丁苯酞對大鼠冠狀動脈微栓塞后心肌炎癥反應的影響

黃駿文，周 游，陳志清，覃振柏，李 浪，2，3

冠狀動脈微栓塞(CME)指急性冠脈綜合征病人動脈粥樣硬化斑塊自發性破裂后，斑塊碎片和脂質等導致血栓成分流向遠端微小血管引起微循環堵塞，同時也是經皮冠狀動脈介入(PCI)術后的常見并發癥[1]。CME可導致心肌損傷，易使冠狀動脈發生“慢血流”或“無復流”，嚴重影響病人預后[2-3]。相關研究表明，炎性因子參與心肌組織局部炎癥反應，與CME發生后心肌損傷密切相關[4-5]。丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)分子式為C12H14O2，與芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素結構相同，是人工合成的消旋體。相關研究顯示，NBP有抗血小板聚集[6]、清除自由基[7]、改善線粒體功能、減少神經細胞凋亡[8]等多種分子靶點，臨床廣泛用于治療缺血性腦卒中。隨著研究深入，NBP可治療心肌缺血再灌注損傷[9-10]、心肌梗死[11]、心力衰竭[12]等。NBP能否減輕CME所致心肌損傷及相關機制尚未明確。本研究觀察NBP預處理對大鼠CME后心肌組織炎性因子及心功能的影響，探討NBP對CME所致心肌損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠，6～8周齡，體重200～250 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供(動物合格證號SCXK桂2014-0002)。實驗過程中動物的處置符合醫學倫理學要求。

1.1.2 實驗藥物與試劑 直徑42 μm的微栓塞球購自挪威Dyna公司，使用前加入生理鹽水，調整密度為3×104/mL。丁苯酞軟膠囊購自石藥集團恩必普藥業有限公司(批準文號：國藥準字H20050299)，食用植物油配制濃度為80 mg/mL。逆轉錄試劑盒及逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑盒購自Monad公司。兔抗鼠白細胞介素1β(IL-1β)、兔抗鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)單克隆抗體、兔抗鼠GAPDH單克隆抗體及熒光羊抗兔二抗購自萬類生物科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器 E-Saote Mylab彩色多普勒B超儀購自意大利百勝公司；NanoDrop分光光度計、StepOnePlus熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；T100 PCR儀、電泳槽、轉膜儀及其配件購自美國Bio-rad公司；FluorChem FC3全能型成像系統購自美國Proteinsimple公司；低溫離心機購自德國Eppendorf公司；BX50光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與處理 將36只SD大鼠隨機分為冠狀動脈微栓塞組(CME組)、假手術組(Sham組)、CME+丁苯酞預處理組(CME+NBP組)，每組12只。CME+NBP組術前給予NBP 80 mg/kg連續灌胃7 d。術前按30 mg/kg腹腔注射3 mg/mL戊巴比妥鈉麻醉大鼠，手術區域剃毛、消毒，頸正中切口暴露氣管，經口氣管插管，小動物呼吸機輔助通氣，于左前胸中部剪斷肋骨進胸，暴露心臟并分離升主動脈，使用血管夾鉗夾主動脈根部，CME組和CME+NBP組立即使用注射器從心尖部將0.1 mL微栓塞球混懸液注射至左心室，夾閉10 s后松開血管夾，Sham組注射0.1 mL生理鹽水。待心跳平穩后逐層關胸，恒溫墊上復蘇，待蘇醒后拔管脫機，術畢給予青霉素40×104U腹腔注射預防感染。

1.2.2 心功能檢查 術后6 h麻醉大鼠，使用心臟彩超儀檢測心功能，探頭頻率為12 MHz，測量左室射血分數(LVEF)、短軸縮短率(FS)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)，測量3個心動周期，取平均值。

1.2.3 組織取材 檢測心功能后，腹腔注入戊巴比妥鈉麻醉，處死大鼠，立即取出心臟，去除心耳、心房，心尖部用液氮冷凍后置入-80 ℃冰箱保存，采用RT-PCR及免疫印跡法(Western Blotting)檢測；心底部置入4%多聚甲醛固定液中浸泡，12 h后取出，石蠟包埋、切片，采用蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察心肌壞死及白細胞浸潤情況。

1.2.4 RT-PCR定量測定IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表達 取心尖部心肌組織 200 mg，按照Trizol試劑盒說明提取總RNA，并按逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄為cDNA；按試劑說明設置反應體系及參數，用SYB-RGREENI法檢測PCR擴增產物，每個樣本均進行復孔檢測，結果以2-ΔΔCT法比較。實驗引物由Sangon公司合成，IL-1β正向引物：5′-GGGATGATGACGACCTGCTA-3′，反向引物：5′-TGTCGTTGCTTGTCTCTCCT-3′；TNF-α正向引物：5′-CGTCGTAGCAAACCACCAAG-3′，反向引物：5′-GAGGCTGACTTTCTCCTGGT-3′；GAPDH正向引物：5′-TGTGAACGGATTTGGCCGTA-3′，反向引物：5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′。

1.2.5 免疫印跡法檢測IL-1β、TNF-α表達 取心肌組織加入RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑，置入組織研磨儀中研磨，4 ℃條件下，以12 000 r/min 離心15 min，使用BCA法檢測上清液濃度，將各組樣品統一定量至10 μg/μL。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔加樣5 μL，恒壓80 V，Marker分層后升至120 V進行電泳；恒流200 mA，90～120 min濕法將蛋白條帶轉至PVDF膜，使用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別置于IL-1β、TNF-α的1∶1 000一抗4 ℃搖床孵育過夜，次日TBST洗膜后使用1∶10 000熒光二抗室溫孵育1 h；TBST洗膜后使用化學發光液顯影，全能型成像系統掃膜；使用 Image Jv1.80測量條帶灰度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 與Sham組比較，CME組LVEF和FS下降，LVEDD和LVESD增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與CME組比較，CME+NBP組LVEF和FS升高，LVEDD和LVESD下降，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心功能比較(±s)

2.2 各組大鼠心肌IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表達水平比較 與Sham組比較，CME組IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與CME組比較，CME+NBP組IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心肌IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 表達水平比較(±s)

2.3 各組大鼠心肌IL-1β、TNF-α蛋白表達水平比較 與Sham組比較，CME組IL-1β、TNF-α蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與CME組比較，CME+NBP組IL-1β、TNF-α蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、圖2。

與Sham組比較，＊P<0.05；與CME組比較，#P<0.05。圖1 各組大鼠心肌IL-1β蛋白表達水平比較

與Sham組比較，＊P<0.05；與CME組比較，#P<0.05。圖2 各組大鼠心肌TNF-α蛋白表達水平比較

2.4 各組大鼠心肌HE染色 HE染色顯示：Sham組未見微栓塞球及心肌梗死灶；CME組及CME+NBP組均可見血管內微栓塞球，微球周圍心肌細胞核溶解或消失，周邊細胞水腫、變性，周圍可見白細胞浸潤和紅細胞滲出；與CME組比較，CME+NBP組心肌細胞結構改變及炎性因子浸潤減少。詳見圖3。

圖3 各組大鼠心肌HE染色(×200)(箭頭所示為微栓塞球)

3 討 論

有研究顯示，CME導致心肌損傷及近期、遠期心功能下降，與ST段抬高型心肌梗死病人PCI治療后1年內心力衰竭死亡率和住院率密切相關[3]。CME后伴炎癥反應在多項研究得到證實[13-14]，目前認為CME引起的心肌炎癥反應可能是導致心肌收縮功能障礙的主要原因。CME發生后，大量炎癥細胞浸潤心肌微梗死灶，伴有大量炎性因子釋放，導致心肌局部炎癥反應，且CME所致炎癥不僅局限于微梗死灶及周圍，同時激活微循環炎癥反應，其他部分“正?！毙募【霈F炎性因子表達及炎癥細胞大量滲出[15]。炎癥反應激活產生大量炎性因子，如TNF-α、IL-1β等，這些炎性因子通過促進心肌細胞凋亡及黏附分子表達等多種途徑，導致心肌損傷并引起心肌收縮功能障礙。課題組前期研究發現，CME后LVEF與心肌代表性的炎性因子TNF-α水平呈負相關[16]，給予相關藥物(美托洛爾和左西孟旦)治療后，心肌TNF-α水平下降，心肌收縮功能增強[17-18]，提示CME引起的炎癥反應與心肌收縮功能障礙密切相關，減輕CME后炎癥反應可能成為改善CME后心肌收縮功能障礙的重要靶點。

NBP具有神經保護作用，主要用于治療缺血性腦病，相關研究顯示，NBP能減輕神經血管炎癥，保護神經功能[19-20]。Zhang等[20]研究發現，大鼠缺血再灌注腦損傷后，NBP可抑制白細胞介素6(IL-6)、IL-1β、TNF-α等促炎因子表達，減輕腦損傷。近年來越來越多研究顯示NBP對心血管疾病具有保護作用。Bai等[11]研究顯示，NBP可抑制大鼠急性心肌梗死后IL-1β、TNF-α表達，減輕炎癥反應，抑制心肌細胞凋亡。Qiu等[21]研究顯示，大鼠心力衰竭模型中，NBP可抑制TNF-α蛋白表達水平，保護心功能。本研究結果顯示，與Sham組比較，CME后6 h大鼠心功能下降，心肌病理切片可見微梗死球，表明CME模型成功建立。NBP治療后，大鼠LVEF和FS較CME組升高，LVEDD和LVESD下降，提示NBP可改善大鼠CME后心肌收縮功能。與CME組比較，CME+NBP組大鼠心肌炎性因子TNF-α mRNA、IL-1β mRNA及蛋白表達水平降低，說明NBP可抑制CME后炎性因子表達，與Bai等[11-12]研究結果一致。HE染色顯示，CME組大鼠微球周圍心肌細胞核溶解、消失，周邊細胞水腫、變性，周圍可見白細胞浸潤和紅細胞滲出，CME+NBP組微球周圍心肌排列較整齊，心肌結構較完整，周圍炎性因子浸潤減少。

綜上所述，NBP可抑制CME后心肌組織炎性因子TNF-α、IL-1β表達，減輕心肌炎癥反應，改善CME后心肌收縮功能障礙。本研究局限性為僅觀察NBP對CME大鼠近期心功能影響，未觀察大鼠遠期心功能的情況，可進一步觀察NBP對CME大鼠遠期心功能影響。本研究為小樣本量動物實驗，今后需大樣本隨機對照實驗進一步證實結論。