長鏈非編碼RNA LINC00222對肺腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及作用機制的研究

胡艷正，牛彥杰，石鵬飛

（咸陽市第一人民醫院胸外科，陜西咸陽 712000）

非小細胞肺癌（non-small cell lung canter，NSCLC）是臨床常見的惡性腫瘤，約占肺癌類型的85%，而肺腺癌是NSCLC 的一種，約占NSCLC 的20%～30%[1]。肺腺癌早期癥狀不明顯，臨床檢出率低，晚期轉移患者較多，預后不佳。因此對其進行積極防治已成為醫學領域亟待解決的重要問題。既往研究表明[2-3]，長鏈非編碼RNA（LncRNAs）能夠調控基因表達，參與腫瘤細胞的多種生物學行為，影響癌癥的發生發展。且越來越多研究證明[4-6]，LncRNAs 在腫瘤進展和轉移中扮演重要角色。故基于分子生物學角度探究肺腺癌的發生發展機制，找尋特異性治療靶點，對臨床攻克具有積極意義。LncRNA LINC00222 是位于6 號染色體，具有5 個外顯子的非編碼RNA。既往相關研究指出[7]，肝母細胞瘤中LINC00222 低表達，參與調控腫瘤的發生發展進程，可作為評估細胞生物學行為及預后的預測標志。然目前有關LINC00222 在肺腺癌發生發展中的生物學功能及分子機制尚不明確且相關研究報道較少。因此，本研究通過構建LINC00222過表達載體，探究了其對肺腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響及分子作用機制，以期探尋新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年10月～2020年10月期間在我院行手術治療的34 例肺腺癌患者的癌組織及其對應癌旁正常組織，所有組織由術中獲取經病理確診后制成組織標本于低溫液氮中保存備用。人肺腺癌細胞系A549，LTEP-a-2 及人正常肺胚細胞系MRC-5 購自中國科學院細胞庫，于含10 ml/dl胎牛血清1640 培養液，37℃，5 ml/dl CO2培養箱孵育培養，每48 h 傳代一次。

1.2 試劑及儀器 1640 培養液購自美國GIBCO公司；pCDNA3.1 載體、empty vector 空載體及GSK-3β 3’UTR 野生型（WT）或突變型（MUT）雙熒光素酶報告基因載體購自中國金斯瑞公司；Lipo2000，Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；M-MLV 逆轉錄反應試劑盒購自日本Takara 公司；CCK-8 反應液、Hoechst33342 10 染液購自日本 Dojindo 公司；酶標儀購自美國 Bio-Tek 公司；Matrigel 購自美國 BD 公司；倒置熒光顯微鏡購自美國Leica 公司；免疫印跡鼠抗兔p-GSK-3β，β-catenin，GSK-3β單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記二抗購自美國 CST 公司； ECL 發光液購自中國碧云天公司；RIP 試劑盒購自美國 Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 LINC00222 生物信息學分析：通過檢索生物信息學網站及Gene Bank 數據庫，利用Primer5.引物設計軟件以GAPDH 為內參檢索設計LINC00222 引物序列，LINC00222 上游 ：5’-GGCTCTGATCAGGCTAAGAG CA-3’，下游：5’-TGTTCGTCTGTAACAGGTGTCATGG-3’；GAPDH 上游：5’-TGGACGACTAACTGGTTAG G-3’，下游：5’-GGTATGCACTGTAGTCATCAG-3’，均由GenePharma 公司合成，于-20℃保存。

1.3.2 LINC00222 過表達載體及質粒構建：將LINC00222 序列全長連接至pCDNA3.1 載體構建pCDNA- LINC00222 質粒，同時構建empty vector空載體作為對照。融化的Jm109 感受態細胞加入構建質粒進行轉化挑取白色克隆，于LB 培養液震蕩過夜培養；將菌液移入EP 管離心棄上清，分次加入Buffer S1/S2/S3 反應獲得白色沉淀，離心，棄甩出液；分次加入Buffer W1 /W2/W3 液，離心，棄甩出液，獲得質粒DNA 并測定其濃度及純度。

1.3.3 細胞轉染實驗：轉染前一天以2×105個/孔接種于6 孔板，每孔加入無抗培養液；雙無培養液稀釋質粒DNA， Lipo2000 溶于雙無培養液，室溫混勻靜置制成轉染液加入每孔進行轉染，每4～6 h 更換一次培養液，37℃，5ml/dl CO2培養箱培養12～48 h 行基因表達檢測。

1.3.4 實時熒光定量PCR 實驗：采用Trizol 試劑盒提取組織、細胞總RNA 并檢測其濃度及純度；按照M-MLV 逆轉錄反應試劑盒及其反應體系進行逆轉錄獲取cDNA，并以此為模板進行PCR 擴增及基因檢測。引物由 Invitrogen 公司合成，LINC00222 引物序列上游：5’-GCGTGTGTACTGCCAAGGAGCA-3’，下游：5’TGTTCGTGTCTAAGAGCTGTCAACG-3’；內參GAPDH 序列上游：5’-TGCACGACGAACTG CTTACG-3’，下游：5’-GCGATGCACTGTGCTCAT CAG-3’。反應條件95℃10 min，95℃15 s，60℃60 s，72 ℃10 min，70 ℃30 s，循環40 次。使用美國Applied Biosystems 7900 儀器及2-ΔΔCt法進行基因表達檢測分析。

1.3.5 細胞增殖實驗：含10 ml/dl 胎牛血清1 640培養液培養細胞接種于6 孔板，轉染6 h 后更換正常培養液；24 h 收集制成細胞懸液接種于96 孔板，100 μl/孔，37℃，5ml/dl CO2培養箱培養；每孔加入CCK-8 反應液，采用酶標儀分別于0，24，48，72，96 h 測定細胞450 nm 處吸光度值并繪制生長曲線。

1.3.6 細胞凋亡實驗：細胞培養、鋪板、轉染，制成細胞懸液；將105個細胞懸浮于培養液，加入Hoechst33342 10 染液，混勻孵育，離心棄上清；加入PBS 液懸浮細胞，避光加入PI 染液，混勻；取細胞懸液滴于載玻片，封片，共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡情況（細胞凋亡時細胞核呈濃染紅色）。

1.3.7 細胞遷移實驗：采用Marker 筆于6 孔板背面均勻畫線橫穿過孔；細胞培養、鋪板、轉染24 h后用槍頭垂直入背面橫線劃痕；PBS 液清洗，加入1640 培養液，拍照并標記位置，37℃，5 ml/dl CO2培養箱培養48 h 取出6 孔板，再次同位拍照記錄。

1.3.8 細胞侵襲實驗：稀釋Matrigel，包被于Transwell 小室上室溫風干，每孔加入含 10g/L BSA的無血清培養液孵育；常規消化、離心取沉淀，PBS 液清洗，10 g/dl BSA 的無血清培養液重懸，密度105個/ml；取細胞懸液加入Transwell 小室，24孔板下室加入含 10 ml/dl 胎牛血清1640 培養液，培養箱培養24 h；取出小室，PBS 液清洗，95ml/dl酒精固定，DAPI 染色；隨機選取5 個視野于倒置熒光顯微鏡下計數 ，取平均值。

1.3.9 免疫印跡實驗：細胞轉染、培養后用冷PBS 液清洗收集于EP 管，離心、棄上清， 加入RIPA 液裂解（蛋白磷酸化水平檢測時按100:1 比例在裂解液中加入Na3VO4），提取總蛋白。同方法獲取沉淀依次加入細胞漿蛋白抽提試劑A 和B，渦旋、水浴、離心，取沉淀加入含 PMSF 細胞核蛋白抽提劑，提取細胞核蛋白。配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠體系行上樣與電泳分離、轉印及封閉；TBST 液洗膜，加入p-GSK-3β 一抗，β-catenin抗體及 GSK-3β 抗體，孵育過夜；洗膜加入二抗辣根過氧化物酶，室溫孵育，PVDF 膜滴加 ECL發光液，檢測條帶。

1.3.10 雙熒光素酶報告實驗：利用生物信息學方法預測LINC00222 與GSK-3β 的結合位點并經體外克隆擴增，設計具有預測靶位點的GSK-3β 3’UTR 野生型（WT）或突變型（MUT）雙熒光素酶報告基因載體，突變的3’UTR 區作為對照組。轉染前24 h 將A549，LTEP-a-2 細胞接種至24 孔板培養，使用Lipofectamine 2000 將構建的熒光素酶報告基因載體和含有海腎熒光素酶的對照載體共轉染，在轉染48 h 后使用雙熒光素酶報道基因測定系統測定熒光素酶活性，測定LINC00222 對GSK-3β 熒光素酶活性的調控情況，實驗重復3 次。

1.3.11 RNA 結合蛋白免疫沉淀實驗：細胞經轉染、培養，加入甲醛固定，PBS 液清洗，甘氨酸停止液終止反應；加入含 PMSF 的 PBS 刮除液收集細胞至EP 管，離心、棄上清，滴入Complete lysis buffer裂解液重懸，冰上裂解，離心，棄上清，加入超聲液重懸（冰上操作），離心取上清加入DNA 酶處理樣品。EP 管洗磁珠，加入反應體系，旋轉過夜；利用RIP 試劑盒行樣本收集及檢測。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0 統計軟件進行實驗數據錄入分析，所有實驗均重復3 次取平均值數據，采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用方差分析，重復測量數據采用重復測量方差分析。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織及癌旁正常組織中LINC00222 表達 qRT-PCR 檢測34 例肺腺癌組織中LINC00222 mRNA 相對表達，結果顯示：肺腺癌組織中LINC 00222 相對表達量（0.324±0.186）顯著低于癌旁正常組織（1.056±0.547），差異有統計學意義(t=7.388，P<0.001)。Western blot 實驗檢測肺腺癌組織LI 中NC00222 蛋白表達，結果顯示：肺腺癌組織中LINC00222 蛋白表達（0.427±0.149）同樣較癌旁正常組織明顯降低（0.997±0.162），差異有統計學意義（t=15.100，P<0.001）。

2.2 肺腺癌細胞系中LINC00222 低表達 qRTPCR 檢測顯示：人正常肺胚細胞系MRC-5 及肺腺癌A549，LTEP-a-2 細胞系中LINC00222 表達量分別是1.147±0.251，0.283±0.176，0.159±0.153，較正常肺胚細胞系相比，肺腺癌細胞系中LINC00222 顯著低表達（F=21.926，P=0.002）。

2.3 LINC00222 轉染效率驗證 分別轉染pCDNALINC00222 及empty vector 載體至A549，LTEP-a-2細胞系，qRT-PCR 檢測顯示：與轉染empty vector載體（1.001±0.004） 相比，轉染pCDNA-LINC 00222載體后A549（8.351±1.554），LTEP-a-2（12.347±2.143）細胞中LINC00222 表達顯著提高，差異有統計學意義（F=42.538，P<0.001）。

2.4 LINC00222 抑制肺腺癌細胞增殖 見圖1。CCK-8 法檢測顯示：與轉染empty vector 載體相比，轉染pCDNA-LINC00222 載體后A549，LTEP-a-2細胞增殖能力顯著降低（P<0.05）。

圖1 CCK-8 檢測轉染pCDNA-LINC00222 后A549，LTEP-a-2 細胞增殖（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）

2.5 LINC00222 促進肺腺癌細胞凋亡 見圖2。Hoechst 33342/PI 染色法檢測顯示：與轉染empty vector 載體相比，轉染pCDNA-LINC00222 載體后A549，LTEP-a-2 細胞凋亡數目顯著增加（P<0.01）。

圖2 Hoechst 33342/PI 染色法檢測轉染pCDNA-LINC00222 后A549，LTEP-a-2 細胞凋亡情況（**P<0.01）

2.6 LINC00222 抑制肺腺癌細胞遷移及侵襲 見圖3。劃痕實驗及Transwell 實驗檢測細胞遷移、侵襲能力，結果顯示：與轉染empty vector 載體相比，轉染pCDNA-LINC00222 載體后A549，LTEP-a-2細胞遷移、侵襲能力受到明顯抑制。

圖3 劃痕實驗（A）、Transwell 實驗（B）檢測轉染pCDNA-LINC00222 后A549，LTEP-a-2 細胞遷移、侵襲情況

2.7 過表達LINC00222 增強GSK-3β 激酶活性，抑制β-catenin 核轉位 為驗證肺腺癌中LINC00222對GSK-3β 激酶活性的影響，研究分別轉染pCDNA-LINC00222 及empty vector 載體至A549，LTEP-a-2 細胞。qRT-PCR 法檢測顯示：轉染后A549，LTEP-a-2 細胞中兩組GSK-3βmRNA 表達無顯著差異（P>0.05），見圖4。Western blot 法檢測轉染后GSK-3β 在Ser9 磷酸化水平表達差異顯示：轉然后A549，LTEP-a-2 細胞GSK-3β 磷酸化水平顯著降低，GSK-3β總蛋白無明顯差異，見圖5，提示過表達LINC00222 增強GSK-3β 激酶活性。

圖4 qRT-PCR 檢測轉染pCDNALINC00222 后A549，LTEP-a-2 細胞中GSK-3β mRNA 水平表達

圖5 Western blot 法檢測轉染pCDNALINC00222 后A549，LTEP-a-2 細胞中P-GSK-3β 和GSK-3β 蛋白表達

下游基因β-catenin 是否轉入細胞核繼續發揮作用由GSK-3β 催化活性直接調控影響。研究對肺腺癌中LINC00222 影響β-catenin 核轉位的作用機制進行了驗證。Western blot 法檢測顯示，轉染過表達LINC00222 后，細胞核內β-catenin 蛋白表達降低（P<0.05）；當加入TWS119 抑制GSK-3β活性后，β-catenin 蛋白水平明顯恢復，見圖6，提示LINC00222 通過調控GSK-3β 催化活性進而抑制β-catenin 核轉位。

圖6 Western blot 法檢測轉染pCDNA-LINC00222 或pCDNA-LINC00222+TWS119 后A549，LTEP-a-2 細胞核內β-catenin 蛋白表達（*P<0.05，**P<0.01）.

2.8 熒光素酶報告基因驗證LINC00222 與GSK-3β 靶向關系 見圖7。為探究LINC00222 在肺腺癌中是否直接調控GSK-3β 表達，研究構建了GSK-3β 的熒光霉素報告基因載體，利用生物信息學檢測分析發現GSK-3β 是LINC00222 的靶標，通過雙熒光素酶標記實驗驗證了LINC00222與GSK-3β 存在相互結合位點，提示兩者具備可能的調控關系。后將GSK-3β-3’UTR 質粒及empty vector 和pCDNA-LINC00222 載體共轉染A549，LTEP-a-2 細胞，采用熒光霉素報告基因實驗檢測各組細胞中GSK-3β 表達活性，結果顯示：與empty vector 組相比，A549，LTEP-a-2 細胞轉染pCDNALINC00222 后含有野生型GSK-3β-3’UTR 報告質粒熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而含有突變型GSK-3β-3’UTR 的報告質粒熒光素酶活性降低不明顯（P>0.05）。表明在基因水平上GSK-3β 受LINC00222 直接調控，GSK-3β 蛋白是LncRNA LINC00222 的靶標。

圖7 熒光霉素報告基因實驗驗證LINC00222 與GSK-3β 的調控關系（*P<0.05）

2.9 LINC00222 與GSK-3β 結合再次驗證 見圖8。研究利用RPISeq 在線預測軟件對LINC00222與GSK-3β 蛋白的結合進行了預測，通過轉染pCDNA-LINC00222 載體，采用RIP 法檢測顯示：LINC00222 與GSK-3β 蛋白相互結合。qRT-PCR法檢測顯示，GSK-3β 蛋白共沉淀中LINC00222表達顯著高于IgG 蛋白共沉淀（P<0.01）。進一步證實LINC00222 通過與GSK-3β 蛋白相互結合調控GSK-3β 催化活性進而抑制β-catenin 核轉位。

圖8 LINC00222 與GSK-3β 結合驗證

3 討論

近年越來越多研究發現，癌癥的發生發展是多基因、多因素共同作用的結果，表明 LncRNAs 在疾病的發生發展中扮演重要角色，參與調節腫瘤細胞的全部過程，與腫瘤患者的預后密切相關。SHI 等[8-10]研究指出，LncRNAs 在胰腺癌、NSCLC 及前列腺癌中與患者預后密切相關，是影響患者預后的潛在因素。大量研究證實[11-12]，LncRNAs 在多種細胞過程中發揮著分化和發展、基因印跡及抗病毒反應等多種功能，可通過與染色質修飾復合物作用，參與并影響細胞核轉錄活性；部分LncRNAs 可作為轉錄后修飾因子，對蛋白質翻譯、mRNA 衰變及維持蛋白質穩定等進行調控。此外，ZHANG 等[13-14]研究證實，乳腺癌、肝癌、卵巢癌及NSCLC 中多種LncRNA 均差異性表達，對腫瘤細胞的增殖、凋亡等生物學行為發揮促癌或抑癌作用，揭示了異常表達的LncRNA 是癌的一個標志，可作為腫瘤潛在生物標志物。LncRNA 與黏附蛋白相關基因及細胞黏附基因等的表達密切相關[15]，從側面反映了LncRNA 參與癌癥發生發展的作用機制。因此，探尋新的與肺腺癌相關的LncRNA，找尋安全有效的新的基因靶點，對肺腺癌臨床診治及提高患者預后具有重要意義。

LncRNAs 按其基因組位置可分為基因間、基因內、雙向、正義及反義LncRNAs，而基因間LncRNAs 由兩個編碼基因間轉錄產生，參與各級鄰近基因的調節，也可作為轉錄調節器同RNA 間的相互作用來改變mRNA 的穩定性[16-17]。而指導LncRNA，分子支架和誘捕LncRNA 是目前已被證實的LncRNA 作用模式。UCSC 基因組瀏覽器顯示，LINC00324 及LINC00222 均為基因間LncRNA。研究證實，LINC00324 在NSCLC 中低表達，抑制細胞增殖、侵襲及遷移，促進細胞凋亡，發揮抑癌作用[18]；系統性紅斑狼瘡患者中LINC00324 表達上調，是評估療效的輔助指標[19]；LINC00324 參與胃癌、白血病的發生發展[20]。目前有關LncRNA LINC00222 在腫瘤中的作用研究較為缺乏，推測其在肺腺癌中應與LINC00324 發揮同樣作用。為驗證其猜想，本研究經檢測顯示肺腺癌組織及細胞系中LINC00222 顯著低表達，通過構建LINC00222過表達載體，實驗探究發現過表達LINC00222 能夠抑制肺腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡，提示LINC00222 發揮抑癌基因作用。

腫瘤發生發展過程中Wnt 信號通路發揮重要作用，GSK-3 亞型GSK-3β 作用于眾多結構蛋白、信號蛋白及轉錄因子，調控細胞的分化、凋亡，發揮抑癌作用[21]。正常生理條件下，Wnt/β-catenin 信號通路未被激活，GSK-3β 通過與Axin/GSK-3β/APC/β-catenin 形成蛋白復合物，磷酸化β-catenin使其降解。當腫瘤處于病理狀態時，Wnt 通路激活造成蛋白復合物解聚，抑制、介導β-catenin 磷酸化，激活下游基因表達，誘導腫瘤發生[22]。GSK-3β 催化活性是Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵[23]。研究表明[24-25]，GSK-3β 參與調節細胞信號，細胞生長、分化、凋亡和轉錄因子調節器官生長、死亡，起到抑癌作用；當抑制GSK-3β 活性后，β-catenin 轉位入核，誘導下游基因表達，Wnt 通路激活，促進細胞生長；Wnt 信號通路中GSK-3β 至關重要，其可磷酸化底物從而激活或失活Wnt 通路。且研究顯示，GSK-3β 介導Wnt/β-catenin 致癌通路活性進而參與結腸癌的發展進程[26]。CEBPA 介導的lncRNA PLIN2 上調通過GSK3 和Wnt/β-catenin 信號通路促進慢性粒細胞白血病的發展[27]。MicroRNA-940靶向INPP4A 或GSK-3β，激活Wnt/β-Catenin 通路，調節膀胱癌細胞的惡性行為[28]。故本研究探究了肺腺癌中LINC00222 是否通過調控GSK-3β/β-catenin 信號通路進而發揮作用，發現過表達LINC00222 能夠降低GSK-3β Ser9 位點磷酸化水平，增加GSK-3β 激酶催化活性，抑制β-catenin核轉位，當降低GSK-3β 催化活性時該抑制作用明顯減弱，提示LINC00222 可能通過調節GSK-3β 激酶活性影響下游β-catenin 核轉位，進而影響肺腺癌細胞的生物學行為。另研究通過生物學信息軟件預測LINC00222 與GSK-3β 結合位點經體外克隆擴增，設計構建了具有預測靶位點的GSK-3β 3’UTR 野生型或突變型報告基因載體，經雙熒光素酶基因實驗驗證發現，GSK-3β 受LINC00222直接調控，GSK-3β是LINC00222 的靶標；RIP 實驗也驗證了LINC00222 與GSK-3β 蛋白存在相互結合，且發現GSK-3β 蛋白共沉淀中LINC00222表達顯著升高，推測可能是由于兩者的結合阻止GSK-3β磷酸化，增強GSK-3β活性，抑制β-catenin核轉位發揮作用進而調節細胞過程。然而肺腺癌發病機制復雜，其更深入的作用機制還需后續大量研究進一步證實。

綜上所述，肺腺癌中LINC00222 低表達，其可能通過調控GSK-3β 催化活性，抑制β-catenin核轉位，進而調控肺腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲，為肺腺癌的治療提供了新的研究方向。