南京兩醫院體檢人群尿液中有機磷酸酯代謝物與氧化應激水平的關聯

張紅丹，徐誠，王彤，張娟，宋寧慧

1.東南大學 a.公共衛生學院 b.環境醫學工程教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009

2.生態環境部南京環境科學研究所，江蘇 南京 210042

2009年，《斯德哥爾摩公約》將多溴二苯醚列為持久性有機污染物，有機磷酸酯（organophosphate esters，OPEs）替代多溴二苯醚，作為一類新興阻燃劑被廣泛應用［1］。OPEs 主要用作塑料、聚氨酯泡沫、紡織品、熱固性涂料和高分子混合物中的阻燃劑和添加劑［2］。OPEs 還應用于電子設備［3］、嬰兒產品［4］和食品包裝［5］。2004—2015年，全球OPEs 的總消費量由21 萬t 增長至68 萬t，并逐年增長［6-8］。OPEs 用作材料添加劑可能會因非化學鍵結合而輕易地通過揮發、產品磨損和泄漏釋放到環境中［2］。因此，大氣［9］、水［10］和土壤［11］中已經廣泛檢測到OPEs。目前，住宅［12］、辦公空間［13］和育兒場所［14］等許多人居環境中也檢測到OPEs。

OPEs是合成磷酸衍生物，其結構按照酯鍵的不同可大致分為三類：氯化OPEs、烷基OPEs和芳基OPEs。OPEs 可通過I 相和II 相生物轉化代謝為更親水且更易消除的代謝物［15］。

OPEs 經I 相代謝產生的主要代謝產物為磷酸二酯［16］：氯化OPEs磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP）、磷酸三（2-氯丙基）酯（TCPP）和磷酸三（1，3-二氯異丙基）酯（TDCPP）經I 相代謝產生雙（2-氯乙基）磷酸酯（BCEP）、雙（1-氯-2-丙基）磷酸酯（BCPP）和雙（1，3-二氯-2-丙基）磷酸酯（BDCPP）；烷基OPEs 磷酸三乙酯（TEP）、磷酸三正丁酯（TnBP）和磷酸三（2-丁氧基乙基）酯（TBEP）經I相代謝產生磷酸二乙酯（DEP）、磷酸二正丁酯（DnBP）和雙（丁氧乙基）磷酸酯（BBEP）；芳基OPEs 磷酸三苯酯（TPhP）經I 相代謝產生磷酸二苯酯（DPhP）。尿液中量化的磷酸二酯已被確定為評估人類OPEs 暴露的生物標志物［17-18］。

以往的研究發現，暴露于OPEs 可引起神經毒性［19］、生殖毒性［20］和內分泌紊亂［21］等。動物和細胞實驗表明，暴露于OPEs 能夠引起氧化應激［22-23］。氧化應激導致線粒體和核DNA 的損傷，產生脂質過氧化作用［24］。8-羥基-2’-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）是DNA 受損修復后釋放的核苷，被廣泛用作DNA 損傷和氧化應激的生物標志物［25-28］。流行病學研究表明，OPEs 暴露與氧化應激之間存在關聯［29-31］。

本研究通過檢測304 名體檢人群尿液中7 種OPEs代謝產物與8-OHdG 的水平，分析尿液OPEs 代謝產物與8-OHdG 之間的關聯，探討成年人暴露于OPEs 是否在代謝過程中引起氧化應激。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象為2017年于南京兩醫院參加健康體檢的普通成人304名，平均年齡為（35±10）歲（18～65歲），女性135 名和男性169 名。研究對象各體檢指標均在正常范圍內，無吸煙、飲酒史?；緜€人信息來自健康體檢問卷。按照健康體檢的要求，使用50 mL聚丙烯試管收集晨尿，標記后放置冰盒內運回實驗室，在-80℃保存待用。本研究倫理許可已由東南大學附屬中大醫院臨床研究倫理委員會批準（2015ZDKYSB038），研究對象均知情同意。

1.2 化學品和試劑

DEP（97.6%純度）、DnBP（99.9%純度）、DPhP（96%純度）、BCEP（95%純度）、BCPP（95%純度）、BBEP（96%純度）和BDCPP（95%純度）7 種OPEs 代謝產物和8-OHdG（97%純度）標準品均購于加拿大Toronto Research Chemicals。乙腈購于德國Merck（色譜純，＞99%純度）。

1.3 樣品制備和儀器分析

尿液的預處理程序如下：將10 mL 尿液樣品放入50 mL離心管中，然后加入鹽酸將尿液pH值酸化至5；尿液樣品在80℃的水浴中水解2 h，恢復到室溫后加入10 mL 乙腈溶液和3 g 氯化鈉，渦旋1 min；6 910×g離心5 min；取5 mL 上層溶液通過自制濾筒（該濾筒中裝有100 mg N-丙基乙二胺、20 mg 石墨化炭黑、4 g無水硫酸鈉），收集在容量試管中；上樣后，取5 mL上層溶液進行洗脫，收集的洗脫液在恒溫氮吹儀（中國天津奧特賽斯）旋轉蒸發至接近干燥；加入1 mL 乙腈使體積恒定，將溶液通過0.22 μm 濾膜過濾。將制備好的樣品儲存在-20℃等待儀器分析。

使用高效液相色譜-串聯四級桿離子阱質譜儀（LC-Agilent Technologies 1290 Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美國Agilent）測量尿液樣品中OPEs 代謝物和8-OHdG 的質量濃度（后稱濃度）。在ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm；美國Agilent）上分離所有分析物（目標物質總離子流見補充材料圖S1）。含有0.2%氨水溶液和乙腈用作流動相。梯度洗脫程序設置如下：0～2 min，1%乙腈；2～4 min，1%～20%乙腈；4～6 min，含20%～40%乙腈；6～8 min，40%～60%乙腈；8～9 min，60%～40%乙腈；9～9.1 min，40%～1%乙腈；9.1～10 min，1%乙腈。每個樣品注入5 μL 提取液，流速設置為0.3 mL·min-1，柱溫保持在30℃。電噴霧電離以負離子模式進行。電離電壓為-5 500 V，離子源溫度為500℃。補充材料表S1中列出其他的優化質譜參數，包括每種目標化合物的母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量、入口電壓和出口電壓。尿肌酐水平的測定按照肌酐測定試劑盒（L-Type Creatinine M，日本FUJIFILM）的說明書步驟進行。

1.4 質量控制

用于計算尿液樣品中目標化合物濃度的校準標準品的濃度范圍為0.01～200 μg·L-1，校準曲線的回歸系數＞0.997。檢測限（信噪比≥3）范圍為0.03～18.33 ng·L-1，定量限（信噪比≥10）為0.10～55.00 ng·L-1。本底值低于檢測限。方法回收率的測量是檢測3 種不同濃度（10、100、200 ng·L-1）的加標樣品（基質為人工尿），并為每種濃度設置5 個平行樣品，3 種濃度的加標樣品的回收率達到52.36%～114.56%，精密度低于10%。具體數據見補充材料表S2。

1.5 統計學分析

使用SPSS 20.0 進行統計分析。針對個體肌酐水平調整OPEs代謝產物和8-OHdG的尿液濃度，單位以μg·g-1表示。7種OPEs代謝物的總濃度表示為Σ7OPEMs。實驗數據采用幾何均數（geometric mean，GM）表示。采用Mann–WhitneyU檢驗研究兩組之間的差異。Pearson 相關性檢驗和多元線性回歸分析用于檢驗不同變量之間的相關性；在進行Pearson 相關性檢驗和多元線性回歸分析之前，將OPEs 代謝產物和8-OHdG的濃度進行常用對數轉換。使用GraphPad Prism 8.0制作圖形。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 尿液OPEs 代謝產物濃度

表1顯示體檢人群尿液樣本中OPEs 代謝產物的濃度。尿液中7 種OPEs 代謝產物檢出率范圍為53.6%～99.3%。尿液中Σ7OPEMs GM濃度為15.01 μg·g-1。BCPP（GM：4.88 μg·g-1）和DnBP（GM：4.61 μg·g-1）是成年人尿液最豐富的OPEs 代謝產物，其次是DPhP（GM：1.00 μg·g-1）、BCEP（GM：0.73 μg·g-1）、BDCPP（GM：0.72 μg·g-1）、DEP（GM：0.59 μg·g-1）和BBEP（GM：0.57 μg·g-1）。

表1 南京兩醫院體檢人群尿液中OPEs 代謝產物和8-OHdG的分布（n=304）Table 1 Distributions of urinary OPEs metabolites and 8-OHdG among selected physical examination population in two Nanjing hospitals (n=304)

2.2 性別相關的尿液OPEs 代謝物水平

表2顯示體檢人群尿液樣本中OPEs 代謝產物的性別差異。尿液DEP、DnBP、BCPP、BBEP 和BDCPP在男性和女性之間存在差異（P＜0.05）：對于尿液DnBP、BCPP和BDCPP，男性高于女性（GM：5.83、6.44、0.86μg·g-1vs 5.47、3.42、0.69μg·g-1）；但是，對于尿液DEP 和BBEP，女性遠高于男性（GM：7.44、5.25μg·g-1vs 0.67、0.80μg·g-1）。

表2 南京兩醫院體檢人群尿液中OPEs 代謝產物的性別差異Table 2 Gender differences in urinary OPEs metabolites among selected physical examination population in two Nanjing hospitals單位（Unit）：μg·g-1

2.3 OPEs暴露與氧化應激之間的關聯

經過肌酐調整后，通過Pearson相關性檢驗分析單個OPEs代謝產物與8-OHdG尿液濃度（常用對數轉換）之間的相關性（圖1）。結果表明：8-OHdG與DEP（r=0.219）、DnBP（r=0.417）、DPhP（r=0.308）、BCEP（r=0.420）、BDCPP（r=0.287）和Σ7OPEMs（r=0.276）均呈正相關（均P＜0.01）；但是，尿液中8-OHdG與BCPP、BBEP相關性無統計學意義（P＞0.05）（見補充材料圖S2）。

圖1 南京兩醫院體檢人群尿液中OPEs代謝產物與8-OHdG濃度的Pearson相關性Figure 1 Pearson correlations between urinary OPEs metabolites and 8-OHdG concentrations among selected physical examination population in two Nanjing hospitals

經過肌酐調整后，按照性別分層，通過Pearson相關性檢驗分析不同性別下單個OPEs 代謝產物與8-OHdG 尿液濃度（常用對數轉換）之間的相關性。結果表明：男性尿液8-OHdG 與DEP（r=0.240）、DnBP（r=0.436）、DPhP（r=0.367）、BCEP（r=0.448）、BDCPP（r=0.348）和Σ7OPEMs（r=0.327）均呈正相關（均P＜0.05，見補充材料圖S3）；女性尿液8-OHdG 與BBEP 呈正相關（r=0.233，P＜0.05，見補充材料圖S4）。

經過肌酐調整后，控制性別和年齡混雜因素，通過多元線性回歸分析來進一步探討單個OPEs代謝產物與8-OHdG 尿液濃度（常用對數轉換）之間的關聯（表3）。結果表明，8-OHdG 與DEP（b=0.182）、DnBP（b=0.418）、DPhP（b=0.303）、BCEP（b=0.418）、BDCPP（b=0.284）和Σ7OPEMs（b=0.281）存在正向關聯（均P＜0.05）。

表3 南京兩醫院體檢人群尿液中OPEs 代謝產物與8-OHdG 濃度的多元線性回歸分析Table 3 Multiple linear regression analysis on urinary OPEs metabolites and 8-OHdG concentrations among selected physical examination population in two Nanjing hospitals

3 討論

本研究調查于南京兩醫院參加健康體檢的普通成人尿液中OPEs 代謝產物與氧化應激生物標志物8-OHdG 之間的關聯。研究發現：DnBP 和BCPP 是普通成人尿液中最豐富的OPEs 代謝產物；DEP、DnBP 、BCPP、BBEP 和BDCPP 有性別差異，男性DnBP、BCPP和BDCPP 高于女性，女性DEP 和BBEP 高于男性；Pearson 相關性檢驗分析顯示8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP 和BDCPP 呈正相關；性別分層后，男性8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP 和BDCPP 呈正相關，女性8-OHdG 與BBEP 呈正相關；進一步校正性別和年齡后，多元線性回歸分析顯示8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP和BDCPP有正向關聯。

將本研究與不同研究報告的成年人（≥18 歲）尿液OPEs 代謝物濃度進行比較（見補充材料表S3），DPhP 和BDCPP 是先前研究分析的兩種最常見的OPEs代謝物，本研究的DPhP（GM：0.67 μg·L-1）尿液水平遠低于美國（0.71～1.137 μg·L-1）和加拿大（1.7 μg·L-1）；BDCPP（0.48 μg·L-1）尿液水平與加拿大（0.55 μg·L-1）相似，但遠低于美國（0.69～2.321 μg·L-1）。對于尿液DEP和BCEP，本研究數據（DEP：0.44 μg·L-1；BCEP：0.49 μg·L-1）與美國（DEP：0.348 μg·L-1；BCEP：0.354～0.38 μg·L-1）相當。本研究觀察到成年人尿液中DnBP（3.11 μg·L-1）、BCPP（3.36 μg·L-1）和BBEP（0.46 μg·L-1）水平遠高于美國（DnBP：0.0168～0.18 μg·L-1；BCPP：0.0838 、0.18 μg·L-1；BBEP：0.0326 μg·L-1）和加拿大（DnBP：0.08 μg·L-1）。

先前的研究表明，在OPEs 代謝產物中發現性別相關差異［32-35］。例如，成年男性血清中磷酸三異丁酯的濃度高于女性［34］，女孩TPhP 的暴露風險高于男孩［32］，女性頭發中TPhP 的濃度明顯高于男性［33］。本研究在課題組前期研究的基礎上［36］，經過肌酐校正，并增加了樣本量，結果顯示尿液DEP、DnBP 、BCPP、BBEP 和BDCPP 在男性和女性之間有差異（表2）。原因可能是男性和女性之間的OPEs 暴露來源和水平不同，這將影響尿液中OPEs 代謝產物的水平。例如，部分女性產品（例如指甲油）是OPEs 的重要來源，可增加女性暴露于OPEs的風險［37］。

本研究結果顯示，Pearson相關性檢驗分析后，尿液8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP 和BDCPP 呈正相關（圖1）。進一步校正性別和年齡后，多元線性回歸分析顯示尿液8-OHdG 與DEP、DnBP、DPhP、BCEP和BDCPP 有關聯（表3）。先前的研究也發現OPEs 代謝產物與氧化應激之間的關聯：波多黎各孕婦尿液中BCEP、BCPP 和DPhP 與8-OHdG 的增加有關［29］；日本7歲兒童尿液中BBEP、DPhP 和8-OHdG 之間存在正相關性［30］；生活在電子垃圾區域的人群尿液中BCPP、BCEP、DPhP和DnBP與8-OHdG水平呈正相關［31］。動物和細胞實驗表明，TCEP 和TPhP 會引起小鼠肝臟和睪丸TM3 Leydig 細胞的氧化應激［22］。TDCPP 誘導腎上腺PC12 細胞的氧化應激，盡管未觀察到細胞活力降低［23］。關于OPEs 誘導氧化應激的機制，以及OPEs 暴露對氧化應激生物標志物的影響仍需要進行更多的動物實驗和流行病學研究。

本研究有一定的局限性：第一，本研究屬于橫斷面研究設計，不能從本數據中建立因果關系；第二，8 種檢測物質中，DEP 的加標回收率低于70%；第三，機體可能受多種污染物（苯、重金屬和空氣污染物等）復合暴露的影響，但本研究只調查了OPEs 代謝產物與8-OHdG 的關聯；第四，研究中也未調查其他的氧化應激風險因素，如生活方式、經濟和教育狀況等，可能會使結論產生偏倚。因此進一步的研究需要控制更多的混雜因素。

綜 上，本研究發現DEP、DnBP、DPhP、BCEP 和BDCPP與氧化應激生物標志物8-OHdG 水平升高相關，表明成年人暴露于OPEs 可能會在代謝過程中引起氧化應激。本研究為進一步探索環境化學污染物暴露對機體氧化應激風險的影響提供了流行病學證據。未來應開展研究以查明OPEs 干擾氧化應激潛在的生物學機制和其介導的健康效應。