始原料，經克萊森縮合反應、氫化反應合成四氫姜黃素，采用紫外—可見分光光度(UV-VIS)、紅外光譜(IR)、核磁共振波譜(1H-NMR，13C-NMR)等方法對四氫姜黃素的純度和結構進行鑒定，從清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、總抗氧化能力、鐵離子還原能力、金屬離子鰲合能力方面，對四氫姜黃素的抗氧化能力進行測試，并采用GB/T 21121—2007動植物油脂加速氧化測試法測定了其在花生油、芝麻油、豬油等油脂中的抗氧化能力，并與常見抗氧化劑二丁基羥基甲苯(BHT)和維生素C(VC)進行對比。旨在探索四氫姜黃素的更有效的制備方法，為其更好的開發和應用提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

香蘭素、乙酰丙酮、三氧化二硼、硼酸三丁酯、三乙胺、DPPH、ABTS 、三吡啶三嗪(TPTZ)、氘代氯仿、過硫酸鉀、磷酸鈉、四水合鉬酸銨、氯化鐵、氯化亞鐵、菲啰嗪：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

鈀碳：分析純，廣州蘇喏化工有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水硫酸鈉、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、鹽酸、硫酸、冰乙酸：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

四氫姜黃素(純度≥98%)、二丁基羥基甲苯(BHT，純度≥99%)、維生素C(VC，純度≥99%)：分析標準品，美國Aladdin公司；

花生油、芝麻油、豬油：市售。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：EL104型，瑞士Mettler Toledo公司；

數顯智能控溫磁力攪拌器：SZCL-2型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

紫外—可見分光光度計：UV-1601型，北京北分瑞利分析儀器公司；

pH計：PHS-3E型，儀電科學儀器公司；

旋轉蒸發器：RE-52型，上海嘉鵬科技有限公司；

氧化穩定測定儀：734型，瑞士Metrohm公司；

紅外光譜儀：EQUNIOX-55型，德國Bruker公司；

核磁共振波譜儀：AVANCEIII型，瑞士布魯克公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 四氫姜黃素的合成 在100 mL圓底三口燒瓶中依次加入2.0 g乙酰丙酮、1.0 g三氧化二硼、20 mL乙酸乙酯，連接回流冷凝裝置，電熱套加熱至50 ℃，在磁力攪拌下反應4 h。反應完成后加入6.1 g香蘭素，9.2 g硼酸三丁酯，攪拌30 min。再將2 mL三乙胺溶于10 mL乙酸乙酯，在30 min內緩慢滴加至圓底三口燒瓶中，滴加完成后，反應溫度控制在50 ℃，反應4 h。加入30 mL鹽酸(0.4 mol/L)，升溫至60 ℃，攪拌反應2 h。將反應液轉移到分液漏斗，靜置30 min，充分分層后，收集乙酸乙酯層，水層用30 mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，經無水硫酸鈉干燥，抽濾得濾液，減壓蒸餾除去乙酸乙酯，將得到的黃色固體進行硅膠柱層析分離，洗脫體系為石油醚/乙酸乙酯，洗脫液比例(V石油醚∶V乙酸乙酯)為4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，進行梯度洗脫，收集相同組分，減壓蒸餾得到姜黃素，橙黃色結晶粉末，重2.5 g，產率67.90%。

稱取10.0 g反應產物姜黃素，加入高壓反應釜中，再依次加入2.5 g鈀碳(Pd-C，4%)，300 mL丙酮，先通入氮氣置換出反應釜中的空氣(重復3次)，再通入氫氣置換出氮氣(重復3次)，在機械攪拌(300 r/min)，壓力0.1 MPa，溫度25 ℃下反應6 h。反應完成后抽濾除去鈀碳，減壓蒸餾除去溶劑丙酮，將得到的淡黃色固體進行硅膠柱層析分離，洗脫體系為正己烷/乙酸乙酯，洗脫液比例(V正己烷∶V乙酸乙酯)為5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，進行梯度洗脫，收集相同組分，減壓蒸餾得到白色結晶粉末，即為四氫姜黃素，重6.8 g，熔點91～92 ℃(文獻[3]值：92～93 ℃)，產率67.30%。根據上述兩步反應的產率得到四氫姜黃素合成總產率為45.70%。合成路線見圖1。

圖1 四氫姜黃素的合成路線圖Figure 1 Synthetic route of tetrahydrocurcumin

1.2.2 純度分析 采用紫外—可見分光光度法。將四氫姜黃素標準品的乙醇溶液(質量濃度約為10 mg/L)用紫外—可見分光光度計進行全波長掃描，得到四氫姜黃素的最大吸收波長。在最大吸收波長處測定不同質量濃度的四氫姜黃素標準品乙醇溶液吸光度，以吸光度和質量濃度繪制標準曲線，得到回歸方程和相關系數。在最大吸收波長處測定已知質量濃度的產物的吸光度，根據產物吸光度和線性回歸方程計算出產物中四氫姜黃素含量。

1.2.3 四氫姜黃素的體外抗氧化性測定

(1) DPPH自由基清除能力：配制質量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測樣液。參考文獻[4]的方法，將0.3 mL各待測液和3 mL DPPH (0.1 mmol/L)充分混勻，室溫條件下避光靜置30 min后，在517 nm處測定吸光度。同時以乙醇代替試樣溶液做空白試驗。根據式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

X1——自由基清除率，%；

A1——試樣液吸光度；

A0——空白試液吸光度。

(2) ABTS自由基清除能力：配制不同質量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測樣液。參考文獻[5]的方法配制ABTS工作液，將0.3 mL各待測樣液與3 mL ABTS工作液充分混勻，室溫條件下避光靜置10 min后，在734 nm處測定吸光度。同時以乙醇代替試樣溶液做空白試驗。根據式(1)計算ABTS自由基清除率。

(3) 總抗氧化能力：配制不同質量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測樣液。參考文獻[6]的方法，將0.3 mL各待測樣液與3.0 mL試劑溶液(0.6 mol/L的硫酸、28 mmol/L的磷酸鈉、4 mmol/L的鉬酸銨各1 mL)充分混勻，置于95 ℃恒溫水浴90 min，冷卻后，在695 nm處測定吸光度。同時以乙醇代替試樣溶液做空白試驗。

(4) 鐵離子還原能力：配制不同質量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測樣液。參考文獻[7]的方法配制FRAP試液，取3 mL預熱的FRAP試液，加入0.3 mL的待測樣液，充分混合后于37 ℃水浴條件下避光反應30 min。于593 nm處測定吸光度。同時以乙醇代替待測樣液做空白試驗。

(5) 金屬離子鰲合能力：配制不同質量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測樣液。參考文獻[8]的方法，取2.4 mL各待測樣液于10 mL具塞試管中，加入30 μL FeCl2溶液(2 mmol/L)和60 μL菲啰嗪溶液(5 mmol/L)，充分混勻后在室溫放置10 min，在562 nm處測定吸光度。同時以乙醇代替試樣溶液做空白試驗。根據式(2)計算亞鐵離子螯合率。

(2)

式中：

X2——亞鐵離子螯合率，%；

A2——試樣液在562 nm處吸光度；

A3——空白試液在562 nm處吸光度。

1.2.4 四氫姜黃素在油脂中的抗氧化性測定 參照GB/T 21121—2007《動植物油脂 氧化穩定性的測定(加速氧化測試)》，采用氧化穩定測定儀測定四氫姜黃素在花生油、芝麻油、豬油中的抗氧化能力，并與BHT進行對比。試驗測定條件：油脂添加量為3.0 g，四氫姜黃素、BHT添加量為0.2 g/kg，空氣流速為10 L/h，加熱溫度為120 ℃。平行測定3次，取氧化誘導時間平均值。

1.2.5 數據處理 使用Excel和Origin 9.0軟件進行數據分析，試驗結果為3次平行測定的平均值。

2 結果與分析

2.1 產物純度

用紫外—可見分光光度計全波長掃描結果顯示，四氫姜黃素在239 nm處有最大吸收。配制質量濃度為2，4，6，8，10 mg/L的四氫姜黃素標準品乙醇溶液，在239 nm 處測定其吸光度，以吸光度為縱坐標、質量濃度為橫坐標繪制的標準曲線，如圖2所示，回歸方程和相關系數為：y=0.045 3x+0.009 5，R2=0.998 0。同時測得質量濃度為6 mg/L的產物在239 nm處的吸光度為0.275，經計算產物中四氫姜黃素含量為97.68%，即產物純度為97.68%。

圖2 四氫姜黃素標準曲線

2.2 產物紅外光譜表征

圖3 產物的紅外光譜圖Figure 3 IR spectrogram of product

2.3 產物核磁共振波譜分析

2.3.1 產物核磁氫譜 產物的核磁共振氫譜如圖4所示，

圖4 產物的1H-NMR譜圖Figure 4 1H-NMR spectrum of product

1H-NMR (500 MHz，CDCl3)分析如下：δ6.66～6.83(m，6H，H-2’ 5’ 6’ 2” 5” 6”)，δ5.42～5.51(m，2H，H-4)，δ3.86(s，6H，—OCH3)，δ2.53～2.86(m，8H，H-1 2 6 7)，其中化學位移為7.26的峰為溶劑峰CDCl3，與文獻[10]報道相同。

2.3.2 產物核磁碳譜 產物的核磁共振碳譜如圖5所示，13C-NMR(500 MHz，CDCLl3) 分析如下：δ198.18(C3，C5)，δ146.38(C3’，C3”)，δ143.95(C4’，C4”)，δ132.53(C1’，C1”)，δ120.78(C6’，C6”)，δ114.30(C2’，C2”)，δ110.89(C5’，C5”)，δ99.79(C4)，δ55.84(C3’—OCH3，C3” —OCH3)，δ40.36(C1，C7)，δ31.28(C2，C6)，其中化學位移為77的峰為CDCL3的溶劑峰，與文獻[10]報道相同。

圖5 產物的13C-NMR譜圖Figure 5 13C-NMR spectrum of product

產物的IR、1H-NMR及13C-NMR數據與目標化合物四氫姜黃素一致，確定合成產物為四氫姜黃素。

2.4 四氫姜黃素的體外抗氧化性試驗

2.4.1 清除DPPH自由基能力 由圖6可以觀察到，VC在試驗質量濃度范圍內有良好的線性關系，四氫姜黃素在0～60 mg/L的試驗質量濃度范圍內擁有良好的線性關系，而對于BHT，濃度較高時，BHT的質量濃度與自由基清除率線性較差，這時可以通過縮小抗氧化劑的濃度范圍，獲得線性關系良好的擬合曲線，并計算其清除50% ABTS自由基時四氫姜黃素質量濃度值(IC50值)。計算得出四氫姜黃素、BHT和VC對DPPH自由基的IC50值分別為(74.33±0.003)，(169.76±0.003)，(52.47±0.004) mg/L。IC50值越低，表明清除DPPH自由基能力越強，反之則越弱。由此可知，在試驗質量濃度范圍內，四氫姜黃素對DPPH自由基的清除能力稍低于VC，但明顯高于BHT。

圖6 四氫姜黃素、BHT、VC對DPPH自由基的清除能力

2.4.2 清除ABTS自由基能力 如圖7所示，3種抗氧化劑在試驗質量濃度范圍內具有較好的線性關系。計算得出，四氫姜黃素、BHT和VC對ABTS自由基的IC50值分別為(17.15±0.004)，(17.51±0.004)，(34.53±0.004) mg/L。由此可知，四氫姜黃素對ABTS自由基的清除能力與BHT接近，但明顯高于VC。

圖7 四氫姜黃素、BHT和VC對ABTS自由基的清除能力

2.4.3 總抗氧化能力 如圖8所示，隨著質量濃度的增大，各抗氧化劑的總抗氧化能力均呈增加趨勢，且四氫姜黃素的總抗氧化能力明顯高于BHT和VC。

圖8 四氫姜黃素、BHT和VC的總抗氧化能力

2.4.4 鐵離子還原能力 在低pH的溶液中，Fe3+和TPTZ會形成Fe3+-TPTZ(Fe3+-三吡啶三嗪)配合物，在有抗氧化劑存在時，配合物被還原成Fe2+-TPTZ，使溶液呈深藍色，在593 nm處有最大光吸收，且吸光度越大，表明對鐵離子還原能力越強。由圖9可知，四氫姜黃素的鐵離子還原能力顯著高于BHT和VC，與文獻[11]報道結果一致。

圖9 四氫姜黃素、BHT和VC的鐵離子還原能力

2.4.5 金屬離子鰲合能力 如圖10所示，從鰲合趨勢上看，隨著四氫姜黃素質量濃度的增大，其亞鐵離子螯合能力呈上升趨勢。而隨著BHT和VC質量濃度的增大，其對亞鐵離子螯合能力反而減弱；從鰲合效果上來看，在質量濃度為1 000 mg/L時，四氫姜黃素對亞鐵離子螯合能力雖然顯著高于BHT和VC，但螯合率低于25%，可見四氫姜黃素對亞鐵離子的螯合能力較弱。

圖10 四氫姜黃素的亞鐵離子鰲合能力Figure 10 Ferrous ions chelating activity oftetrahydrocurcumin

2.4.6 四氫姜黃素在油脂中的抗氧化性 由于VC是水溶性抗氧化劑，在油脂中的溶解性較差，因此只選擇脂溶性的BHT與四氫姜黃素進行對比。由表1可知，添加了四氫姜黃素的3種油脂，其氧化誘導時間皆長于未添加抗氧化劑的空白組，表明四氫姜黃素在這3種油脂中皆具有抗氧化作用，且在豬油中的抗氧化效果更明顯。

表1 油脂的氧化誘導時間?

3 結論

以香蘭素為起始原料，經克萊森縮合反應、鈀催化氫化反應制備四氫姜黃素，經紫外—可見分光光度、紅外光譜、核磁共振波譜對其結構進行確證。試驗結果表明，合成路線可行且路線短，合成總產率達45.70%，產物純度為97.68%，與現有制備方法相比，試驗方法原料成本低，具有潛在的價格優勢。后續將進一步優化反應條件，擴大合成規模，以期實現產業化。

四氫姜黃素清除DPPH自由基的能力明顯高于二丁基羥基甲苯；清除ABTS自由基的能力接近于二丁基羥基甲苯且明顯高于維生素C，主要是由于其結構中酚羥基的存在。此外，四氫姜黃素的總抗氧化能力和鐵離子還原能力均明顯高于二丁基羥基甲苯和維生素C，但對亞鐵離子的鰲合能力較弱，由此可知，四氫姜黃素的抗氧化能力主要體現在清除自由基和化學還原方面，與亞鐵離子螯合能力的相關性不大。四氫姜黃素在花生油、芝麻油、豬油等油脂中具有一定的抗氧化能力，并且對豬油的抗氧化效果最明顯，作為一種以天然產物為導向的抗氧化劑，安全性較好，有良好的應用前景。