超聲波輔助異抗壞血酸處理對貯藏期鮮切蘋果的護色作用

賈 玉，張 芳，王夢茹，王雪瑩，李國琴，額日赫木

（山西師范大學食品科學學院，山西 臨汾 041004）

蘋果富含微量元素、碳水化合物、維生素等多種人體所需的營養成分，是公認的營養程度較高的水果之一。隨著人們生活水平的提高，生活方式與消費觀念的改變，蘋果的加工方式和消費形式也有了新的變化[1-3]。鮮切蘋果是經輕度加工的新式產品，具有新鮮、方便、營養、無公害等特點，深受消費者喜愛[4-5]。然而在去皮、切割等過程中，鮮切蘋果細胞組織內的酚類化合物與多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）直接接觸，逐漸發生氧化褐變，從而嚴重影響了鮮切產品的感官品質及營養價值。因此，提高鮮切產品品質和延長貨架期，是目前其在加工和貯藏過程中面臨的主要問題之一[6-7]。

異抗壞血酸（Erythorbicacid,EA）是抗壞血酸的異構體，在化學性質上與其相似，是一種新型且安全的食品保鮮劑，且抗氧化性能優于抗壞血酸[8-9]。袁芳等[8]研究了EA和氯化鈣聯合處理對鮮切芒果保鮮效果的影響，結果表明：1.0%EA處理可以使鮮切芒果保持較好的貯藏品質。陳鳳美[9]研究了不同濃度EA處理對灰樹花子實體采后品質的影響，結果表明：在4℃貯藏期內（0～27 d），0.1%EA處理維持了較高的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、過氧化氫酶（Catalase,CAT）及過氧化物酶（Peroxidase,POD）活性，延緩了丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量的上升，并通過降低PPO活性抑制了其褐變。超聲波（Ultrasound,US）作為非熱物理技術被廣泛應用于食品行業各領域中[10-12]。它與傳統的熱加工和化學加工技術相比，可避免食品中殘留化學物質對人體的負面影響，能更好地保持食品原有風味。近年，由于US在鮮切果蔬護色保鮮方面也取得了不錯的效果，因而備受業內人士的關注[13]。楊明冠等[14]的研究表明，US處理（30℃，600 W，90 min）可以顯著鈍化鮮切蘋果的PPO活性，在一定的US處理時間內，其PPO活性隨著US功率的增大而降低，有效降低了貯藏期鮮切蘋果的褐變。潘艷芳等[15]的研究表明，鮮切甘薯經40 kHz US處理10 min后，顯著抑制了其PPO和POD活性的上升，延緩了貯藏期鮮切甘薯的褐變。楊明冠等[16]的研究表明，鮮切馬鈴薯經600 W US處理90 min后，其PPO活性得到了顯著抑制，與未處理樣品比較，其PPO活性降低了45.79%。由此可見，EA和US在鮮切果蔬護色保鮮方面已擁有良好的應用基礎。但目前就US輔助EA處理對鮮切蘋果護色保鮮的相關研究還尚未見報道。

本研究利用US輔助EA（US-EA）處理鮮切蘋果，考察其對貯藏期鮮切蘋果褐變指數（Browning index,BI）、PPO、POD、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase,PAL）活性、多酚和MDA含量等相關指標的影響，系統分析US-EA處理對鮮切蘋果的護色作用，以期為鮮切蘋果護色保鮮研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

紅富士蘋果，購于臨汾市堯豐市場，挑選大小均一、色澤均勻、無損傷的新鮮果實，于4℃、相對濕度為90%條件下貯藏，備用。

異抗壞血酸（食品級），深圳樂芙生物科技有限公司產品；L-苯丙氨酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品；福林酚，上海源葉有限公司產品；鄰苯二酚，南京化學試劑股份有限公司產品；愈創木酚、硼砂，天津市光復科技發展有限公司產品；聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、硼酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉，均為天津市科密歐有限公司產品。以上化學試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

NR110型色差計，三恩時科技有限公司；LC-Q01型切片機，佛山市順德區韓泰電器有限公司；KQ300E型超聲波清洗器（40 kHz頻率），昆山市超聲儀器有限公司；752型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；PHS-25型數顯pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鮮切蘋果的護色處理

蘋果清洗后切成厚度3 mm、直徑20 mm的鮮切蘋果片，備用。

US處理：鮮切蘋果置于US清洗槽內（內含3 000 mL蒸餾水），在40 kHz、300 W的US功率下處理2.5 min。

EA處理：將鮮切蘋果置于3 000 mL EA溶液（0.5 g/L）中浸泡2.5 min。

US-EA處理：將鮮切蘋果置于US清洗槽內，加入3 000 mL EA溶液（0.5 g/L），在40 kHz、300 W的US功率下處理2.5 min。

以無任何處理的鮮切蘋果作為對照（CK），考察上述3種處理方式對鮮切蘋果的護色效果。將處理后的鮮切樣品于4℃貯藏1 h，以ΔBI值為指標篩選出最佳的護色處理方式。

1.2.2 鮮切蘋果的貯藏

將對照組和US-EA處理組鮮切蘋果分別用聚乙烯保鮮膜（厚度0.01 mm，寬40 cm）包好，置于4℃、相對濕度為90%條件下貯藏96 h，每24 h取1次樣，檢測其在貯藏期內各項生理生化指標的變化。

1.2.3 測定項目與方法

1.2.3.1 總色差值（ΔE）和BI值

1.2.3.2 PPO、POD活性

參考Zhang等[18]的方法，并稍有修改。稱取5 g鮮切蘋果樣品，加入10 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.5），冰浴研磨，4℃低溫條件下10 000 r/min離心15 min，得到上清液，即粗酶液。

PPO活性的測定：依次取2.5 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 5.5），1 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚溶液及1 mL粗酶液，混勻后測定其在410 nm處的吸光值。每30 s記錄1次，共記錄3 min。以1 mL磷酸緩沖溶液代替粗酶液作為空白對照。酶活性的定義為：以每分鐘反應體系吸光值增加0.01為1個酶活性單位（U）。

POD活性的測定：依次取2.5 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 5.5），1 mL 0.02 mol/L愈創木酚溶液及2 mL 0.02 mol/L H2O2混勻，再加入1 mL酶液搖勻，在470 nm處測定其吸光值，每30 s記錄1次，共記錄3 min。以1 mL磷酸緩沖溶液代替粗酶液作為空白對照。酶活性的定義為：以每分鐘反應體系吸光值增加0.01為1個酶活性單位（U）。

1.2.3.3 PAL活性

參照Liu等[19]的方法測定，略有改動。稱取5 g樣品，加入10 mLPAL提取劑，冰浴研磨，4℃下10 000 r/min離心30 min，得到上清液（樣液），備用。分別取3 mL H3BO3緩沖溶液（50 mmol/L，pH 8.8）和0.5 mL 20 mmol/L的L-苯基丙胺酸溶液，搖勻，于37℃下水浴10 min，再加入0.5 mL樣液，混勻，于290 nm處測定其吸光值。再將上述混合液在37℃下水浴1 h后在290 nm處測定其吸光值。以1 h內反應體系的A290變化0.01為PAL的一個活性單位（U）。

1.2.3.4 多酚含量

參照Piccolella等[20]的方法測定，略有修改。稱取5 g樣品，加入15 mL 80%（V/V）的乙醇溶液，冰浴研磨，4℃低溫10 000 r/min離心15 min，取上清液為樣液，備用。依次取0.3 mL樣液、1.5 mL 0.25 mol/L福林酚試劑，混勻后放置3 min，再加入0.5 mL 20%（m/m）的碳酸鈉溶液，于暗處反應1 h后在725 nm測定其吸光值。根據標準曲線計算鮮切蘋果的多酚含量（mg·100 g-1FW）。

今天我看朋友圈，一條消息讓我感動，源于一個普通人的出乎意外的舉動——火車站賣票處，排著長長的隊，一個女人乘坐的火車快要到點了，她走到排在第二位的男人面前，懇求讓她先買票，那個男人讓她進來，而他自己則走到隊伍的最后面重新排隊。原本，他可以讓這個女人插號的，這樣的話也已經算得上仁善，可是，他讓給她位置，自己重新去排隊。這，是教養！

1.2.3.5 MDA含量

參照Liu等[21]的方法測定，并有改動。稱取5 g樣品，加入10 mL 0.61 mol/L TCA提取液，研磨，4℃低溫10 000 r/min離心20 min，取上清液，備用。依次取3 mL 0.6%TBA（m/m）溶液和3 mL的樣液混勻，沸水水浴15 min。再將上述混合液4℃低溫10 000 r/min離心15 min，并分別在450、532、600 nm處測定其吸光值，并計算MDA含量（mmol·g-1FW）。以3 mL 0.61 mol/L TCA溶液代替樣液作為空白對照。

1.2.4 數據處理

試驗所得數據均為3次重復，2次平行，結果以平均值±標準偏差的形式表示，采用Origin 2018軟件繪圖，采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件對數據進行統計學分析，采用Duncan多重比較法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 最佳護色處理方式的篩選

如圖1所示，單獨的US處理和EA處理后，鮮切蘋果的ΔE均顯著低于對照組（P＜0.05），表明這兩種處理方式均能顯著抑制貯藏期（1 h）鮮切蘋果的褐變，且EA處理明顯優于US處理。鮮切蘋果樣品經US-EA復合處理后，其ΔE顯著低于兩種單獨處理的鮮切蘋果樣品（P＜0.05），即ΔE分別降低了78.95%和59.49%。由此可見，在3種護色方式中，US-EA復合處理對鮮切蘋果的護色效果最佳。

圖1 不同處理對鮮切蘋果ΔE的影響Fig.1 Effect of different treatment onΔE of fresh-cut apple

2.2 US-EA處理對貯藏期鮮切蘋果生理生化指標的影響

2.2.1 US-EA處理對貯藏期鮮切蘋果BI值的影響BI值能夠直接反映鮮切蘋果的褐變程度，BI值越大表明褐變越嚴重[17]。由圖2可知，在貯藏0～96 h內，US-EA處理組和對照組鮮切蘋果的BI值均呈上升趨勢，但US-EA處理組的BI值均顯著低于同期的對照組（P＜0.05）。特別是在貯藏24 h時，US-EA處理組BI值低于對照組57.36%，隨后仍然保持較高的差異性。同時，由圖3可知，從貯藏24 h開始，對照組鮮切蘋果的外觀顏色逐漸加深，而US-EA處理組顏色變化不明顯，這證明US-EA處理可以有效抑制鮮切蘋果的褐變，從而延長貨架期。

圖2 US-EA處理對貯藏期鮮切蘋果BI值的影響Fig.2 Effect of US-EA treatment on BI value of fresh-cut apple during storage

圖3 US-EA處理對貯藏期鮮切蘋果外觀色澤的影響Fig.3 Effect of US-EA treatment on exterior colour of fresh-cut apple during storage

2.2.2 US-EA處理對鮮切蘋果PPO活性的影響

PPO是造成鮮切果蔬產品氧化褐變的關鍵因素之一。因此，抑制PPO活性對鮮切果蔬護色保鮮具有重要意義。由圖4可知，在0～96 h貯藏期內，對照組和US-EA處理組鮮切蘋果的PPO活性均呈上升趨勢。但在貯藏72 h內，US-EA處理組PPO活性顯著低于對照組（P＜0.05），而在貯藏96 h時無顯著性差異。隨著貯藏時間的延長（貯藏96 h），EA的自身氧化速率加快，導致抑制能力被削弱，進而導致鮮切蘋果PPO活性上升。另外，一些學者認為US可以通過改變鮮切果蔬PPO分子空間結構而鈍化或滅活其活性[22-23]，但隨著貯藏時間的延長，PPO分子空間結構可能再次產生變化，繼而促使其活性進一步上升。由此可見，US-EA復合處理能顯著抑制貯藏期鮮切蘋果的PPO活性。

圖4 US-EA處理對貯藏期鮮切蘋果PPO活性的影響Fig.4 Effect of US-EA treatment on PPO activity of fresh-cut apple during storage

2.2.3 US-EA處理對鮮切蘋果POD活性的影響

POD活性的升高會加劇鮮切果蔬的氧化變色，它是衡量鮮切果蔬衰老的重要指標之一[24]。由圖5可知，在0～96 h貯藏期內，對照組和US-EA處理組鮮切蘋果POD活性總體呈波動性上升趨勢，特別是在貯藏48 h后上升幅度較大，但US-EA處理組POD活性（除48 h外）顯著低于對照組（P＜0.05）。在貯藏96 h時，US-EA處理組與對照組比較，其POD活性仍低27.1%。這表明US-EA復合處理能顯著降低貯藏期鮮切蘋果的POD活性。POD在H2O2存在時可以氧化酚類物質生成醌類物質，進一步縮合可形成褐色的聚合物[25]。一般許多果蔬組織中POD活性都伴隨機械性損傷而升高，但在貯藏期內，US-EA處理組與對照組比較其POD活性上升幅度較小。這可能與US有關，由于US產生瞬態空化作用，導致大量自由基的形成，高能量的自由基直接攻擊POD分子結構發生變化，影響其活性中心結構，從而鈍化其活性[26]。另外，也可能與EA極強的抗氧化性有關，EA的抗氧化作用可以防止活性氧蓄積，從而抑制POD活性的升高[9]。

圖5 US-EA處理對貯藏期鮮切蘋果POD活性的影響Fig.5 Effect of US-EA treatment on POD activity of fresh-cut apple during storage

2.2.4 US-EA處理對鮮切蘋果PAL活性的影響

PAL是苯丙烷代謝途徑的關鍵限速酶，它能催化苯丙氨酸向酚類物質轉變。由圖6可知，在整個貯藏期內，對照組鮮切蘋果PAL活性呈先下降后上升趨勢，在貯藏48 h時，PAL活性最低，這可能與低溫貯藏環境抑制PAL活性有關，而隨著貯藏時間的延長，PAL活性大幅升高，這可能與機械性損傷誘導鮮切蘋果PAL活性上升有關[27]。但在整個貯藏期內，US-EA處理組鮮切蘋果PAL活性上升幅度較小，且始終低于同期對照組，說明US-EA處理顯著抑制了貯藏期鮮切蘋果的PAL活性，從而延緩酚類化合物的合成與積累。

圖6 US-EA處理對貯藏期鮮切蘋果PAL活性的影響Fig.6 Effect of US-EA treatment on PAL activity of fresh-cut apple during storage

2.2.5 US-EA處理對鮮切蘋果多酚含量的影響

由圖7可知，在整個貯藏期內，對照組鮮切蘋果多酚含量變化趨勢較為復雜，在貯藏24 h和72 h時，與初值比較其多酚含量顯著下降（P＜0.05），而在48 h和96 h時無顯著變化。另外，US-EA處理組多酚含量在貯藏24 h時顯著降低，隨后趨于平穩，但與對照組比較，仍然保持了較高的多酚含量。EA是具有較高抗氧化活性的化合物，它可以將酶促褐變氧化中間產物醌還原為酚類物質，阻止醌類物進一步自發聚合形成色素物質[28]。同時，US可通過改變鮮切蘋果PPO和POD的分子結構而降低其活性，從而減少酚類物質的進一步消耗。因此，這可能是造成US-EA處理組鮮切蘋果多酚含量始終高于對照組的原因。

圖7 US-EA處理對貯藏期鮮切蘋果多酚含量的影響Fig.7 Effect of US-EA treatment on polyphenol content of fresh-cut apple during storage

2.2.6 US-EA處理對鮮切蘋果MDA含量的影響

由圖8可知，US-EA處理組鮮切蘋果MDA含量在貯藏0～72 h內呈小幅下降趨勢，隨后（72～96 h）略有上升。然而，對照組MDA含量在貯藏24 h和初值比較顯著上升，并達到最大值，隨后呈下降趨勢。在正常情況下，植物體內的氧自由基處于產生與清除的動態平衡中，然而逆境條件下可以破壞自由基代謝的平衡而引起膜脂的過氧化反應[29]。EA作為一種抗氧化劑，可清除植物體內過量的自由基，從而可以抑制膜脂的過氧化反應。由此可見，在貯藏初期（24 h），US-EA處理顯著降低了MDA的生成，減少了鮮切蘋果細胞膜脂的氧化程度，降低了其氧化損傷，貯藏品質得到了有效保持。

圖8 US-EA處理對貯藏期鮮切蘋果MDA含量的影響Fig.8 Effect of US-EA treatment on MDA content of fresh-cut apple during storage

3 結論與討論

在加工過程中，鮮切果蔬由于受到機械損傷而易發生氧化褐變，導致其感官品質和營養價值下降[5-7]。在正常情況下，植物細胞中的氧化酶類與酚類化合物是呈區域化分布的，因而不易發生酶促氧化。在鮮切加工過程中，植物細胞受損，原本區域化平衡被打破，酶與底物直接接觸，在有氧的條件下發生酶促褐變[30-32]。目前，許多研究已證明PPO是鮮切果蔬發生酶促褐變的最關鍵的酶。POD也可在活性氧的參與下氧化酚類化合物而產生褐變。PAL可以催化果蔬中的苯丙氨酸合成酚類化合物[33-34]。在本研究中，根據ΔE可以看出，3種護色處理方式中US-EA處理對鮮切蘋果的護色效果最好。在貯藏期內，根據BI值和表觀顏色變化可以看出，US-EA處理對鮮切蘋果的護色效果顯著優于對照組樣品。鮮切蘋果經過US-EA處理后，在96 h的貯藏期內其PPO和POD活性均有不同程度的上升，但始終低于對照組鮮切蘋果。這說明US-EA處理可能通過抑制氧化酶類活性而降低鮮切蘋果的酶促褐變程度。另外，一些研究表明，在不同的處理方式或條件下，貯藏期內鮮切果蔬的PAL活性呈上升趨勢[35-36]。在本研究中，經US-EA處理的鮮切蘋果PAL活性在96 h的貯藏期內并未出現明顯的升高，但始終低于對照組鮮切蘋果樣品。多酚是廣泛存在于蘋果中的次級代謝產物，并作為酶促褐變反應的重要底物，易發生氧化反應而生成醌類物質，進一步反應產生黃色、褐色至棕色的聚合物，引起蘋果及其制品表觀色澤的改變，它的積累和合成速率會影響鮮切果蔬的褐變程度[37]。在本研究中，鮮切蘋果經US-EA處理后，在貯藏期內其多酚含量減少，但始終高于對照組鮮切蘋果樣品。有研究表明，鮮切果蔬的酶促褐變程度與多酚含量呈負相關，而與POD活性呈正相關[38]。鮮切蘋果經US-EA處理后，可能通過EA的競爭性抑制作用和US對PPO或POD的空化作用，從而減少了酚類物質的進一步消耗。MDA是植物細胞膜脂過氧化產物，可作為由植物組織損傷引起膜脂過氧化程度的指標。MDA含量越低，表明植物細胞完整水平越好，即細胞壁或細胞膜的損傷越小[29]。在貯藏初期（24 h），US-EA處理顯著抑制了MDA的生成，減少了鮮切蘋果膜脂過氧化程度。綜上所述，US-EA處理能有效降低PPO和POD活性，減少酚類物質的損失，降低MDA的生成，從而延緩貯藏期鮮切蘋果的褐變。

近年，US在鮮切果蔬貯藏保鮮研究中得到了廣泛應用。研究表明，在適當的條件下US可以降低鮮切果蔬氧化酶類如PPO、POD等的活性，從而延緩酶促褐變的發生。另外，US作為一項非熱物理加工技術，與傳統的食品加工技術比較，具有高效、節能、環保等優點。同時，在較短的處理時間內，US不會對鮮切果蔬的感官品質和營養價值造成不利影響，能較好地保持鮮切產品的原有品質[39-41]。

化學方法是多年來用于鮮切果蔬貯藏保鮮中最常見的一種方法，特別是隨著食品添加劑行業的發展，各種化學合成的護色劑或保鮮劑相繼用于鮮切果蔬貯藏保鮮中。但由于一些化學保鮮劑或護色劑的殘留問題比較突出，鮮切果蔬的食用安全性一直飽受爭議。EA是一種新型的、被公認安全性較高的化學保鮮劑，是抗壞血酸的一種立體異構體，具有較強的抗氧化能力，在鮮切果蔬護色保鮮中有著廣泛的應用基礎[8-9]。

在本研究中，以US輔助EA處理鮮切蘋果，發揮了各自的優勢，并在US-EA的協同作用下抑制了PPO活性，從而延緩了貯藏期鮮切蘋果酶促褐變的發生。同時，US輔助EA的方法為鮮切果蔬貯藏保鮮研究提供了新的思路和參考數據。