糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇提取方法的驗證與優化

郝全英 ，王麗娟，郭建君，劉芳芳 ，楊 柯

（1.山西糧食質量監測中心，山西 晉中 030600；2.北京東孚久恒儀器技術有限公司，北京 100037）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （deoxynivalenol,DON）是一種主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產生的真菌毒素，存在于小麥、大麥、燕麥、黑麥和玉米等谷類作物中，在全球污染普遍，對谷物的污染率和污染水平居鐮刀菌毒素之首，是各國重點控制的真菌毒素之一。禾谷鐮刀菌在適宜的氣溫和濕度等條件下繁殖并產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對動物和人均有一定的毒性。2017年10月27日，世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單初步整理后，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在3類致癌清單中。

本文以小麥、玉米中DON對其提取方法為例進行驗證與優化，主要參考標準包括：GB/T 2761-2011《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》、GB 5009.111-2016《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法、GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》。按照GB 5009.111-2016中給定的方法進行優化，結合免疫親和柱的操作手冊對GB 5009.111-2016中提取DON的方法進行驗證，使回收率得到提高。本方法凈化效果好、準確度高、平行度好，可以滿足糧食中DON的限量檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

保水式盤式粉碎磨，LM3303，瑞典波通儀器公司；安捷倫1260 Infinity高效液相色譜儀，包括安捷倫紫外檢測器，自動進樣器，柱溫箱，四元梯度泵;數顯調速搖床，YC-96，常州市天境實驗儀器廠;ScoutSE電子天平，YP402N,奧豪斯儀器有限公司；臺式高速離心機，TG18-WS，湖南湘立科學儀器有限公司;高通量全自動固相萃取儀，Fotector Plus-60，美國?？苾x器有限公司;水浴氮吹儀，NDK-12W,上海皓莊儀器有限公司；250 mL具塞三角瓶；實驗室清洗消毒機，G7883,德國美諾。

1.2 試劑

色譜級甲醇、乙腈，迪馬科技；超純水，由沃特浦純水機生產，四川沃特爾水處理設備有限公司。

真菌毒素標準品：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液(GBW(E)100304)質量濃度為 100 μg/mL。

標準工作液；質量濃度分別為100 ng/mL、200ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、5000 ng/mL。

提取液：超純水。

免疫親和柱：Evergreen TREA嘔吐毒素免疫親和柱3 mL。

1.3 色譜條件

色譜柱：安捷倫-C18,4.6 mm×250 mm(5 μm)；

流動性：20%的甲醇；

流速：1.0 mL/min；

檢測器：紫外檢測器，波長218 nm；

進樣體積：30 μL；

柱溫：35℃。

1.4 優化條件的確定

1.4.1 分樣不均勻對結果的影響

以小麥樣品中DON限量點的100%加標，即含量為1 000 μg/kg。對同一個顆粒樣品進行2次與4次分樣的比對，然后粉碎。按照GB 5009.111-2016的提取方法進行測定，得到DON的不均勻性非常大，分樣不均勻做的試驗的誤差較大，分樣次數越多雙試驗誤差越小。所以做樣之前要對樣品進行充分地混合，否則誤差大，結果不準確。結果見表1。

1.4.2 稱樣量的大小對結果的影響

以小麥樣品中DON限量點的100%加標，即含量為1 000 μg/kg。對同一個樣品進行稱樣量的不同進行比對，按照GB 5009.111-2016的提取方法進行測定，分別稱取 5.00 g、12.50 g、25.00 g三種梯度進行測定，試驗結論表明：稱樣量越大雙實驗的誤差越小，結果越準確。結果見表2。

表2 不同稱樣量各水平的含量

1.4.3 相同振蕩頻率不同的振蕩時間、相同振蕩時間不同的振蕩頻率對結果的影響

以小麥樣品中DON限量點的100%加標，即含量為1 000 μg/kg。對同一個樣品進行相同頻率不同時間、相同時間不同頻率進行比對，按照GB 5009.111-2016的提取方法進行測定。由表3和表4兩組數據可得出DON提取方法最佳的振蕩頻率為200 r/min，振蕩時間為20 min。

表3 振蕩頻率200 r/min時不同的時間對結果的影響

表4 振蕩頻率230 r/min不同的時間對結果的影響

1.4.4 氮吹溫度對結果的影響

以小麥樣品中DON限量點的100%加標，即含量為1 000 μg/kg。對同一個樣品進行測定，按照GB 5009.111-2016的提取方法進行測定，最后一步一個樣品用50℃的氮吹，另一個樣品用60℃氮吹。得出結論：用50℃氮吹所用時間為20 min左右，用60℃氮吹所用時間為10 min左右，通過表5可知60℃與50℃回收率基本一致，60℃可以節省時間，也可以節省成本。故60℃為最佳氮吹溫度。

表5 不同的氮吹溫度對結果的影響

1.4.5 不同的定容溶液對結果的影響

以小麥樣品中DON限量點的100%加標，即含量為1 000 μg/kg。對同一個樣品進行測定，按照GB 5009.111-2016的提取方法進行測定，最后一步一個樣品用20%的甲醇定容，另一個樣品用10%的乙腈定容。得出結論：不同的定容溶液對結果影響不是太大，用兩個溶液都是可以的，為了跟流動相一致，選用20%的甲醇最佳。結果見表6。

表6 不同的定容溶液對結果的影響

1.4.6 優化條件結論

小麥DON測定試驗中，首先分樣必須均勻，稱樣量要大于25.00 g,振蕩頻率為200 r/min振蕩時間為20 min,最后用60℃氮氣吹干，用20%的甲醇定容為最終的試驗條件。

1.5 提取與凈化

1.5.1 提取方法

原始樣品經研磨粉碎、過篩，使其粒徑小于0.5～1 mm，混勻備用。

分別準確稱取25.00 g(精確到0.01 g)磨碎的試樣于250 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇8000，加超純水100 mL，混勻，置于搖床中200r/min振蕩20 min。以6 000 r/min下離心10 min，收集濾液于干凈的容器中。

1.5.2 凈化方法

取2 mL上述上清液到固相萃取儀，操作步驟如表7：

表7 Fotector Plus脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和凈化方法

最后，在60℃下用氮氣吹干洗脫液，加入1mL20%甲醇定容，混勻后利用高效液相色譜儀進行測定。

2 結果與分析

2.1 標準色譜圖和線性范圍

在上述色譜條件下，DON的標準品色譜圖如圖1所示。

圖1 DON的標準品色譜圖

將配制好的標準工作液做線性回歸分析，以峰面積Y為縱坐標，質量濃度X為橫坐標得到DON線性方程和相關系數，Y=0.03843263X+0.2240615，R2=0.99996，線性范圍 100～5 000 ng/mL，DON 標準曲線如圖2所示。

圖2 DON標準曲線圖

2.2 樣品的加標回收測定

2.2.1 樣品加標色譜圖

本試驗以小麥DON限量為基準，分別向3組樣品中添加DON標準溶液，其添加水平分別是500μg/kg、1 000 μg/kg、2 000 μg/kg， 每組樣品做 3個平行試驗。小麥空白基質及加標樣品色譜圖分別見圖 3、圖 4、圖 5、圖 6。

圖3 小麥空白基質色譜圖

圖4 小麥DON的加標量為500 μg/kg色譜圖

圖5 小麥DON的加標量為1 000 μg/kg色譜圖

圖6 小麥DON的加標量為2 000 μg/kg色譜圖

2.2.2 回收率試驗

向小麥基質中添加DON標準溶液,使其含量為500 μg/kg、1 000 μg/kg、2 000 μg/kg，三組平行加標回收率結果見表8：

按照此方法做了玉米、大豆、玉米粉及小麥粉的DON加標回收試驗，DON的回收率（%）見表9。

3 結論

本文主要對糧食中DON的提取和凈化方法進行了比對、研究。在GB 5009.111-2016中DON提取凈化的基礎上結合試驗中的具體操作進行了優化和改進，最終按照DON的優化改進提取方法得到了最佳的回收率。本方法效果好、可靠、準確度和精密度高，能夠運用于糧食中DON的檢測工作，滿足分析要求，有一定的參考應用價值。