小鼠胚胎心包內動脈心外膜的形成及其細胞的分布變化

李云華，王佳佳，曹錫梅，李海榮，景雅，謝建山，楊艷萍

（山西醫科大學組織胚胎學教研室，太原 030001）

心外膜是覆蓋心肌外表面的上皮組織，起源于原始橫膈的心外膜前體（proepicardium，PE）[1,2]。心外膜生長障礙導致心肌不致密、瓣膜畸形和冠狀動脈異常等，因此，研究心外膜的發育對探討這些畸形的發生機制具有重要意義。雞胚流出道（outflow tract, OFT）近段的心外膜（epicardium spreading over the cardiac tube，cEP）是PE衍生的，遠段的心外膜稱為動脈心外膜（arterial epicardium，aEP）來自于aPE（arterial proepicardium）[3]，即覆蓋動脈囊基部（OFT與心包腔背側壁交界處）的心包上皮[4]。小鼠胚胎OFT遠段的心外膜是否同樣有不同于PE的起源仍需證實。

胚胎心臟OFT在分隔前，其管壁由心外膜、心肌和心內膜構成。OFT心肌來自于第二生心區（second heart field，SHF），后者包括咽前間充質、鰓弓核心間充質和心包腔背側壁臟壁中胚層[5]。OFT形成后，依據其組織學結構及重塑結果可分為心肌部（即OFT近段）和非心肌部（即OFT遠段）。隨發育，OFT非心肌部分隔為心包內升主動脈和肺動脈干[6]。隨后SHF來源的間充質細胞分化為動脈中膜的平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）[7]，兩動脈壁表面則覆蓋有心外膜。由于SHF前體細胞部分分布于心包腔背側壁，而Pérez-Pomares等認為的心包內主、肺動脈心外膜的起源是動脈囊基部表面的心包膜上皮[4]，二者是否屬于同一結構，即aPE是否屬于SHF尚不清楚。

心外膜細胞可經上皮-間充質轉化形成間充質細胞（epicardial-derived cells，EPDCs）。已證實EPDCs 為多能干細胞[8]，可分化為心肌細胞、冠狀血管壁的內皮細胞與SMCs[1,8]，也參與房室瓣的形成[9]。而aEP是否也可產生EPDCs，是否參與動脈壁的發育有待進一步研究。

因此，本研究用免疫組織化學染色和原代心外膜祖細胞（epicardial progenitor cells，EpiCs）培養等方法系統觀察小鼠胚胎心臟心外膜的形成、OFT的分隔與重塑等過程，探討小鼠胚胎心包內aEP的起源，形成過程及其所含細胞在心包內主、肺動脈管壁發育過程中可能的作用。

材料與方法

1 實驗材料

9周齡健康ICR小鼠由山西醫科大學實驗動物中心提供[動物生產許可證號：SCXK（晉）2019-0004]。雌雄小鼠以2:1于18點合籠，次晨含陰栓雌鼠計為胚齡0.5d（embryonic day 0.5，E0.5）。實驗中對動物的處理方法符合山西醫科大學倫理委員會對動物實驗的要求和規定。取E9.5—E16胚胎，石蠟包埋，制作7μm連續石蠟切片。

2 免疫組織化學染色

ABC法染色：石蠟切片脫蠟、水化、3%過氧化氫、TENG-T預處理后，分別用兔抗Sox-9抗體（1:50, Santa Cruz公司）、羊抗Tbx18抗體（1: 50, Santa Cruz公司）、兔抗胰島素增強子結合蛋白1（insulin gene enhancer binding protein 1, Isl1）抗體（1:700,ABclonal公司）、兔抗重組anti-Wilms Tumor蛋白（WT1）抗體（1:1000, Abcam公司）、小鼠抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體）（1:1500, 武漢博士德生物工程有限公司）、小鼠抗心肌肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain, MHC）抗體(1:1500, Upstate公司）4℃過夜孵育，生物素標記羊抗小鼠/兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）或生物素標記驢抗羊IgG（1:500, Jackson公司）和SABC試劑分別37℃孵育30min，DAB顯色，顯微鏡下觀察并攝片。

雙重免疫熒光染色：石蠟切片脫蠟、水化、TENG-T預處理后，選用兔抗Isl1抗體和小鼠抗α-SMA抗體，兔抗WT1抗體和小鼠抗α-SMA抗體混合，4℃過夜孵育，相應混合羊抗兔IgG-Cy3和羊抗小鼠IgG-FITC（1:100，武漢博士德生物工程有限公司），37℃避光孵育1h，DAPI室溫10min，抗熒光衰減封片劑封片后，熒光顯微鏡下觀察并攝片。

3 原代心外膜祖細胞培養

體式顯微鏡下解剖出心包內主、肺動脈，將組織放入六孔板，蓋壓無菌蓋玻片。滴加含10%血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養基，將6孔板移入培養箱中。48h后移除組織，加入含20ng/ml 血小板衍生生長因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）(PE-PROTECH公司），倒置顯微鏡繼續觀察培養并攝片。

4 細胞免疫熒光染色

細胞經4%多聚甲醛、0.25%Triton X-100、5%BSA預處理后，選用兔抗WT1抗體、兔抗Tbx18抗體（1:100, Abcam公司）、兔抗WT1抗體和小鼠抗α-SMA抗體混合、兔抗Tbx18抗體和小鼠抗α-SMA抗體混合，4℃過夜孵育。相應選擇羊抗兔IgG-Cy3、混合羊抗兔IgG-Cy3和羊抗小鼠IgG-FITC，37℃避光孵育1h，DAPI室溫8min，抗熒光衰減封片劑封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。

結 果

1 E9.5小鼠胚胎OFT的發育與PE來源心外膜細胞的遷移

E9.5小鼠胚胎，OFT遠端與動脈囊相連（圖1A），該部位心肌細胞特異性標記物MHC呈弱陽性（圖1B箭頭），而心肌細胞早期分化標記物α-SMA呈強陽性（圖1A箭頭）。SHF前體細胞標記物Isl1表達于心包腔背側壁臟壁中胚層（圖1C細箭頭）以及與之相延續的OFT遠端（圖1C箭頭），提示Isl1免疫反應陽性SHF前體細胞向OFT遠端延伸并分化為心肌細胞。靜脈端可見PE分布有較多WT1或Tbx18免疫反應陽性細胞（圖1D、E），與房室管、左心室表面散在的WT1、Tbx18免疫反應陽性細胞直接相鄰（圖1D、E箭頭）。提示可能此期PE的細胞已遷移至胚胎心臟房室管，并開始向與房室管相連的心房與心室擴展。

圖1 胚齡9.5d胚胎橫切面α-SMA、MHC、Isl1、WT1和Tbx18表達的免疫組織化學檢測。A，α-SMA；B，MHC；C，Isl1；D，WT1；E，Tbx18。比例尺，100μm。OFT, 流出道；AS, 動脈囊；AVC, 房室管；AT, 心房；LV, 左心室；PC, 心包腔；PE, 心外膜前體Fig. 1 Immunohistochemical staining for the expression of α-SMA, MHC, Isl1, WT1 and Tbx18 in the transversal sections of mouse embryos at E9.5.A, α-SMA; B, MHC; C, Isl1; D, WT1; E, Tbx18. Scale bar, 100μm. OFT, outflow tract; AS, aortic sac; AVC, atrioventricular canal; AT, atrium; LV, left ventricle; PC, pericardial cavity; PE, proepicardium

2 E10.5小鼠胚胎OFT的發育與心外膜的形成

E10.5小鼠胚胎，動脈囊仍位于心包腔外（圖2A）。MHC在OFT壁的表達與E9.5相似，由近端向遠端逐漸減弱（圖2B箭頭），而在OFT壁與心包腔背側壁返折處，Isl1與α-SMA表達較強（圖2A、C箭頭），說明Isl1陽性細胞繼續向心肌細胞分化并向OFT遠端添加，使OFT增長。Isl1免疫反應陽性的SHF細胞分布于心包腔背側壁（圖2C細箭頭）與前腸腹側間充質（圖2C星號）。連續切片觀察，WT1和Tbx18免疫反應陽性的心外膜細胞呈單層扁平狀，廣泛分布于心房、房室管、心室壁的外表面（圖2D、E）。在與右心室相接的OFT壁，WT1和Tbx18陰性表達，說明OFT壁心外膜尚未形成（圖2F、G）。此期由胚胎動脈端到靜脈端，心包壁層大部表達WT1（圖2H箭頭），但在Isl1陽性的心包腔背側壁（圖2I箭頭）未見WT1陽性細胞分布（圖2H）。

圖2 胚齡10.5d心橫切面α-SMA、MHC、Isl1、WT1和 Tbx18表達的免疫組織化學檢測。A，α-SMA；B，MHC; C和I，Isl1；D、F和H，WT1；E和G，Tbx18。比例尺，100μm。OFT, 流出道；AS, 動脈囊; PC, 心包腔；AT, 心房；AVC, 房室管；RV, 右心室；LV, 左心室；FG,前腸Fig. 2 Immunohistochemical staining for the expression of α-SMA, MHC, Isl1, WT1and Tbx18 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E10.5. A, α-SMA; B, MHC; C and I, Isl1; D, Fand H, WT1; E and G, Tbx18. Scale bar, 100μm. OFT, outflow tract; AS, aortic sac; PC, pericardial cavity; AT, atrium; AVC, atrioventricular canal; RV, right ventricle; LV, left ventricle; FG, foregut

3 E11小鼠胚胎OFT的發育與心外膜的分布變化

E11小鼠胚胎，動脈囊進入心包腔，其壁為MHC陰性，因此形成OFT的非心肌部（圖3A、B）。其遠端及其與之相延續的心包腔背側壁呈Isl1免疫反應陽性（圖3C箭頭），相鄰切片免疫組化染色顯示OFT非心肌部遠端同時表達α-SMA（圖3A箭頭）、但不表達MHC（圖3B箭頭），說明Isl1免疫反應陽性的SHF細胞不再向心肌細胞分化。WT1的表達開始出現在Isl1陽性的心包腔背側壁以及與之相連的OFT遠端壁的表面（圖3D細箭頭）。在與右心室相連的OFT心肌部外表面，WT1免疫反應陽性的cEP清晰可見，但與OFT非心肌部遠端的WT1陽性細胞帶即aEP之間缺乏連續性（圖3D箭頭），進一步提示OFT心肌部與非心肌部的心外膜有不同來源。Tbx18在OFT非心肌部以及相連的心包腔背側壁表達呈免疫反應弱陽性（圖3E細箭頭）。心包腔背側壁與OFT非心肌部的WT1陽性細胞呈單層立方狀（圖3F、G箭頭），而OFT心肌部的心外膜為單層扁平上皮（圖3F、H箭頭）。向靜脈端移行，與心房相鄰的Isl1陽性的心包腔背側壁（圖3I箭頭），WT1表達仍為陰性（圖3J箭頭），即僅心臟動脈端相鄰的心包腔背側壁上皮開始表達WT1。

圖3 胚齡11d心橫切面α-SMA、MHC、Isl1、WT1和 Tbx18表達的免疫組織化學檢測和組織學特征分析。A, α-SMA；B, MHC；C和I，Isl1；D和J，WT1；E，Tbx18；F，組織學特征的HE染色觀察；G和H，分別為F中的F1和F2的局部放大。比例尺，100μm。PC，心包腔；non-myo OFT，OFT非心肌部；FG，前腸；RA，右心房；LA，左心房Fig. 3 Immunohistochemical staining for the expression of α-SMA, MHC, Isl1, WT1 and Tbx18 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E11 and their histological characteristic analysis. A, α-SMA; B, MHC; C and I, Isl1; D and J, WT1; E, Tbx18; F, analysis by HE staining for histological characteristics; G and H, magnification of F1 and F2 in F, respectively. Scale bar, 100μm. PC, pericardial cavity; non-myo OFT, non-myocardial part of the OFT; FG, foregut; RA, right atrium; LA, left atrium

4 E11.5小鼠胚胎OFT的分隔與EPDCs形成

E11.5小鼠胚胎，主肺動脈隔將OFT非心肌部分隔為心包內升主動脈和肺動脈干（圖4A）。Isl1免疫反應染色顯示此期SHF由Isl1陽性的氣管腹側錐形區（圖4B星號）和心包腔背側壁臟壁中胚層構成，前者體積較大，其尖端Isl1陽性細胞延伸至主動脈和肺動脈干管壁，因此兩動脈壁內可見大量Isl1陽性SHF細胞（圖4B、C）。α-SMA表達則局限于動脈壁近內皮處（圖4A箭頭）。提示此期較多SHF前體細胞已進入動脈壁，但尚未大量分化為α-SMA陽性SMCs。心包腔背側壁仍表達Isl1、WT1、Tbx18（圖4B-E箭頭），且與主動脈壁外表面的aEP相延續（圖4C、D、E），說明SHF前體細胞繼續向心外膜細胞分化,而aEP與OFT心肌部的心外膜仍未彼此相連（圖4D, E細箭頭）。

圖4 胚齡11.5d心橫切面α-SMA、Isl1、WT1和Tbx18表達的免疫組織化學檢測。A，α-SMA；B,和C，Isl1；D，WT1；E，Tbx18；C，B中方框的局部放大。比例尺，100μm。PC，心包腔；APS，主肺動脈隔；AO，升主動脈；PT，肺動脈干；T，氣管Fig. 4 Immunohistochemical staining for the expression of α-SMA, Isl1, WT1 and Tbx18 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E11.5.A, α-SMA; B and C, Isl1; D, WT1; E , Tbx18; C, the enlargement of the box in B. Scale bar, 100μm. PC, pericardial cavity; APS, aorta pulmonary septum; AO, ascending aorta; PT, pulmonary trunk; T, trachea

5 E12.5小鼠胚胎心包內主、肺動脈的發育以及EPDCs的分布變化

E12.5小鼠胚胎，升主動脈和肺動脈干完全分隔，兩動脈壁內仍分布有豐富的Isl1免疫反應陽性的SHF細胞（圖5A）。免疫熒光雙染結果顯示，部分Isl1免疫反應陽性細胞同時表達α-SMA（圖5B箭頭），即α-SMA在動脈壁的表達不再局限于近內皮處，而是向外層擴展，提示SHF前體細胞向SMCs分化。動脈壁外表面的WT1免疫反應陽性細胞未進入中膜（圖5C）。在心外膜下間隙、致密心肌可見較多WT1陽性EPDCs分布（圖5D箭頭）。

圖5 胚齡12.5d心橫切面Isl1、α-SMA和WT1表達的免疫組織化學檢測。A，Isl1；B，Isl1和α-SMA免疫熒光雙標，綠色示α-SMA，紅色示Isl1；C和D，WT1。比例尺，100μm。AO，升主動脈；PT，肺動脈干Fig. 5 Immunohistochemical staining for the expression of Isl1, α-SMA and WT1 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E12.5. A,Isl1; B, double immunofluorescence staining of Isl1 (red) and α-SMA (green); C and D, WT1. Scale bar, 100μm. AO, ascending aorta; PT, pulmonary trunk

6 E14—E16小鼠胚胎心包內主、肺動脈的發育以及EPDCs分布變化

E14—E16小鼠胚胎，心包內主、肺動脈的aEP以及與之延續的心包腔背側壁上皮由立方形變為扁平狀，仍表達WT1（圖6A、B箭頭），但失去了Isl1的表達（圖6C箭頭）。主、肺動脈壁中膜的Isl1陽性細胞逐漸減少至消失（圖6C、D星號），α-SMA表達擴展至管壁中膜全層（圖6E）。免疫熒光染色顯示，動脈壁中膜內也可觀察到WT1免疫反應陽性細胞的散在分布，同時表達α-SMA（圖6E）。提示aEP也可產生WT1陽性EPDCs并進入動脈中膜向SMCs分化。此期兩動脈的瓣膜已形成，瓣膜內分布有豐富的Sox9免疫反應陽性間質細胞（圖6F），免疫組織化學染色與免疫熒光雙染均顯示，瓣膜內分布有散在的WT1陽性心外膜細胞（圖6G、H箭頭）。

圖6 胚齡14—16d心橫切面WT1、α-SMA、Isl1和Sox-9表達的免疫組織化學檢測。A、B和G，WT1，B為A中方框的局部放大; C和D，Isl1; E和H，α-SMA （綠色）和WT1（紅色）免疫熒光雙標；F，Sox-9免疫組織化學染色。比例尺，100μm。 PC，心包腔；AO，升主動脈；PT，肺動脈干；PV，肺動脈瓣膜Fig. 6 Immunohistochemical staining for the expression of WT1, α-SMA, Isl1 and Sox-9 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E14 to E16. A and G, WT1; B, enlargement of the box in A; C and D, Isl1; E and H, double immunofluorescence staining of α-SMA (green) and Isl1(red);F, Sox-9. Scale bar, 100μm. PC, pericardial cavity; AO, ascending aorta; PT, pulmonary trunk; PV, pulmonary valve

7 E13小鼠胚胎心包內主、肺動脈原代EpiCs體外培養并向SMCs分化

按照文獻[10,11]所介紹方法，選取E13小鼠胚胎心包內主、肺動脈組織進行原代EpiCs培養。動脈組織種植24h后，可見部分EpiCs從組織邊緣爬出，以鵝卵石樣向外生長，顯微鏡下觀察呈典型的上皮樣細胞形態（圖7A）。培養48h后，對EpiCs進行免疫熒光染色可見其高表達EpiCs標志物 WT1（圖7B）與Tbx18（圖7C）。對EpiCs純度進行檢測，使用ImageJ細胞計數，證實EpiCs純度為97.78±0.50%。數據表明，EpiCs可以成功地進行高純度的培養。部分EpiCs在添加PDGF-BB的培養基中培養72h后，出現較多形態不規則的SMCs；對照組未進行PDGF-BB干預的EpiCs，培養6d后出現少量的SMCs。免疫熒光雙染檢測顯示添加PDGFBB組的細胞α-SMA呈強陽性表達(圖7D—G)，說明PDGF-BB可以誘導EpiCs向SMCs分化。而未進行PDGF-BB干預的對照組，α-SMA少量表達(圖7H—K)，說明在無PDGF-BB誘導情況下EpiCs也可以向SMCs進行緩慢分化，與對照組相比，PDGFBB對EpiCs向SMCs分化起促進作用。

圖7 胚齡13d心包內主動脈和肺動脈原代EpiCs中WT1、Tbx18和α-SMA表達的免疫熒光檢測。A，EpiCs從組織邊緣爬出；B，WT1（紅色），藍色示DAPI染色的的細胞核；C，Tbx18（紅色），藍色示DAPI染色的的細胞核; D、E、H和I，WT1（紅色）和α-SMA（綠色）免疫熒光雙標，藍色示DAPI染色的細胞核；F、G、J和K，Tbx18（紅色）和α-SMA（綠色）免疫熒光雙標，藍色示DAPI染色的細胞核；E、G、I和K，分別為D、F、H和J中方框的局部放大。比例尺：A—C，50μm; D—K，100μmFig.7 Immunofluorescence detection for the expression of WT1, Tbx18 and α-SMA in primary EpiCs of the intrapericardial aorta and pulmonary artery in mouse embryos at E13. A, EpiCs climbing out from the tissue edge; B, WT1 (red) and nuclei (blue, stained with DAPI); C, WT1(green) and nuclei(blue, stained with DAPI); D, E, H and I, double immunofluorescence staining of WT1 (red), α-SMA (green), and nuclei (blue, stained with DAPI); F,G, J and K, double immunofluorescence staining of Tbx18 (red), α-SMA (green), and nuclei (blue, stained with DAPI); E, G, I and K, enlargements of the boxes in D, F, H and J. Scale bar: 50μm in A to C; 100μm in D to K

討 論

1 小鼠胚胎心包內主動脈和肺動脈心外膜來自動脈端心包腔背側壁臟壁中胚層

目前為止，小鼠胚胎心包內aEP起源是否與雞胚一致尚未見報道。本研究結果顯示，E9.5—E10.5小鼠胚胎靜脈端的PE富含WT1和Tbx18陽性細胞；在PE相鄰的房室管心肌表面，觀察到心外膜細胞，說明心外膜開始形成，并逐漸擴展至心房和心室。但在心臟動脈端的OFT尚無心外膜覆蓋。至E11，OFT的非心肌部和心肌部形成，后者表面開始有來自PE的心外膜覆蓋。值得注意的是，OFT非心肌部遠端開始出現WT1和Tbx18陽性的心外膜，為單層立方上皮，與OFT心肌部的單層扁平的心外膜形態不同。兩種心外膜之間有明顯的中斷，說明來自于靜脈端PE的OFT心肌部的心外膜并未擴展至非心肌部，后者的心外膜有不同的來源。由于OFT非心肌部一端與心肌部相連，另一端與心包腔背側壁相延續，既然OFT非心肌部的心外膜并非來源于心肌部心外膜的擴展，我們推測前者可能來自心包腔背側壁，因此本實驗觀察了OFT非心肌部心外膜的形成過程以及心包腔背側壁的相關蛋白表達模式，結果顯示在E9.5—E10.5，心包腔背側壁表達SHF標記物Isl1，但不表達心外膜標記物WT1和Tbx18，所含SHF前體細胞正在向心肌細胞分化；至E11，動脈囊進入心包腔，成為OFT的非心肌部，因此心包腔背側壁不再向心肌細胞分化，該部位雖仍表達Isl1，但同時開始表達心外膜的標記物WT1、Tbx18，這些WT1、Tbx18陽性細胞延伸至OFT非心肌部的表面。由此說明OFT非心肌部心外膜開始形成，它與心包腔背側壁相延續，后者同時表達心外膜的特異性標記物WT1與SHF標記物Isl1，由此推測OFT非心肌部心外膜有不同于PE的起源，來自于SHF。此與雞胚的研究結果一致[4]，但雞胚的aPE位于動脈囊基部，形態與靜脈端的PE相似，有多個突起[4]。本實驗的結果則顯示小鼠胚胎aPE來自于動脈端心包腔背側壁臟壁中胚層，是SHF的構成部分，即aPE屬于SHF，心包腔背側壁SHF前體細胞具有上皮特性，呈單層或假復層立方形，在細胞基底面的絲狀偽足參與下增生、向OFT非心肌部延伸[12]。小鼠E16，在動脈端心外膜形成后，aPE的細胞與主、肺動脈的心外膜細胞均變為單層扁平狀。

2 心包內主動脈和肺動脈壁的心外膜來源細胞參與動脈壁及瓣膜發育

覆蓋在心包內主動脈和肺動脈表面的aEP是否可產生EPDCs，是否參與動脈壁及瓣膜發育有待證實。本實驗觀察到在胚胎心包內主動脈和肺動脈形成后，二者管壁中膜于E12.5開始出現WT1免疫反應陽性細胞，至E14明顯增多，這些細胞同時表達α-SMA，由此推測aEP來源的EPDCs進入動脈中膜，向SMCs分化。分離心包內主、肺動脈管壁體外培養進一步驗證了此結論，aEP可以經上皮—間充質轉化為EPDCs，進入動脈中膜，分化為α-SMA陽性SMCs細胞，參與動脈壁的發育。主動脈與肺動脈分隔后，瓣膜隨之形成，二者的3個瓣膜內可見WT1陽性細胞的散在分布?，F有研究證實主動脈和肺動脈的左、右兩瓣膜內的間充質細胞為神經嵴與內皮來源[14]，主動脈后瓣和肺動脈前瓣來自SHF[15]。本實驗結果提示aEP的EPDCs可能也參與瓣膜的發育。與房室管的EPDCs僅參與壁側瓣的發育不同，動脈的EPDCs見于任一瓣膜內。

綜上，本實驗為探究小鼠胚胎心包內動脈心外膜來自于SHF提供了形態學依據；動脈心外膜的WT1陽性細胞分布變化以及蛋白表達模式的改變，提示動脈心外膜所含細胞參與了主、肺動脈管壁以及瓣膜的發育。這些結果對探討心外膜相關畸形的發生機制具有重要意義。