探究tspo基因缺陷對斑馬魚生理功能的影響

廖紫嫻，陳明瀚，鐘敏，王一川，尚靖，岳蕓蕓

（中國藥科大學，江蘇 南京 210000）

0 引言

TSPO是一種位于線粒體外膜上包含169個氨基酸的疏水性跨膜蛋白。TSPO在外周主要分布于骨髓、脂肪、胃、皮膚等，在中樞以膠質細胞表達為主，包括小膠質細胞和星形膠質細胞。已有研究顯示，TSPO與許多重要的生理功能有關。在膽固醇轉運和類固醇生成方面，現已明確TSPO能促使膽固醇從線粒體外膜向線粒體內轉運[1]。膽固醇是一種高親脂性化合物，起源于細胞內不同的位置，不能自由擴散到線粒體內。而外線粒體膜上的TSPO的膽固醇識別序列CRAC可以結合膽固醇促進其轉運到線粒體內。由于介導親脂性膽固醇從胞質中通過線粒體膜間隙水溶液導入線粒體內部，因此這是調節類固醇生成的限速步驟[2]。在線粒體中，膽固醇在線粒體內膜轉化成孕烯醇酮，孕烯醇酮在胞質中轉化為孕酮，再進一步代謝為別孕烯醇酮及其他神經類固醇。而神經類固醇作為神經調節遞質，影響多個神經遞質及其受體功能，并能調節情緒、記憶和應激行為[3]。在卟啉的運輸與積累方面主要與TSPO第二種亞型有關。TSPO主要分為兩種亞型，TSPO1普遍存在于大多數真核細胞的線粒體外膜，而TSPO2則主要與血紅素轉運有關，位于細胞膜、細胞核和內質網[4]。原卟啉IX(PPIX)是TSPO的內源性配體，PPIX一方面用于合成血紅素，另一方面未被用于合成血紅素的游離PPIX可通過一種與TSPO相關的蛋白(ABCG2)進入細胞質，通過這種方式可以調節細胞內PPIX的含量。此外，TSPO與中樞神經系統疾病的發生具有一定的相關性，如阿爾茨海默病[5-6]、顳葉癡呆癥[7]、多發性硬化癥[8]、亨廷頓病[9]、肌萎縮性側索硬化癥[10]和帕金森病[11]，以上疾病均伴有TSPO表達上調的現象。而不同種類的焦慮癥患者腦中TSPO水平均低于正常值[12]，而作為TSPO重要的下游神經類固醇別孕烯醇酮，在焦慮癥患者的血清、血漿和腦脊液中也發現含量顯著降低。此外，TSPO也參與細胞凋亡過程。當細胞在應激狀態下能促使MPTP通道開放，允許質子與水分子等小分子進入線粒體，線粒體膜內外質子濃度梯度和電勢梯度崩潰，大量水分子進入線粒體使線粒體內膜的嵴伸展變性，線粒體外膜膨脹破裂，導致細胞色素c和其他致凋亡蛋白釋放到細胞質中，最終導致線粒體途徑的細胞凋亡[13]。

斑馬魚作為一種模式生物由于其不可替代的優勢已經獲得越來越廣泛的應用，例如利用藥物處理、外科手術或者基因編輯技術構建人類疾病模型，可以實現藥物的高通量篩選，極大地促進了藥物研發進程。本研究利用實驗室前期已構建成功的tspo功能缺失斑馬魚（tspocpu87）[14]與野生型斑馬魚進行對比，探索了tspo敲除突變體斑馬魚的部分表型，為進一步闡明tspo的生理功能以及相關疾病提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

尼羅紅(上海阿拉丁公司)；醋酸鈉(南京化學試劑公司)；鄰聯茴香胺(上海安譜公司)；過氧化氫、膽固醇、三卡因(美國Sigma公司)；95%乙醇、CMC-Na(上海滬試公司)；斑馬魚基礎飼料(美國Zeigler公司)；SZX16體式熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；SSC-DC578P彩色攝像機(日本Sony公司)；光照恒溫培養箱(寧波賽福公司)。

1.2 動物

野生型AB系成年斑馬魚種魚購自武漢國家斑馬魚資源中心，南京睿鷹潤澤生物醫藥科技有限公司斑馬魚實驗室自行繁育。tspo基因敲除突變體斑馬魚(tspocpu87)由實驗室前期構建并繁育。維持循環水系統28.5℃，每天固定光照時間為14 h、黑暗時間為10 h，每天喂食2次。

1.3 胚胎的收取

實驗前一天晚上分別取相同月齡的AB和tspocpu87成年斑馬魚，相同品種的斑馬魚雌雄各一置于繁殖缸的隔板兩側，實驗當天早上八點半抽去隔板使雌雄斑馬魚自由交配產卵，1小時后收取胚胎并計數。將胚胎用egg water洗凈后置于28.5℃光照培養箱中，后續可進行其他實驗。

1.4 HCD造模

將斑馬魚胚胎隨機分為四組：AB對照組，AB高脂組，tspocpu87對照組，tspocpu87高脂組。胚胎發育前四天在玻璃皿中孵化，每天換一次水。第五天斑馬魚開始進食，普通飼料喂養一天，防止直接高脂飲食造成肝臟損傷，并將幼魚從表面皿換到圓缸飼養。第六天起對照組給與普通飼料，高脂組給與高脂飼料，在高脂飼養的第5、10、15天分別進行尼羅紅染色。

正常飼料與高脂飼料的配制：將膽固醇與基礎飼料溶解于乙醚中，研磨均勻，適度加熱使粉體干燥，高脂飼料中膽固醇含量為8%。正常飼料的配置方法同上，但不添加膽固醇。

1.5 尼羅紅染色

尼羅紅是一種親脂性熒光染料，可以對甘油三酯和脂肪酸進行染色。將斑馬魚幼魚轉移至0.5ug/mL尼羅紅染液中避光染色30min，用egg water清洗3次，拍照前將斑馬魚置于0.4%三卡因溶液中麻醉，將已麻醉的斑馬魚轉移到涂有4%CMC-Na凝膠的載玻片上，調整體態，在熒光顯微鏡下觀察被染成橘黃色的脂質并拍照。

1.6 行為學測量

取相同月齡的AB和tspocpu87成年斑馬魚雌雄各八尾分別進行以下實驗。

1.6.1 曠場實驗(Open Field Test)

準備一個長30 cm，寬30 cm，高9 cm的正方形魚缸，魚缸在水平方向上分為兩個區域：中間區域(upper zone)，邊緣區域(bottom zone)。攝像機放置于魚缸上方記錄5 min斑馬魚在水平方向上的運動視頻。處理視頻資料并分析統計每尾斑馬魚運動軌跡，運動熱圖，總移動距離，移動速度，靜止時間，靜止頻率。

1.6.2 新魚缸實驗(Novel Tank Test)

準備一個上底26 cm，下底21 cm，高15 cm，寬6 cm的梯形狹窄透明魚缸，最大程度裝滿水，在魚缸的背面和側面貼上白色紙張有利于記錄斑馬魚的行動軌跡，魚缸在垂直方向上分為上下兩個區域：頂部區域(upper zone)，底部區域(bottom zone)。攝像機放置于魚缸側面記錄5 min斑馬魚在垂直方向上的運動視頻。處理視頻資料并分析統計每尾斑馬魚運動軌跡，運動熱圖，總移動距離，移動速度，靜止時間，靜止頻率。

1.7 血紅蛋白染色

用配置好的鄰聯茴香胺染液對發育至48 hpf時期的斑馬魚胚胎進行血紅蛋白染色，將胚胎置于6孔板中，每孔加入2 mL染液，避光染色15 min，用egg water清洗3次，將斑馬魚轉移到涂有4% CMC-Na凝膠的載玻片上，調整體態使幼魚腹面朝上，于顯微鏡的明場下觀察并拍照。

鄰聯茴香胺染液的配制：取鄰聯茴香胺粉末60 mg，醋酸鈉30 mg，無水乙醇40 mL，30%過氧化氫650μL，用TBST定容至100 mL。配置該染液時注意避光操作，現配現用。

1.8 斑馬魚尾鰭再生實驗

取成年斑馬魚(4 months post fertilization)，于0.4%三卡因溶液中麻醉，置于玻璃板上。使用手術刀整齊切除1/3尾鰭，于顯微鏡明場下拍照。盡快放回水中待其蘇醒，七日后再次拍照，對比尾鰭再生的狀況。

2 結果

2.1 tspo敲除抑制高膽固醇飲食誘導的斑馬魚幼魚脂質蓄積

TSPO參與了膽固醇進入線粒體的轉運，將膽固醇轉化為類固醇的前體孕烯醇酮，這是類固醇生成的第一步，也是限速的一步。尼羅紅染色反映了斑馬魚體內脂質蓄積的程度。結果顯示，在AB型斑馬魚中，高脂組的熒光強度大于對照組，在tspo敲除斑馬魚中也體現這一趨勢，高脂組的脂質蓄積程度大于對照組。同時，tspo敲除斑馬魚中無論是對照組還是高脂組的熒光強度均弱于AB型斑馬魚中對應的組（圖1）。這說明tspo敲除型斑馬魚在脂質蓄積方面與AB型斑馬魚存在差異，驗證了TSPO參與膽固醇轉運的生理功能。

圖1 AB型斑馬魚與tspo敲除型斑馬魚的尼羅紅染色。比例尺=400 um。

2.2 TSPO功能缺失的斑馬魚表現出抑郁焦慮癥狀

斑馬魚的曠場實驗與新型魚缸實驗通常用于檢測斑馬魚的焦慮與抑郁狀態。當斑馬魚被放入一個全新魚缸內，最初在邊緣地帶滯留時間和沉底時間較多，且更偏向于靜止不動。當斑馬魚適應該環境后，在該區域中心地帶和頂部區域滯留時間和運動均增加。斑馬魚自發地接近該領域邊緣地帶的特征稱為趨觸性，自發地接近該領域底部的特征稱為趨地性。由于焦慮通常是伴隨著探索性行為的減少以及趨觸性和趨地性。所以通常認為，斑馬魚在魚缸邊緣區域和下半部分的時間越長，運動距離減少和速度降低，靜止時間越久和次數越多更偏向于焦慮狀態。

在曠場實驗中，tspocpu87斑馬魚比AB型斑馬魚更喜歡繞著魚缸邊緣探索，較少去到魚缸的中間區域，在新型魚缸實驗中，tspocpu87斑馬魚更傾向于在魚缸底部運動。并且無論在曠場實驗還是新型魚缸實驗中，tspocpu87斑馬魚的移動距離更短，速度更慢。此外，曠場實驗中tspocpu87斑馬魚的靜止時間和靜止頻率都高于AB型斑馬魚，但在新型魚缸實驗中二者差異無統計學意義（圖2）。從整體來說，tspo基因敲除后，斑馬魚更偏向于在魚缸邊緣區域和底部區域活動，更多的靜止狀態，表現出更高的焦慮抑郁傾向。

圖2 tspo敲除型斑馬魚具有抑郁焦慮的傾向

2.3 TSPO功能缺失影響斑馬魚的繁殖能力

對AB型和tspocpu87斑馬魚的產卵數量進行比較，結果表明二者之間具有顯著性差異。tspocpu87斑馬魚的產卵數量顯著低于AB斑馬魚（圖3）。由此判斷tspo敲除使斑馬魚的繁殖力降低。我們推測這可能是由于TSPO功能缺失使斑馬魚膽固醇轉運過程受到影響，進而影響到斑馬魚體內各類激素合成。但tspocpu87中激素水平尚有待進一步研究。

圖3 AB型斑馬魚與tspo敲除型斑馬魚的產卵數量統計（n=48對/基因型）

2.4 tspo基因可能不參與斑馬魚血紅蛋白的生成

TSPO主要分種亞型，TSPO1普遍存在于大多數真核細胞的線粒體外膜，而TSPO2則主要與血紅素轉運有關[15]。鄰聯茴香胺主要對血紅蛋白進行著色，可以反映紅細胞的分布。有文獻報道，使用抑制劑PK11195和Morpholinos兩種方式抑制tspo功能均能顯著抑制斑馬魚初始造血能力[16]。但本研究結果顯示，tspocpu87斑馬魚的紅細胞著色程度和區域大小均與AB型斑馬魚差異無統計學意義。且使用TSPO抑制劑PK11195（10 uM）也不影響斑馬魚紅細胞的表達（圖4）。由此我們推論tspo敲除不影響斑馬魚血紅蛋白的表達。而已有研究中利用Morpholinos敲降斑馬魚tspo影響斑馬魚血紅蛋白生成可能是由于MOs的非特異性或毒性所造成的。

圖4 tspo基因敲除與PK11195（10 uM）對斑馬魚血紅蛋白含量的影響。比例尺=400 um。

2.5 TSPO功能缺失不影響斑馬魚成魚的組織再生

由于TSPO參與細胞凋亡過程，而細胞凋亡在組織重塑、再生和形態形成過程中起到了重要作用[17]，所以我們探究了tspo功能缺失是否影響成年斑馬魚組織再生能力。我們選取相同月齡的AB型和tspocpu87成年斑馬魚進行尾鰭部分切除，觀察尾鰭再生狀況。結果顯示，tspocpu87斑馬魚尾鰭再生區域的大小與形狀均與AB型斑馬魚相似，未表現出顯著差異（圖5）。因此，我們推測tspo敲除不影響斑馬魚成魚的組織再生能力。

圖5 tspo功能缺失對斑馬魚組織再生的影響。比例尺=400 um。

3 討論

TSPO作為一種廣泛分布的位于線粒體外膜的跨膜蛋白，與許多重要的生理功能有關，包括膽固醇轉運和類固醇生成，細胞呼吸和免疫調節等。TSPO一般在腦組織中表達程度很低，但TSPO的表達水平在由炎癥介導的小膠質細胞激活時明顯提高，是反映小膠質細胞活化的敏感的生物指標，這一特性決定了TSPO可作為檢測神經炎癥的靶點[18]。在臨床上，TSPO配體常用于正電子發射斷層成像技術(Positron Emission Tomography, PET)。但我們對TSPO的更為詳細的生理功能以及如何發揮效應仍知之甚少，這仍需要大量的工作去闡述。

我們首先探究了tspo基因敲除對斑馬魚脂質方面的影響，從尼羅紅染色結果可以看出tspo敲除的確影響了膽固醇在斑馬魚體內的合成與蓄積，這與文獻報道一致。由于膽固醇合成受阻可能會影響到下游產物四氫孕酮含量降低，而四氫孕酮與抑郁水平顯著相關，并且四氫孕酮具有抗焦慮和鎮靜的作用，已被FDA批準用于治療產后抑郁癥。繼而我們從行為學實驗驗證了tspocpu87斑馬魚的抑郁傾向。同時性激素中的孕甾酮等受類固醇合成抑制的影響，也可能是tspocpu87斑馬魚生殖力下降的原因之一[19]，具體表現為產卵數量的降低。此外我們還探究了tspo在造血方面是否發揮作用，結果顯示tspocpu87斑馬魚表現出與野生型斑馬魚相似的血紅蛋白合成能力，并沒有表現出明顯差異。并且tspo基因缺失也沒有在組織再生方面產生效應，具體表現為tspocpu87斑馬魚尾鰭再生程度與AB型斑馬魚相似。本研究只是初步探究了tspo-/-斑馬魚部分表型，更為深入的機制研究以及TSPO的其他功能的探索有待后續進一步的研究。