黑美人馬鈴薯結合態和游離態多酚氧化酶的酶學性質研究

劉 輝，盧 揚，李 俊，范士杰，王立新，王 輝,*

（1.貴州省農業科學院生物技術研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省農業生物技術重點實驗室，貴州 貴陽 550006；3.貴州省畢節市農業技術推廣站，貴州 畢節 551700）

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）含有銅離子，廣泛分布于動物、植物、真菌和細菌中[1]。在有氧條件下，PPO先將單羥基酚氧化成鄰二酚，再將鄰二酚氧化成鄰醌，最后聚合成褐色素[2]。一般認為，PPO在植物細胞內存在游離態（Soluble PPO，sPPO）和膜結合態（Membrane-bound PPO，mPPO）兩種形式，且這兩類同工酶間的性質差異較大[3-5]。當細胞膜結構受到破壞，mPPO便游離出來，從而使PPO酶活力顯著提高，引起果蔬褐變，造成變色、變味、軟化及營養下降等不良后果，導致果蔬的市場價值降低[6-7]。

由于mPPO的存在，使PPO的酶活力問題研究起來十分復雜。目前，國內外已經開始對膜結合態PPO進行研究，并且取得了較好的研究結果。如Zaini等[8]通過非離子型去污劑Triton X-114、熱誘導相分配技術、硫酸銨沉淀法及瓊脂糖凝膠層析等技術，成功地從蛇皮果中分離純化出膜結合態多酚氧化酶，并對它的酶學特性進行了研究；Liu等[3]通過硫酸銨沉淀法及DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換法對蘋果膜結合態PPO進行了純化，并研究了其三維結構，同時與蘋果的游離態PPO的性質進行了比較，發現它們在一定pH值及溫度范圍內的酶活力有差異，膜結合態PPO酶活力要顯著高于游離態，且反應的最適底物也不一致。在馬鈴薯PPO的研究中，為降低馬鈴薯塊莖發生的酶促褐變，探究其PPO的性質，對馬鈴薯PPO進行分離和性質研究受到廣泛關注。目前，對游離態PPO的分離純化及性質研究較多，如孟雅等[9]采用硫酸銨分級沉淀法、凝膠層析法及分級沉淀和層析相結合的方法對馬鈴薯PPO進行了純化，并研究了其在不同工藝條件下的酶活力變化。對馬鈴薯膜結合態PPO的研究仍屬空白，且尚無可靠的分離純化方法，對其性質更是缺乏系統的了解。課題組前期已經完成了大西洋馬鈴薯sPPO與mPPO酶學性質的研究[10]，但是不同品種（系）馬鈴薯塊莖酶促褐變程度不同，且不同品種（系）馬鈴薯PPO分離方法及酶學性質也存在差異[11-12]。黑美人馬鈴薯是我國自主培育出的彩色優質馬鈴薯新品系，因其富含花青素，所以具有抗氧化作用[13]。該品種由貴州省生物技術（馬鈴薯）研究所從國際馬鈴薯中心引進，并已經成為貴州省冬作區的主要栽培品種之一。本試驗以黑美人馬鈴薯為原料，分別提取sPPO和mPPO粗酶，并對兩種酶進行酶學性質研究，為進一步了解PPO性質和提升特色馬鈴薯資源優勢提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

黑美人馬鈴薯塊莖，為貴州省生物技術研究所提供的新鮮馬鈴薯。

磷酸氫二鈉、聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、間苯二酚、焦性沒食子酸、亞硫酸鈉、抗壞血酸、綠原酸等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

FA2104電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Infinite M200 Pro NanoQuant酶標儀，瑞士Tecan Group Ltd；UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；TGL-20臺式高速冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；A11基本型分析研磨機，艾卡（廣州）儀器設備有限公司；HH-1恒溫水浴鍋，常州市金壇區環宇科學儀器廠；SB-5200DTS超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UPT-II-10T超純水機，西安優普儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯PPO粗酶液提取方法

馬鈴薯PPO粗酶液提取參考蘋果[3,14]和梨[5]PPO的提取方法。將200 g馬鈴薯洗凈、切塊，加入0.05 mol/L、pH值為6.8的預冷磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（含2%的交聯聚維酮（PVPP）），料液比1∶1（g/mL），經研磨機研磨攪碎，4℃下，10 000 r/min離心20 min，上清液即為sPPO粗酶液。沉淀用5倍體積去離子水沖洗干凈，按固液比1∶2（g/mL）加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液、0.15%Triton X-100勻漿，室溫下超聲（超聲功率為360 W）處理10 min并靜置1 h；4℃下11 000 r/min離心15 min。置于冰箱30 min，然后35℃水浴保溫15 min。25℃離心15 min，上清液即為mPPO粗酶液。

1.2.2 馬鈴薯PPO特征吸收波長的確定

利用紫外分光光度計測定特征波長[15]。以鄰苯二酚為底物，用0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.8）配制成底物溶液，取2.5 mL底物溶液，加入0.5 mL PPO粗提液，混勻，在25℃下對混合液進行波長掃描，確定特征吸收波長。

1.2.3 PPO酶活力測定

以鄰苯二酚為底物分別測定馬鈴薯sPPO和mPPO的酶活力。PPO酶活力測定方法如下：用磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.8）配制鄰苯二酚（0.01 mol/L）底物溶液[15]。將0.3 mL酶液與2.5 mL上述緩沖液混合后，加入0.2 mL底物溶液開始反應。用分光光度計測定反應液1 min內在特征吸收波長下的吸光度變化值（A1）。對照煮沸10 min的相應酶液的吸光度值（A0）。在測定條件下吸光度值改變0.001所需的酶量為一個酶活單位（U）。

式中：t為反應時間，min；M為粗酶蛋白的質量，mg。

1.2.4 PPO蛋白濃度測定方法

以考馬斯亮藍法進行蛋白含量測定。取10μL酶液于酶標板中，依次加入10μL磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.2）、200μL G250染色液（0.01%），室溫下反應10 min，置于酶標儀中于595 nm下測定吸光度值。以牛血清蛋白（BSA）為標樣制作蛋白標準曲線。

1.2.5 pH值對PPO酶活力的影響

依照“1.2.3”的方法測定PPO酶活力，其中酶反應緩沖液分別選定pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的0.05 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液[3]。將測得的最大單位酶活力值記為100%，計算其他反應pH值下的PPO相對酶活力。

1.2.6 反應溫度對PPO酶活力的影響

先將緩沖溶液和底物溶液分別置于溫度為20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃水浴槽中預熱10 min，然后迅速加入0.3 mL酶液，混勻，分別測定酶活力。將測得的最大單位酶活力值記為100%，計算其他反應溫度下的PPO相對酶活力。

1.2.7 底物對PPO酶活力的影響

以鄰苯二酚、間苯二酚、綠原酸和焦性沒食子酸溶液為底物，在底物濃度分別為10、20、30、40、50 mmol/L條件下測定酶活力。

1.2.8 PPO動力學常數測定

依照“1.2.3”的方法對PPO酶活力進行測定，其中反應底物分別選用反應體系中終濃度分別為4、12、16、20、24、30 mmol/L的鄰苯二酚、焦性沒食子酸溶液，作反應底物濃度與單位酶活力的雙倒數圖，根據斜率公式計算米氏常數（Km）和最大反應速度（Vmax）值。

1.2.9 抑制劑對PPO酶活力的影響

分別以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、亞硫酸鈉、抗壞血酸、草酸、植酸、檸檬酸、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+為抑制劑，依照“1.2.3”的方法對PPO酶活力進行測定（以上抑制劑終濃度均為1.00 mmol/L），將未加抑制劑的酶樣品單位酶活力值記為100%，計算添加不同濃度抑制劑的PPO相對酶活力。

1.2.10 PPO熱穩定性測定

依照Zhou等[5]的方法略作修改后進行測定。將sPPO和mPPO粗酶提取液分別置于30、40、50、60℃水浴鍋中保溫10 min后立即冷卻至室溫，依照“1.2.3”方法對PPO酶活力進行測定。將未經熱處理的酶樣品單位酶活力值記為100%，計算添加不同溫度下PPO殘留酶的相對酶活力。

1.2.11 數據處理

所有數據進行3次重復試驗，結果以xˉ±s表示。使用SPSS 18.0對數據進行方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 黑美人馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶液的制備

黑美人馬鈴薯PPO經提取后，分別得到sPPO和mPPO粗酶液。經測定，兩種粗酶液的蛋白濃度分別為（5.51±0.01）mg/mL和（0.30±0.01）mg/mL。由于鄰苯二酚最大吸收波長為277 nm，且在可見光區無吸收，故從圖1可知，sPPO和mPPO的最大吸收波長分別為403 nm和406 nm。周向軍等[16]研究也發現，黑美人馬鈴薯PPO的最大吸收波長為413 nm，與本研究結果相似。一些研究中，PPO最大吸收波長為420 nm，推斷跟不同馬鈴薯品種的PPO性質不同有關，或者與粗提液中同工酶的作用有關，也可能由于PPO與底物反應產生的產物存在差異[3,7,16]所致。

圖1 黑美人馬鈴薯mPPO與sPPO的波長掃描圖Fig.1 Wavelength scanning charts of mPPO and sPPO in black beauty potatoes

2.2 pH值對黑美人馬鈴薯PPO粗酶活力的影響

不同pH值對馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶活力的影響見圖2。如圖2A所示，當pH值為7時，sPPO和mPPO的相對酶活力均達到最大；當pH值為8時，sPPO和mPPO相對酶活力分別為50.54%±0.28%和72.31%±0.58%，均極顯著低于pH7時的活力（P＜0.01）；當pH值小于7時，sPPO和mPPO相對酶活力均隨pH降低而減小，但sPPO的相對酶活力高于mPPO，表明sPPO在酸性條件下比mPPO更穩定。李瑜等[17]測得馬鈴薯中薯5號、中薯6號和費烏瑞它的PPO粗酶最適pH值為5.5，而王清等[18]測得甘農薯1號和甘農薯2號的PPO粗酶最適pH值分別為5和5.5。以上馬鈴薯PPO最適pH值均小于等于5.5，而在本試驗中，黑美人馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶的最適pH值均為中性，與以上報道存在明顯差異，這表明不同品種馬鈴薯PPO最適pH值存在差異性。用絕對酶活力進一步對sPPO和mPPO的酶活力進行比較，結果如圖2B所示，在測試的所有pH值下，mPPO的絕對酶活力均高于sPPO。類似的結果也發生在紅富士蘋果[3]和梨[5]的PPO中，推測跟兩種PPO在三維結構上存在酶的基團重排、同工酶或不同的酶活性中心相關[3,19]。

圖2 pH對馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶活力的影響Fig.2 Effects of pH on sPPO and mPPO activities in potato

2.3 反應溫度對黑美人馬鈴薯PPO粗酶活力的影響

不同反應溫度對馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶活力的影響如圖3所示。從圖3A可知，sPPO和mPPO的最適反應溫度分別為25℃和30℃；當反應溫度為20～70℃時，sPPO和mPPO粗酶的相對酶活力均呈現先增大后減小的變化趨勢，其中，當溫度為20℃時，sPPO和mPPO的相對酶活力分別為97.13%±0.56%和96.43%±0.42%，當溫度升至70℃時，sPPO和mPPO的相對酶活分別降為26.55%±0.56%和27.41%±0.84%。此外，溫度為25～70℃時，mPPO的相對酶活力比sPPO高，表明mPPO比sPPO更耐受高溫。王清等[18]報道，馬鈴薯品種Favorita和Snowden塊莖的PPO最適反應溫度為25℃；張洪等[20]和李瑜等[17]均報道馬鈴薯PPO最適反應溫度為30℃，表明不同品種馬鈴薯的塊莖多酚氧化酶最適反應溫度不一致。而在本試驗中，黑美人馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶的最適反應溫度略有不同，絕對酶活力存在差異（如圖3B所示），造成這種差異性的原因在于sPPO和mPPO所處的環境不一樣，導致酶活性中心與環境中底物的結合能力受影響[3,21]。

圖3 溫度對馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶活力的影響Fig.3 Effects of temperatures on sPPO and mPPO activities in potato

2.4 底物對黑美人馬鈴薯PPO粗酶活力的影響

分別以不同濃度的鄰苯二酚、間苯二酚、綠原酸和焦性沒食子酸為底物和sPPO、mPPO粗酶進行反應，對馬鈴薯兩種PPO粗酶的酶活力進行測定。結果表明，以綠原酸和間苯二酚為底物進行反應時均未檢測到酶活力，說明綠原酸和間苯二酚不是測定馬鈴薯PPO酶活力的底物。相關研究發現間苯二酚也不適合作為測定勐庫大葉種茶樹PPO酶活力的底物[22]。如圖4所示，當以鄰苯二酚和焦性沒食子酸為底物時mPPO酶活力均大于sPPO。當鄰苯二酚濃度為10 mmol/L時，sPPO和mPPO的酶活力均較低，分別為5.57 U/mg和17.07 U/mg；當焦性沒食子酸濃度為10 mmol/L時，sPPO和mPPO的酶活力分別為4.19 U/mg和18.97 U/mg。Batista等[23]報道了蘋果PPO對鄰苯二酚催化活力最高，這和本試驗結果一致。Liu等[5]報道以鄰苯二酚為底物時，桃sPPO的酶活力高于mPPO，這和本試驗結果差異較大，這表明sPPO和mPPO對不同底物的親和力不同。劉芳[19]的研究表明，不同的底物具有單酚、雙酚、多酚等不同的結構，同時甲基（-CH3）的數量和位置對底物特異性的決定性具有重大影響。因此，馬鈴薯sPPO和mPPO與某一底物間的親和力與自身同工酶構成及底物結構有關。

圖4 馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶在不同底物下的酶活力Fig.4 Enzymatic activities of sPPO and mPPO on different kinds of substrates

2.5 黑美人馬鈴薯PPO粗酶動力學常數

分別以鄰苯二酚、焦性沒食子酸為底物，以雙倒數作圖法測定黑美人馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶的動力學常數。如表1所示，以鄰苯二酚為底物時，sPPO粗酶Km值為39.423 mmol/L，Vmax為0.019 mmol·L-1·min-1，mPPO粗酶Km值為35.291 mmol/L，Vmax為0.290 mmol·L-1·min-1；以焦性沒食子酸為底物時，sPPO的Km值為205.896 mmol/L，Vmax為0.008 mmol·L-1·min-1，mPPO的Km值為205.067 mmol/L，Vmax為22.321 mmol·L-1·min-1。說明sPPO和mPPO存在較大的底物親和性差異。結果表明，sPPO對鄰苯二酚的親和性和最大反應速度均大于焦性沒食子酸；而與焦性沒食子酸相比，mPPO的親和性和最大反應速呈現相反趨勢。這表明sPPO和mPPO對底物具有不同選擇性，而這種差異可能會影響馬鈴薯褐變過程。

表1 黑美人馬鈴薯sPPO和mPPO動力學常數Table 1 Kinetic constants of sPPO and mPPO from black beauty potatoes

2.6 抑制劑對黑美人馬鈴薯PPO粗酶活力的影響

由圖5可知，抗壞血酸和亞硫酸鈉對sPPO和mPPO的酶活力抑制作用最強，其中，sPPO均已檢測不到酶活力，而mPPO的相對酶活力分別為0.84%±0.36%和1.46%±0.18%。張洪等[20]報道100 mg/kg亞

圖5 不同抑制劑對馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶活力的影響Fig.5 Effects of different inhibitors on sPPO and mPPO activities in potatoes

?硫酸鈉、150 mg/kg抗壞血酸能有效地抑制PPO的活力，這和本試驗結果一致。此外，植酸、草酸、檸檬酸和EDTA顯示出對sPPO和mPPO酶活力不同程度的抑制，其中，草酸對mPPO酶活力抑制較強，相對酶活力為61.96%±1.10%；而檸檬酸對sPPO酶活力抑制較強，相對酶活為81.49%±0.30%。Liu等[3]報道，檸檬酸對紅富士蘋果sPPO的半數抑制濃度（IC50）為90.0 mmol/L，大于植酸和EDTA，這和本試驗結果一致；但是，EDTA會激活紅富士蘋果mPPO的酶活力，這和本試驗結果正好相反。各金屬離子對sPPO和mPPO酶活力的影響不一，其中Na+、K+和Mg2+對sPPO和mPPO酶活力影響不大，Mn2+、Ca2+和Cu2+可顯著抑制sPPO和mPPO的酶活力，且對mPPO的影響要大于sPPO，這可能是由于不同PPO同工酶的蛋白質結構不同，使得各抑制劑的作用效果存在差異[21,24]。

2.7 黑美人馬鈴薯PPO粗酶的熱穩定性

由圖5可知，隨著溫度升高PPO粗酶酶活力逐漸降低，sPPO和mPPO在60℃時失活最明顯。但在相同溫度下，mPPO比sPPO更容易喪失酶活力。有研究報道，梨[5]和蘋果[3]的mPPO均比sPPO的溫度穩定性低，這和本試驗結果一致。研究表明，蘋果mPPO在轉運至葉綠體中后，葉綠體基質中多肽酶會將mPPO中的一段小肽切除，從而形成成熟的sPPO，因而mPPO是sPPO的不成熟前體[21]。這可能是馬鈴薯mPPO和sPPO熱穩定性存在差異的原因之一，但需要更多的證據支持。

圖6 馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶熱穩定性Fig.6 Thermostability of sPPO and mPPO in potatoes

3 結論

本文對黑美人馬鈴薯sPPO和mPPO酶學性質進行了研究。結果表明：黑美人馬鈴薯sPPO和mPPO的最佳吸收波長分別是403 nm和406 nm。和其他品種的馬鈴薯PPO相比，黑美人馬鈴薯sPPO和mPPO粗酶的最適反應pH值和最適反應溫度差異均較大。sPPO和mPPO在酸性條件下酶活力均較低，和sPPO相比，在試驗pH值和溫度條件下，mPPO的絕對酶活力均高于sPPO；抗壞血酸和亞硫酸鈉對PPO的酶活力抑制作用較強，且對sPPO的抑制作用要大于mPPO。因此，在黑美人馬鈴薯加工過程中，要重點考慮mPPO對酶促褐變的影響。