菲對融合菌株F14胞外聚合物特征的影響

劉怡暄，高 喬，王舒淇，呂岳駿，高于涵，汪 杰，侯 彬，盧 靜

（中北大學環境與安全工程學院，山西 太原 030051）

0 引言

多環芳烴 （Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）是指2 個以上苯環以稠環形式相連的有機化合物，它普遍存在于環境中，性質穩定，難于降解，且具有潛在的致畸性、致癌性和致突變性[1]。環境中PAHs 的主要來源于人類活動，如廢物、化石燃料和其他碳氫化合物的不完全燃燒、工業生產、食品加工過程以及原油的泄漏等[2]。菲作為PAHs 中的一種重要污染物，常被用于對PAHs 的實驗研究。微生物修復技術因其操作較為簡單，修復效果好，對環境影響微弱，幾乎無二次污染等優點，越來越受到專家學者的關注，成為去除PAHs 的主要途徑。

微生物在新陳代謝過程中，分泌出一種附著于微生物表面及周圍環境的高分子聚合物質，稱為胞外聚合物（Extracellular Polymertic Substances，EPS）。它主要由多糖和蛋白質構成（兩者在EPS 成分中占比為70% ～ 80%），除此之外還包含少量的核酸、腐殖酸等[3-4]。張穎等[5]在研究Arthrobacter sp.JQ-1 菌株胞外聚合物對不同濃度酞酸酯類化合物的吸附規律時，發現微生物的EPS 表面有非極性官能團，其中包括蛋白質中的脂肪族化合物、芳香族化合物及多糖中的疏水區域，這些組分參與了微生物對酞酸酯類化合物的降解過程。PAN Xiang-liang 等[6]研究表明，好氧活性污泥產生的EPS 和菲之間的作用是自發進行的，它們之間的結合主要依靠于疏水作用。LIU An-bo 等[7]研究表明，細菌產生的EPS 可促進土壤中菲進行解吸過程。甄凱等[8]研究表明，Seudomonas sp.DNBe-S1 產生的EPS 可促進土壤中苯并芘的降解。

融合菌株F14 是以菲降解菌Sphingomonas sp.GY2B 和芘降解菌Pseudomomas sp.GP3A 為親本，通過原生質體融合技術構建的一株高效降解多環芳烴的降解菌[9]。與親本相比，該菌株具有更廣的溫度（20 ～40 ℃）和pH 值適應范圍（6.5 ～9），對菲的降解效率更高，而且具有和親本GY2B 不同的菲降解途徑，融合菌株F14 具有2 條菲代謝途徑并且在降解過程中較少積累有毒中間代謝產物。

基于此，通過系統研究不同濃度菲誘導下對融合菌株F14 胞外聚合物 （Extracellular Polymertic Substances，EPS）的影響，包括EPS 中蛋白質和多糖含量的變化、對降解效率與熒光性能的影響，并通過FTIR 和SEM 進一步分析了EPS 表面官能團的變化和微觀形貌的變化，闡示融合菌株F14 降解菲的作用機理，為融合菌株F14 實地修復菲污染提供科學依據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及樣品

研究使用的菲（濃度為98%）、甲醇（色譜純）、正己烷（分析純）、二氯甲烷（色譜純）等試劑，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其余試劑無特殊說明均為分析純。

無機鹽基礎培養液（MSM）：分別取5 mL 磷酸鹽緩沖液 （KH2PO4，8.5 g/L；K2HPO4·H2O，21.75 g/L；Na2HPO4·12H2O，33.4 g/L；（NH4）Cl，5.0 g/L）、3 mL MgSO4溶液（22.5 g/L），1 mL CaCl2溶液（36.4 g/L），1 mL FeCl3溶液 （0.25 g/L），1 mL 微量元素（MnSO4·H2O，39.9 mg/L；ZnSO4·H2O，42.8 mg/L；（NH4）6Mo7O24·4H2O，34.7 mg/L），然后加入超純水定容至1 L，調節培養基pH 值為6.8，在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min 后備用。

含有菲的無機鹽培養液（質量濃度分別為0，60，100，230 mg/L）：在滅菌的三角瓶中加入不同量的菲標準儲備液（5 g/L，正己烷為溶劑配制），待正己烷揮發完畢，加入滅菌后的MSM。

實驗菌種：融合菌株F14 利用原生質體融合技術融合而成[9]。

1.2 菲對融合菌株F14 的馴化

按照10% 的接種量，將融合菌株F14 菌液接種到含有不同質量濃度（0，60，100，230 mg/L）菲的無機鹽培養液（總體積為30 mL）中，將其置于30 ℃、轉速為120 r/min 的搖床培養箱中，培養24 h 后，提取EPS。

1.3 融合菌株F14 的EPS 的提取

采用加熱法提取EPS。首先，取30 mL 融合菌株F14 菌液，于轉速為2 000 r/min 低溫冷凍離心機中離心10 min，丟棄上清液，補充無菌水至原體積，再于轉速為2 000 r/min 離心3 min，丟棄上清液，補充無菌水至原體積，將上述步驟重復2 次。然后，將獲得的溶液放入水浴鍋（60 ℃）加熱30 min，再次放入離心機中，于8 000 r/min 轉速下離心15 min，最后將收集的上清液經0.22 μm 濾膜過濾，即為EPS 溶液。同時將部分溶液在低溫冷凍干燥機中干燥24 h，所得粉末用于后續檢測[10]。

1.4 馴化后的EPS 降解菲

取0.2 mL 質量濃度為5 g/L 菲的儲備液于三角瓶中，待正己烷揮發后，分別加入10 mL 上述提取的EPS 溶液，對照組為10 mL 水，用保鮮膜密封，置于30 ℃、轉速為120 r/min 搖床中震蕩24 h 后取樣。每組試驗設3 組平行，并將其進行編號，菲質量濃度分別為0，60，100，230 mg/L，對應編號為a,b,c,d，對照組編號為0。

1.5 分析方法

1.5.1 EPS 主要成分分析

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質；采用蒽酮-硫酸分光光度計法測定多糖[11]。

1.5.2 菲的提取及含量測定

采用液相萃取法提取菲，首先向樣品中加入等體積的二氯甲烷，振蕩5 min（30 ℃，轉速為180 r/min），隨后全部轉移至分液漏斗，待靜置分層后，將下層有機相放入燒杯，上述步驟重復3 次。再使用氮氣吹脫儀將溶液吹至近干，最后過0.22 μm 有機濾膜后全部移入進樣瓶中，并用甲醇定容。

使用島津高效液相色譜（HPLC（20A））測定菲的剩余量，并計算菲的降解率。

1.5.3 EPS 三維熒光光譜分析

將提取出來的EPS 溶液進行三維熒光測定，分析不同濃度菲誘導后產生的EPS 蛋白峰的變化情況。

1.5.4 EPS 傅里葉紅外光譜分析

取凍干后的EPS 粉末，使用紅外光譜儀（Thermo Scientific Nicolet iS5）采用KBr 壓片法進行測試，分析不同濃度菲誘導后產生的EPS 主要成分及官能團變化。

1.5.5 EPS 形貌特征分析

利用掃描電鏡（ZEISS MERLIN Compact）觀察不同濃度菲誘導后產生的EPS 表面形貌變化。

2 結果與分析

2.1 不同濃度菲誘導EPS 成分的變化

不同濃度菲誘導產生EPS 成分的變化見圖1。菲對融合菌株F14 的EPS 的產生及成分變化有一定影響。當菲質量濃度由0 mg/L 增至230 mg/L 時，EPS 中的蛋白質和多糖呈先增后減的變化規律。當菲質量濃度為0 mg/L 時，EPS 中多糖含量大于蛋白質含量，當菲質量濃度由0 mg/L 增至100 mg/L 時，蛋白質和多糖均有不同程度的增加，推斷原因可能是融合菌株F14 為抵御外界不利因素的影響，提高其耐受性，分泌了大量的EPS。當菲質量濃度為100 mg/L 時，蛋白質和多糖的濃度分別達到最大值。而當菲質量濃度達到230 mg/L 時，蛋白質和多糖的含量均降低，這說明過高濃度的菲會對微生物產生毒性，從而抑制其生長，進而影響EPS 的分泌。簡靜儀等[12]研究發現，隨著加入Zn2+和Cu2+濃度的增加，死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）產生的EPS 呈增加趨勢，且不同種類的重金屬，脅迫后產生的EPS 成分變化也存在明顯差異。唐蕊等[13]也在不同濃度的苯并[a]芘馴化毛霉的實驗中，發現隨著污染物濃度的增加，EPS 中的多糖和蛋白質含量呈先增后減的趨勢。

2.2 不同濃度菲誘導對EPS 降解能力的影響

融合菌株F14 產生的EPS 對菲也有一定的降解作用，降解效果見圖2。由圖2 可以看出，隨著時間的變化，不同濃度菲誘導后EPS 對菲的降解率均呈先高后低的趨勢，12 h 時降解率達到最大值，且菲的誘導質量濃度為100 mg/L 時，EPS 的降解效果最好。林治岐等[14]提出EPS 對菲有吸附，主要是通過EPS 中的疏水區與菲發生疏水作用。JIA Chan-yan等[15]通過對Zoogloea sp.和Aspergillus niger 產生的EPS 對土壤中芘降解效果的研究發現，EPS 對芘的降解，前期是在EPS 與芘之間的相互疏水作用下，兩者結合在一起，隨后EPS 中的酶參與了芘的降解過程。在12 h 內，不同濃度菲誘導后的EPS 降解率均有升高，但是隨著時間的變化，降解率逐漸降低，推斷原因可能是EPS 降解菲的過程中，先將菲吸附在EPS 表面的吸附位點上，后再由EPS 中的酶進行降解，但是酶的產量不足以將吸附位點上的菲完全降解，隨著時間的變化，未降解的菲又逐漸回到溶液中，從而導致EPS 降解率降低。在24 h 時，質量濃度為0 mg/L 的菲誘導后的EPS 降解效率明顯高于菲的質量濃度分別為60 和230 mg/L 的菲，推斷原因可能是EPS 在前期誘導過程中已與菲結合，使得EPS 表面吸附位點減少，且消耗了部分蛋白酶，從而導致生物吸附能力降低。而當菲的誘導質量濃度為230 mg/L 時，降解效果減弱，推斷原因可能是過高濃度的菲會抑制微生物的生長，影響EPS 的產生。綜上所述，經過菲誘導后的EPS 降解效果會提高，且菲的質量濃度為100 mg/L 時降解效果最佳。

2.3 不同濃度菲誘導下對EPS 三維熒光光譜的影響

不同濃度菲誘導產生的EPS 三維熒光的圖像見圖1。

不同濃度菲誘導產生的EPS 三維熒光的分析結果見表1。

表1 不同濃度菲誘導下EPS 三維熒光光譜分析結果

由表1 可以看出，峰A 為酪氨酸蛋白峰：Ex，Em=280，335 nm；峰B 為色氨酸蛋白峰：Ex，Em=230，（330～335）nm。這2 個峰在菌體形成聚集體和穩定結構的過程中發揮了重要作用[16]，且與EPS 中的芳香環氨基酸結構有關[17]。

由圖3 和表1 可以看出，當菲質量濃度由0 mg/L增至100 mg/L，蛋白峰強度逐漸增強，色氨酸和酪氨酸的含量也逐漸增加，這說明菲對融合菌株F14 產生胞外蛋白起到了顯著的促進作用。當菲質量濃度為100 mg/L 時，峰A 和峰B 強度達到最大，分別為446.0 和573.9；當菲質量濃度由100 mg/L 增至230 mg/L 時，蛋白峰強度明顯減弱。分析原因可能是菲處于低濃度時，不易與菌體充分接觸，菌體可利用的能源物質較少，影響菌體的生長代謝。隨著菲濃度的增加，菌體的代謝增強，分泌出胞外蛋白增多，所以蛋白峰明顯增強，但是菲濃度過高則會影響菌體正常分泌胞外蛋白，從而導致蛋白峰減弱。隨著菲的加入，EPS 的蛋白峰強度發生了變化，直接影響了EPS對菲的降解作用。ZHU Liang 等[18]在對不同種類污泥的EPS 提取過程中發現，酪氨酸和色氨酸蛋白峰強度發生了改變，這表明蛋白質在生物代謝降解過程中起到了主要作用。ZHANG Jing 等[19]得出結論，1-羥基芘能與牛血清蛋白中的色氨酸殘基發生鍵合作用。

2.4 不同濃度菲誘導下對EPS 紅外光譜的影響

為確定不同濃度菲誘導產生EPS 官能團的差異，對EPS 進行了FTIR 光譜分析，結果見表2 和圖4。由表2 和圖4 可以看出，4 000 到1 000 cm-1之間的吸收峰能夠反映出EPS 的基本組成部分，主要是蛋白質和多糖[20]。3 400 ～ 3 200 cm-1區間的吸收峰強而寬，可歸屬為O-H 拉伸振動和蛋白質的N-H鍵伸縮振動吸收峰；位于1656.51 cm-1處的酰胺（O=CN-H）Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1），是蛋白質功能組中具有代表性的重要部分，屬于C=O 伸縮振動；位于1 550.97 cm-1處的酰胺Ⅱ帶（1 600～1 500 cm-1），是N-H 彎曲振動和C-N 拉伸振動的耦合產生；羧基的C=O 和C-O 伸縮振動峰分別出現在1 403.28 和1 243.65 cm-1；位于1 104.53 cm-1處的是多糖（1 200～1 000 cm-1）的O-H 和C-O-C 的伸縮振動。

表2 FTIR 觀察到的不同濃度菲誘導下EPS 主要基團

圖4 不同濃度菲誘導下EPS 紅外光譜

對比可知，3 378.33 cm-1處的吸收峰發生了輕微移動且峰強度明顯減弱，推斷原因可能是N-H 鍵和O-H 鍵參與了對菲的降解過程。1 656.51 cm-1處的酰胺Ⅰ帶誘導前是較為尖銳的吸收峰，誘導后，峰的強度先增強后減弱，推斷原因可能是低濃度的菲刺激生成了蛋白質，而后隨著菲濃度的增加，菲與EPS的接觸更加緊密，蛋白質中的C=O 參與了降解過程。多糖區的吸收峰誘導后發生輕微移動，峰的強度也有所變化，說明在融合菌株F14 降解菲時，EPS 中多糖上的O-H 和C-O-C 鍵參與了反應。

很多資料表明，由于EPS 含有大量的負電荷官能團如羧基、羥基等，對有機污染物有很強的吸附能力[21]。通過對紅外光譜圖的分析可知：在融合菌株F14 降解菲的過程中，主要起作用的基團是羥基、氨基、酰胺基團和C-O-C 基團。

2.5 不同濃度菲誘導對EPS 形貌特征的影響

不同濃度菲誘導后EPS 的形貌變化情況見圖5。由圖5（a）可以看出，EPS 呈薄片狀，且有明顯的孔隙結構，隨著菲濃度的增加，孔隙在逐漸變小，表面厚度增大，變得光滑圓潤，結構密實，這說明為更好的保護菌體，避免菲的不利影響，促進了EPS 的大量產生。WIENS J R 等[22]研究表明：部分金屬離子可以促進大腸桿菌、綠胳桿菌等微生物分泌大量的蛋白質與多糖。NIELSEN 等[23]認為微生物主要是利用松散結合型胞外聚合物（LB-EPS）和緊密結合型胞外聚合物（TB-EPS）來吸附有機物，與有機物結合后，EPS 會打破原有結構。由圖5（d）可以看出,EPS表面的孔隙數明顯減少，這不利于與菲的結合，降解效果會減弱。

圖5 不同濃度菲誘導后EPS 掃描電鏡

3 結論

（1）隨著菲誘導濃度的增加，融合菌株F14 產生的EPS 中蛋白質和多糖均呈先大后減的變化趨勢，且當菲誘導質量濃度為100 mg/L 時達到最大，推斷原因可能是融合菌株F14 為抵御外界不利因素的影響，提高其耐受性，分泌了大量的EPS，但隨著濃度的不斷增加，毒性加大，抑制其生長。

（2）隨著時間的變化，經不同濃度菲誘導的EPS降解率均呈先高后低的趨勢，這說明在融合菌株F14 降解菲的過程中，EPS 先是通過疏水作用與菲結合，隨后再利用產生的酶參與降解過程。菲的誘導有利于提高EPS 的降解效果，且質量濃度為100 mg/L 時降解效果最佳，在12 h 時，降解率達到最大值。

（3）在融合菌株F14 降解菲的過程中，EPS 中的蛋白質和多糖參與了反應，羥基、氨基、酰胺基團和C-O-C 基團也發揮了重要作用。

（4）隨著菲誘導濃度的增加，EPS 的孔隙逐漸變小，表面也變得光滑密實，EPS 原有結構也發生變化，推斷原因可能是為有效阻止菲的污染，分泌了大量物質，但濃度過高，孔隙會明顯減少，不利于吸附降解，從而降解效果減弱。