高效液相色譜法同時測定飲料中的苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉

◎ 馮俊富，朱飛如，余開科，駱海春

（北海市食品藥品檢驗所，廣西 北海 536000）

根據我國食品衛生法（1995年）的規定，食品添加劑是為改善食品色、香、味等品質，以及為防腐和加工工藝的需要而添加到食品中的人工合成或天然物質。目前我國食品添加劑有23個類別，2 000多個品種，包括酸度調節劑、抗氧化劑、漂白劑、膨松劑、著色劑、護色劑、增味劑、營養強化劑、防腐劑、甜味劑和增稠劑等[1]。其中防腐劑和甜味劑在目前食品加工過程中應用廣泛[2]。

隨著時代的發展，飲料行業是我國發展最快的行業之一，飲料數量和品種不斷增加，食品添加劑對推動飲料市場發展起著重要作用[3]。為抑制微生物的生長、延長飲料的貨架期，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸常作為防腐劑添加在飲料中[4]。糖精鈉是食品工業中常用的合成甜味劑，糖精鈉的甜度比蔗糖甜300～500倍，且提供的熱量較低，亦受到人們的青睞[5]。甜味劑和防腐劑多以苯、甲苯、萘等化工產品為原料，經有機反應化合而成，其本身不能向人體提供營養物質，大多具有一定的毒性，甚至在人體內可能轉換成致癌物質。在其生產過程中還有可能混入砷、鉛等重金屬[6]?！妒称钒踩珖覙藴?食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）對食品添加劑使用含量以及范圍均有嚴格限制[7]。近年來，隨著食品工業快速發展，食品質量問題越來越突出，尤其是在食品加工中，超量或違規使用添加劑現象屢禁不止[8]。隨著飲料品種和添加劑種類的日益增多，存在食品添加劑濫用的趨勢，對人體健康造成一定的風險。為保障食品安全，需要對飲料中食品添加劑的含量進行檢測。目前參照的標準包括《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB/T 5009.28—2016）[9]、《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）[10]。近年來，有關食品添加劑的檢測方法研究報道層出不窮，在檢測靈敏度和準確度方面有所提高。敬小麗等[11]建立飲料中苯甲酸、山梨酸鉀2種防腐劑同時檢測的高效液相色譜法，牟霄等[12]采用超高效液相色譜法同時測定飲料中14種食品添加劑，張劍峰等[13]采用超高效液相色譜法同時測定飲料中的山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、糖精鈉和安賽蜜。

目前國家標準中對食品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉的檢測方法較多，本研究對高效液相色譜法測定苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉的檢測波長、流動相種類及pH等檢測條件進行摸索研究，以便為4種添加劑的同時檢測提供更簡便易行的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（美國安捷倫科技有限公司）；XA205DU電子天平[MAX 81 g/220 g，d=0.01 mg/0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.1.2 試劑與樣品

甲醇（色譜純，美國Merck公司）；乙酸銨（優級純，天津市光復科技發展有限公司）；水中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準溶液（A2007199，1 000 μg·mL-1，北京壇墨質檢科技有限公司）；脫氫乙酸（C0008887，99.9%，BePure）。

20批不同廠家飲料。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：ACE Excel 5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：230 nm；流動相A：0.02 mol·L-1乙酸銨（用氨水調pH=7.5），流動相B：甲醇，A∶B=95∶5（V∶V）。

1.2.2 標準溶液的配制

脫氫乙酸標準儲備液。精密稱取脫氫乙酸標準品0.050 48 g于50 mL容量瓶中，加5 mL氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）溶解后，加水稀釋至刻度，搖勻，作為脫氫乙酸標準儲備液。

混合標準工作液。分別準確吸取水中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準溶液（1 000 μg·mL-1）和脫氫乙酸標準儲備液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻作為混合標準工作液。隨后以混合標準工作液為基體逐級稀釋得混合系列標準溶液，其中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉濃度為0 μg·mL-1、1 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1；脫氫乙酸濃度為0 μg·mL-1、1.009 μg·mL-1、2.017 μg·mL-1、5.043 μg·mL-1、10.086 μg·mL-1、20.172 μg·mL-1、50.430 μg·mL-1、100.859 μg·mL-1的混合系列標準溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

樣品充分混勻，精密稱取樣品2.00 g，加水約20 mL，超聲提取20 min，冷卻至室溫，用水定容至25 mL，搖勻，過濾。

1.2.4 空白溶液的制備

除未加樣品外，其他照1.2.3操作制備，作為空白溶液。

2 結果與分析

2.1 方法優化

2.1.1 流動相的選擇

有文獻報道苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉檢測所用的流動相有甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（5∶95）[14]，甲醇和磷酸二氫銨（100 mmol·L-1）梯度洗脫[12]；乙腈-20 mmol·L-1磷酸二氫鉀[15]，甲醇和乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）梯度洗脫[16-18]；甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（7∶93）[19]，乙腈和乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）梯度洗脫[20]；甲醇與乙酸銨-無水硫酸鈉-三氟乙酸混合液（28∶72）[21]，甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（10∶90）梯度洗脫[22-23]。

從以上文獻可知，對流動相選擇較多的是甲醇-0.02 mol·L-1乙 酸 銨 系 統，GB 5009.28—2016和GB 5009.121—2016中 也 采 用 了 甲 醇-0.02 mol·L-1乙酸銨系統，基于實驗的穩定性以及對色譜柱、檢測器和實驗人員的保護考慮，本研究流動相選用甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨系統。

2.1.2 流動相pH的選擇

通過考察0.02 mol·L-1乙酸銨的pH值，將0.02 mol·L-1的乙酸銨調節pH值為6.0、6.5、7.5、8.0和未調節pH值，以0.02 mol·L-1的乙酸銨∶甲醇（95∶5）分別進樣，結果發現pH值為7.5時，分離度較好，故選擇pH值為7.5的乙酸銨。

2.1.3 檢測波長的確定

用二極管陣列檢測器在190～400 nm下對各標準溶液進行掃描，發現苯甲酸在224 nm處有最大吸收，如圖1所示；山梨酸在254 nm處有最大吸收，如圖2所示；脫氫乙酸在230 nm處有最大吸收，如圖3所示；糖精鈉在204 nm處有最大吸收，如圖4所示；根據各目標物紫外光譜圖，綜合考慮選擇230 nm作為檢測波長。

圖1 苯甲酸紫外光譜圖

圖2 山梨酸紫外光譜圖

圖3 脫氫乙酸紫外光譜圖

圖4 糖精鈉紫外光譜圖

2.2 專屬性實驗

混合標準工作液、供試品溶液、空白溶液色譜圖分別見圖5、圖6、圖7，結果表明，空白溶劑在目標物出峰處無雜質干擾，目標物之間分離度良好。

圖5 混合標準工作液色譜圖

圖6 供試品溶液色譜圖

圖7 空白溶液色譜圖

2.3 線性范圍和靈敏度

在1.2.1項的色譜條件下，對苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉混合系列標準溶液進行測定，在0～100 μg·mL-1范圍內，線性關系良好，以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，回歸方程、相關系數、檢出限及定量限見表1。結果表明，本方法檢出限和定量限均小于GB 5009.28—2016和GB 5009.121—2016中的限量，靈敏度較高。

表1 4種添加劑的回歸方程、相關系數、檢出限及定量限表

2.4 重復性實驗

添加10 μg·mL-1的混合標準溶液的空白飲料樣品按1.2.1項下色譜條件進行檢測，分別連續進樣6次，6次測定的相對標準偏差結果見表2，結果表明，本法的重復性良好。

表2 4種添加劑的重復性實驗結果表（n=6）

2.5 加標回收實驗

準確稱取空白飲料樣品，分別精密加入水中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準溶液（1 000 μg·mL-1）和脫氫乙酸標準儲備液0.05 mL、0.25 mL、0.50 mL依法提取，3個濃度水平的溶液各3份，按1.2.1節色譜條件進行檢測，其回收率見表3，結果表明回收率良好。

表3 4種添加劑加標回收率實驗結果表（n=3）

2.6 實際樣品檢測

選擇20批飲料按1.2方法進行檢測，其中有10批未檢出，10批檢出苯甲酸或山梨酸，結果見表4。

表4 實際樣品檢測含量表（單位：mg·kg-1）

3 結論

本實驗方法建立了高效液相色譜法同時測定飲料中的苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉，此方法操作簡單，結果準確，重復性好，靈敏度高，可為同時檢測飲料中的4種食品添加劑提供參考。