紅車軸草不同部位多酚提取工藝優化及抗氧化活性研究

李欣燃 王緒英 許子怡 潘永淇 翁貴英

(六盤水師范學院生物科學與技術學院，貴州 六盤水 553000)

紅車軸草，又名紅花車軸草、紅三葉，為豆科蝶形花亞科車軸草族車軸草屬(Trifolium)多年生草本植物[1-2]，含有異黃酮、維生素、糖類、蛋白質、脂類和豆香素等成分[3-4]，具有抑菌[5]、抗癌[6]、預防骨質疏松[7]、改善動脈血管柔性[8]、調節免疫[9]、神經保護作用[10]以及調節雌激素樣作用[11]等多種生物活性。研究表明，紅車軸草可通過調節NF-κB和NRF2信號通路[12]、參與調控抗氧化作用基因表達[13]、清除血液中的過氧化氫酶、提高血液中超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性[14]等多種方式發揮抗氧化活性；還可以激活機體免疫反應，顯著提高血清中IgG和IgM含量[15]，使免疫細胞因子濃度增加[16]；同時促進不飽和脂肪酸的攝入[17-18]。

在國外，紅車軸草是一種非常受歡迎的食品，其浸膏已被用于軟飲料、冰制品、糖果、焙烤食品及三葉草型香精配方等方面，以其為原料的保健食品也已進入國際市場[19]。而在中國，盡管紅車軸草資源豐富，卻較少被利用。植物多酚對人體健康具有重要作用[20-21]，而紅車軸草中含有豐富的多酚類化合物，是其發揮生物活性的重要物質基礎。目前已有關于紅車軸草內多酚鑒定的相關研究[22-23]，而有關紅車軸草多酚提取及抗氧化性的研究尚未見報道。研究擬采用響應面法對紅車軸草多酚提取工藝進行優化，同時通過檢測其對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除效率評價其抗氧化活性，為紅車軸草的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅車軸草：六盤水本地品種，2020年5月采于六盤水師范學院校內；

酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸對照品、沒食子酸對照品、鄰苯三酚以及水楊酸等均為國產分析純。

1.2 主要儀器

超聲波清洗機：SB-800DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度計：UV-1800型，上海菁華科技儀器有限公司；

電子分析天平：ATY124型，沈陽龍騰電子標量儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：BGZ-30型，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料預處理 取洗凈的紅車軸草莖、葉、花，烘干粉碎，過40目篩，備用。

1.3.2 多酚類化合物測定 采用酒石酸亞鐵比色法[24]。

1.3.3 標準方程繪制 取沒食子酸0.125 g定容于250 mL蒸餾水中，得0.5 mg/mL的對照品溶液備用，準確吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL對照品溶液于25 mL容量瓶中，按1.3.2的方法測定540 nm處吸光度，測得標準曲線回歸擬合方程為y=14.56x+0.002(R2=0.998)。

1.3.4 多酚得率計算 按式(1)計算多酚得率。

(1)

式中：

c——多酚得率，%；

m1——提取物總多酚質量，g；

m2——樣品干粉質量，g。

1.3.5 紅車軸草各部位多酚含量比較 將紅車軸草各部位(莖、葉、花)分別按如下條件進行多酚提?。毫弦罕?∶80 (g/mL)，提取時間20 min，乙醇體積分數40%，超聲功率800 W，提取溫度50 ℃，進行3次重復試驗，選取多酚含量最高的部位作為后續試驗原料。

1.3.6 提取物單因素試驗

(1) 料液比：固定超聲時間20 min，乙醇體積分數40%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，考察料液比[1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90 (g/mL)]對多酚得率的影響。

(2) 提取時間：固定料液比1∶70 (g/mL)，乙醇體積分數40%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，考察提取時間(10，20，30，40，50 min)對多酚得率的影響。

(3) 乙醇體積分數：固定料液比1∶70 (g/mL)，超聲時間20 min，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，考察乙醇體積分數(20%，30%，40%，50%，60%)對多酚得率的影響。

1.3.7 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，以葉部多酚得率為響應值，利用Box-Behnken原理進行響應曲面試驗設計，優化其多酚類化合物提取工藝。

1.3.8 抗氧化性試驗 分別以超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率為指標，測定紅車軸草中多酚提取物的抗氧化活性。

1.3.9 方法學驗證

(1) 重復性試驗：按照曲面響應法的最優條件提取紅車軸草葉多酚，進行5次平行試驗，并檢測其吸光度。

(2) 穩定性試驗：取紅車軸草葉同批次的多酚提取物各1 mL，分別避光放置0.0，0.5，1.0，4.0，8.0 h后，按1.3.2方法進行檢測。

(3) 加標回收率試驗：參照高林曉等[25]的方法，在最優提取條件下制備紅車軸草葉多酚提取物，取1 mL待測液至25 mL的棕色容量瓶中，再取1 mL待測液和1 mL沒食子酸對照品至25 mL棕色容量瓶中，按1.3.2的方法測定各樣品吸光度并進一步計算其多酚含量，進行5次平行試驗。

1.3.10 數據處理 通過Design-Expert 8.0.6和Excel軟件進行試驗設計、數據處理及繪圖，數據均為3次平行試驗所得。

2 結果與分析

2.1 紅車軸草各部位多酚含量比較

由圖1可知，紅車軸草花、葉和莖多酚平均得率分別為1.82%，2.17%，0.25%，其葉部多酚含量顯著高于莖(P<0.01)和花(P<0.001)，故選擇紅車軸草葉部作為后續試驗研究對象。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對紅車軸草葉多酚得率的影響 由圖2可知，當料液比<1∶70 (g/mL)時，紅車軸草葉多酚得率逐漸增加，當料液比≥1∶70 (g/mL)時，多酚得率基本不再變化，說明在料液比為1∶70 (g/mL)時，紅車軸草葉中多酚成分幾乎達到完全溶解。綜合考慮，選擇最佳料液比為1∶70 (g/mL)。

**表示差異顯著(P<0.01)；***表示差異極顯著(P<0.001)

圖2 料液比對紅車軸草多酚得率的影響

2.2.2 提取時間對紅車軸草葉多酚得率的影響 由圖3可知，當提取時間為20 min時，多酚得率達最大，可能是此時葉部多酚類化合物基本全部析出，且隨著提取時間的進一步延長，溶劑內雜質析出增多，并與多酚類化合物發生鍵合，導致其得率降低。故后續選擇最佳提取時間為20 min。

圖3 提取時間對紅車軸草多酚得率的影響Figure 3 Extraction time’s influence on the polyphenols’yield of Trifolium pratense Linn

2.2.3 乙醇體積分數對紅車軸草葉多酚得率的影響 由圖4可知，當乙醇體積分數為40%時，紅車軸草葉多酚得率達最大，且隨著乙醇體積分數的進一步增加得率反而降低。這可能是40%乙醇體積分數與其葉部多酚類化合物極性最為接近，根據相似相溶原理，故此濃度下，葉部多酚析出量達到最大，后續選擇最佳乙醇體積分數為40%。

圖4 乙醇體積分數對紅車軸草多酚得率的影響

2.3 響應面分析

2.3.1 回歸模型建立與分析 試驗因素水平表見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素及水平

對表2的試驗數據進行多元回歸擬合，得到紅車軸草葉多酚得率對料液比、提取時間、乙醇體積分數的二次線性回歸方程為：

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

R=-10.233 25+0.138 4A+0.046 65B+0.340 05C+1.675×10-3AB-1.725×10-3AC+6.25×10-4BC-6.975×10-4A2-4.497 5×10-3B2-2.847 5×10-3C2。

(2)

由表3可知，回歸模型的F值為88.11，P<0.000 1，該模型達到極顯著水平；失擬項P=0.512 7，表明其與真實值之間擬合性較好。一次項A、B，交互項AB、AC和二次項B2、C2極顯著(P<0.01)，表明其對紅車軸草葉多酚得率影響很大，一次項C、交互項BC和二次項A2差異顯著(P<0.05)，表明其對紅車軸草葉多酚得率影響較大。由F值可知，各因素對多酚得率影響程度依次為B(提取時間)>C(乙醇體積分數)>A(料液比)。

表3 紅車軸草響應面結果方差分析表?

2.3.2 因素交互作用分析 由圖5可知，響應面曲面坡度變化陡峭，說明料液比和提取時間、料液比和乙醇體積分數的交互作用較強，對紅車軸草葉多酚得率影響較大；而提取時間與乙醇體積分數的響應面曲面坡度變化較陡，說明其交互作用一般，對紅車軸草葉多酚得率影響一般。

圖5 各因素交互作用對多酚得率的影響Figure 5 Interaction effects of reaction conditions on the yield of polyphenols

2.3.3 工藝優化與驗證 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析得到紅車軸草葉多酚的最優提取工藝為料液比1∶78.94 (g/mL)，提取時間22.55 min，乙醇體積分數38.26%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，此時多酚得率預測值為2.26%。為了操作方便，將其工藝條件修正為料液比1∶79 (g/mL)，提取時間23 min，乙醇體積分數38%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，在該條件下進行5次平行實驗，多酚得率為2.31%，與預測值的相對誤差較小，說明該試驗方法準確，工藝可靠。

2.3.4 抗氧化性檢測 由圖6可知，紅車軸草葉多酚提取物對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力與維生素C的變化趨勢基本一致，但整體略低于維生素C，二者的IC50值分別為0.419，0.428 mg/mL，抗氧化能力清除率均超過50%，可認為其葉部多酚具有較好的抗氧化性。劉寶劍[26]研究發現，紅車軸草黃酮提取物對羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為44.06，54.57 mg/mL，說明紅車軸草中多酚的抗氧化活性顯著高于黃酮。王曉燕[27]發現，紅車軸草異黃酮對羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為0.346，0.282 mg/mL，其抗氧化活性高于試驗中的多酚提取物，可能是因為多酚提取物中含有脂溶性成分，而該成分的抗氧化活性較低[28]，使提取物整體的抗氧化活性降低。

圖6 紅車軸草葉多酚提取物和維生素C的抗氧化能力比較Figure 6 Comparison of antioxidant capacity between polyphenol extraction and vitamin C

2.4 方法學驗證

2.4.1 重復性試驗 經計算，按響應面法的最優條件提取紅車軸草葉多酚，其相對標準偏差(RSD)較小，為1.73%，說明該試驗重復性較為可靠。

2.4.2 穩定性試驗 按1.3.2方法檢測發現，紅車軸草葉多酚提取物的吸光度基本無明顯變化，其RSD為0.71%，說明紅車軸草葉的多酚提取物在避光放置8 h內是穩定的。

2.4.3 加標回收率試驗 由表4可知，紅車軸草葉總多酚類化合物的平均回收率為99.44%，RSD為1.38%，說明該試驗對紅車軸草多酚提取物檢測方法準確。

表4 加標回收率試驗結果

3 結論

采用超聲輔助提取的方法對紅車軸草莖、葉和花中多酚類化合物進行提取比較，發現葉中多酚含量最高。經響應面法優化得到紅車軸草葉多酚提取最佳工藝參數為料液比1∶79 (g/mL)，提取時間23 min，乙醇體積分數38%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，此條件下多酚得率為2.31%。該提取物對羥自由基及超氧陰離子自由基的IC50值分別為0.419，0.428 mg/mL，可認為其葉部多酚具有較好的抗氧化性。后續應對多酚提取物進行分離純化以及鑒定，同時對獲取的純化物進行抗氧化活性測定或者其他生物學功能探究。