中國西北地區102例兒童Duchenne型肌營養不良基因突變及家系分析研究

楊 樂，趙斯鈺，鄭妍妍，李桃利，宋西曉，王 燕

（西安市兒童醫院神經內科，西安 710002）

Duchenne 型肌營養不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是最常見的 X 連鎖隱性遺傳肌肉病，中國大陸發病率約為1/4 560[1]。該病多于3～5歲隱匿發病，進行性加重的肌萎縮及肌無力，臨床表現為運動發育落后或運動障礙、Gower 征陽性、雙下肢近端無力，走路緩慢，易跌跤，大多數的患兒存在腓腸肌假性肥大及心肌損害，少數有智力障礙。多于 20 歲前死于呼吸、循環衰竭[2]。目前DMD 缺乏有效的治療措施，因此對DMD 基因突變的檢測是控制和降低DMD 發病率的關鍵。本研究分析了就診于西安市兒童醫院的102 例DMD 患者基因特點，旨在了解西北地區DMD 患者基因譜，為DMD 的早期診斷及有效治療措施提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2014年7月至2020年6月之間在本院神經內科門診的102 例臨床診斷為DMD患兒，父母否認近親結婚，所有DMD 患者均來自西北地區，包括陜西、甘肅、青海、寧夏和新疆，就診年齡1月～14 歲，平均年齡為4.60±3.59 歲。

入組標準：①多數嬰幼兒時期運動發育較正常同齡兒落后；②隱匿起病，臨床表現進行性加重，乏力，上樓困難，肌無力，下肢重于上肢，鴨步，Gower 征陽性，腓腸肌假性肥大；③血清肌酸激酶顯著增高，高于正常數十到數百倍；④肌活檢免疫組織化學染色提示抗肌萎縮蛋白缺失；⑤肌電圖提示為肌源性損害；⑥排除其它神經肌肉系統疾病等。

1.2 儀器和試劑 主要儀器有擴增產物采用的遺傳分析儀(ABI 3500 XL,MRC-Holland 公司)，主要試劑有SALSA MLPA P034 和P035 探針組（MRCHolland 公司)，高通量測序儀（Illumina）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 提?。航浿橥夂蟪槿?02例患兒及患兒母親靜脈血各3ml 裝入EDTA-K2抗凝試管中，使用全血基因組DNA 提取試劑盒，進行基因組DNA 提取。

1.3.2 多重連接依賴探針擴增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）檢測:MLPA技術是檢測DMD 基因缺失/ 重復突變的主要方法[3-4]。利用SALSA MLPA P034 和P035 探針組進行DMD 基因79 個外顯子拷貝數變異檢測。數據采用Coffalyser 軟件(MRC Holland)分析。結果判斷標準：對應峰值在 0.7～1.3 提示拷貝數正常，0.3～0.7 提示雜合性缺失，1.3～1.7 提示雜合性重復，0 提示純合缺失，1.7～2.3 提示重復突變[5]。

1.3.3 二代基因測序（next-generation sequencing，NGS）檢測：可以檢測DMD 基因點突變、微小缺失或插入突變等突變[6]，使用高通量測序儀測序。測序數據采用 Next Gene V2.3.4 軟件與 UCSC hg19人類參考基因組序列進行比對和鑒別遺傳變異，并收集目標區域的覆蓋度和平均測序深度等質量參數。神經肌肉病相關基因測序目標區域平均測序深度為150X，其中目標序列的98%測序深度達20X以上。

1.3.4 Sanger 測序方法：用于驗證DMD 患者和攜帶者中致病性點突變[7]。

1.3.5 根據患者基因突變類型選擇相應的檢測方法對其母親及家系成員進行基因檢測。

2 結果

2.1 DMD 基因一般情況 102 例DMD 患兒經MLPA 檢測94 例患者存在DMD 基因致病性變異，包括片段缺失87 例（85.29%），片段重復7 例（6.86%）。MLPA 檢測陰性的8 例（7.84%）患者進行NGS 檢測，均為點突變。對所有患者母親進行驗證，74 例（72.55%）患兒母親攜帶該基因突變，28 例（27.45%）為新發。14.9%的患者存在陽性家族史。

2.2 DMD 基因缺失/重復分析 見表1。87 例DMD 基因片段缺失中，19 例為單外顯子缺失，45號外顯子缺失最常見；18 例為3 個外顯子缺失，最常見為48～50 區；29 例為大片段缺失（≥6 個外顯子），其中央區存在一個缺失的熱點區域，外顯子44～54 區，且存在1 例79 個外顯子全部缺失患者。

表1 87 例DMD 基因缺失區域

7 例DMD 基因片段重復中，3 例為外顯子2重復，2 例為外顯子16 重復，1 例為外顯子44～60區域重復，1 例同時存在2 個重復區域，包括外顯子44～47 區域與61～65 區域重復，2 號外顯子為大片段重復突變的熱點區域。見圖1、圖2。

圖1 94 例DMD 基因缺失/重復頻率

圖2 94 例DMD 基因缺失/重復定位

2.3 DMD 基因點突變分析 見表2、表3。8 例DMD基因點突變，4例為無義突變，1例為插入突變，1 例為缺失突變，2 例為剪切突變，且其中3 例為新發突變，而且這8 例突變均為致病突變。

表2 DMD 基因8 例點突變一覽表

表3 DMD 基因3 例新發突變

2.4 DMD 基因家系 見圖3。本研究進行了2 個DMD家系的基因檢測，家系1先證者為第Ⅲ代男性，DMD 基因為45～51 號外顯子大片段缺失突變，第Ⅰ代男性DMD 基因為45 號外顯子缺失，第Ⅱ代女性為攜帶，位于45～47 號外顯子缺失，該家系突變位點為缺失突變的熱點區域。家系2 先證者為第Ⅲ代男性，DMD 基因為17～18 號外顯子重復，第Ⅰ代男性DMD 基因為17～18 號重復，第Ⅱ代2 位女性均為攜帶，分別位于2 號重復和17～18 號缺失，該家系突變主要以重復突變為主，且存在片段的重復和缺失。

圖3 2 例先證者家系圖

3 討論

DMD 以緩慢進行性加重的對稱性肌無力和肌萎縮為特征，主要累及骨骼肌，可伴智力障礙[8]和心肌損害，預后不良[9]。

DMD 基因是目前人類已知的最大的基因，有79 個外顯子，全長約2.4Mb[10]。DMD 患者抗肌萎縮蛋白(dystrophin)表達缺陷導致細胞膜不穩定[11，4]，細胞內的肌酸激酶等外漏，肌細胞壞死，導致脂肪組織和纖維結締組織增生。DMD 基因突變主要分為三種類型：外顯子缺失或重復突變、點突變（包括堿基的置換、重復、缺失或插入）和剪切區突變[12]。

本研究收集西北地區DMD 患者102 例，72.5%為母系遺傳，與既往研究比例相似。但需要注意的是：本研究中陽性家族史比例較高，考慮這些患者多居住在偏遠或貧困地區，缺乏優生優育的相關知識，因此需加強對西北地區健康教育、遺傳咨詢工作，同時進行有效的產前診斷，以優化DMD 患者的出生，提高西北地區的人口質量。

文獻報道，DMD 基因片段缺失為65%～70%，重復為6%～10%，兩者共約 80%，而點突變約為20%[13]。本研究中片段缺失為85.29%，較相關研究比例多，而點突變比例少，是否和地域有相關性，有待樣本數量擴增后進一步驗證。在片段缺失的類型中， MAGRI 等[14]人研究發現DMD 基因的單外顯子缺失占24%，YANG 等[15]人發現，中國人群中最普遍的單外顯子缺失為45 和51，本研究單外顯子缺失占21.84%，外顯子45 是缺失最頻繁的，與文獻報道基本一致。

既往研究發現DMD 缺失突變集中在兩個熱點區域，最常見的為中心結構區，即外顯子45～54 區域，第二個為5’端區域，即外顯子3～22 區域。重復熱點常涉及5’端區域[16]，即外顯子2～22 區域和外顯子2 區域[17]。本研究發現缺失與重復突變分別存在一個熱點區域，外顯子44 ～54 區域和外顯子2區域，與既往研究略有偏差，可能與地域分布有關。本研究中的8 例點突變，50%為無義突變，且C>T是最常見的堿基替換，與鐘京梓[18]報道的基本一致。

在DMD 家系報道中，陸盈等[19]報道了一例DMD 家系，先證者及單卵雙生胞弟均為外顯子45～50 區域缺失突變，考慮為新發突變所致。洪莎等[20]報道了2 例家系，家系1 屬于框外突變，屬于DMD 的可能性大，家系2 屬于框內突變，屬于BMD 的可能性大。本研究中2 個家系，第Ⅰ代男性臨床癥狀輕，均為框內突變。第Ⅲ代男性為大片段缺失/重復突變，該突變破壞了閱讀框的完整性，故臨床癥狀較重。

基因檢測已成為DMD 最新診治指南中的新金標準[21]，故進行全面性基因檢測，擴大西北地區DMD 疾病基因譜，可以為患者帶來新的治療希望。