E1A激活基因阻遏子基因對血管緊張素Ⅱ刺激后小鼠原代心肌細胞凋亡影響

劉 丹， 宋海旭， 閆承慧， 劉艷霞

北部戰區總醫院 心血管內科，遼寧 沈陽 110016

心血管疾病嚴重威脅著人類健康，心力衰竭是多種心血管疾病的終末階段[1-5]，心肌細胞凋亡、氧化應激障礙、免疫炎癥反應和線粒體損傷等多種因素共同參與心力衰竭的發生發展[6-9]，但其關鍵發病機制尚不十分清楚。因此，闡明心力衰竭的發生機制、尋找到新的干預靶點，將成為心血管領域亟需解決的問題。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG)是一種重要的心肌保護因子[10-15]。在小鼠心肌缺血再灌注損傷后，心肌組織中CREG蛋白表達明顯下降，外源性給予CREG重組蛋白后可通過影響心肌細胞自噬和凋亡顯著改善小鼠心肌缺血再灌注損傷[10]。在CREG表達缺失的雜合子小鼠中，給予血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)刺激后，心肌纖維化明顯加重，心肌細胞自噬功能障礙[15]。然而，CREG對AngⅡ刺激后心肌細胞凋亡的影響目前尚不清楚。本研究旨在探討CREG對AngⅡ刺激后心肌細胞凋亡的影響?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CREG抗體(Abcam公司，英國)，Cleaved-caspase3抗體(剪切型的半胱天冬酶，Cell signaling technology公司，美國)，Bax抗體(Cell signaling technology公司，美國)，Bcl-2抗體(Cell signaling technology公司，美國)，β-actin抗體(北京博奧森生物技術有限公司，中國)，HRP標記的二抗(Jackson ImmunoResearch，美國)，AngⅡ(大連美侖生物技術有限公司，中國)，逆轉錄試劑盒(TAKARA公司，日本)。

1.2 小鼠原代心肌細胞提取及培養 使用膠原酶和胰酶提取出生1～3 d的小鼠乳鼠原代心肌細胞，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養。待細胞密度達70%左右時，將細胞分為對照組與AngⅡ組(1μM，刺激24 h)。此外，將CREG過表達的腺病毒(adCREG)及其對照病毒(adcon)加入到細胞上清后再給予AngⅡ刺激，24 h后收集細胞提取蛋白。

1.3 熒光定量PCR檢測CREG基因表達 采用Trizol方法提取細胞總RNA后進行逆轉錄反應。采用下列引物定量PCR反應，CREG正向引物：CTTCGCGGACATCATCTCAAT,CREG反向引物：GTCAGCGTAGCCTCTGGATTT；GAPDH正向引物：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG，GAPDH反向引物：GGGGTCGTTGATGGCAACA。

1.4 Western blot檢測細胞凋亡 采用蛋白裂解RIPA裂解液進行細胞總蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE膠對細胞總蛋白進行電泳。一抗采用抗CREG、Cleaved-caspase3抗體、Bax抗體和Bcl-2抗體；二抗使用HRP標記的抗體，內參基因為β-actin。使用Image-Pro Plus 6.0軟件對條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1 AngⅡ刺激后心肌細胞中CREG蛋白表達情況 對照組與AngⅡ組的CREG基因mRNA表達情況比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖1a)；但AngⅡ組CREG蛋白水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01，圖1b、c)；提示CREG表達下降可能與AngⅡ引起的心肌細胞損傷存在相關性。

圖1 AngⅡ刺激小鼠原代心肌細胞后CREG基因mRNA和蛋白表達檢測(a.定量PCR檢測對照組和AngⅡ組小鼠原代心肌細胞CREG基因mRNA表達；b、c.Western blot檢測對照組和AngⅡ組小鼠原代心肌細胞CREG蛋白表達)

2.2 構建CREG過表達的小鼠原代心肌細胞 adCREG組CREG基因mRNA和蛋白表達水平均明顯高于adcon組，差異有統計學意義(P<0.01，圖2)，提示CREG過表達的心肌細胞建立成功。

圖2 構建CREG過表達的小鼠原代心肌細胞(a.定量PCR檢測adcon組和adCREG組CREG基因mRNA表達；b、c.Western blot檢測adcon組和adCREG組CREG蛋白表達)

2.3 CREG過表達對AngⅡ刺激后小鼠原代心肌細胞凋亡的影響 adCREG組CREG蛋白表達明顯高于adcon組，差異有統計學意義(P<0.01)；但兩組Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。adcon+AngⅡ組CREG和Bcl-2蛋白表達明顯低于adcon組，而Cleaved-caspase3和Bax蛋白表達明顯高于adcon組，差異均有統計學意義(P<0.01)，提示AngⅡ刺激后心肌細胞凋亡。adCREG+AngⅡ組Cleaved-caspase3和Bax蛋白表達明顯低于adcon+AngⅡ組，而Bcl-2蛋白表達明顯高于adcon+AngⅡ組，差異有統計學意義(P<0.01)，提示CREG過表達可抑制AngⅡ引起的心肌細胞凋亡。見圖3。

圖3 CREG過表達對AngⅡ刺激后小鼠原代心肌細胞凋亡的影響

3 討論

心力衰竭是嚴重威脅人類健康的疾病之一，是許多心血管疾病的終末階段。雖然，科研工作者對心力衰竭的發病機制進行了大量的深入研究，但心力衰竭的發病率仍然很高。心肌細胞凋亡是心力衰竭的主要病理機制[16-18]。因此，明確心肌細胞凋亡的關鍵調控分子，對于深入闡明心力衰竭的發病機制，以及尋找新的干預和治療靶點，將具有非常重要的意義。

CREG是一個在組織和細胞中廣泛表達的小分子糖蛋白，具有維持組織細胞分化穩態調控的作用。本實驗室長期致力于CREG在心血管疾病中的研究。既往研究證實，CREG具有重要的心血管保護作用：(1)CREG在心臟組織中高表達；(2)CREG在小鼠心肌缺血再灌注的心肌組織中表達下降，并且外源性給予CREG重組蛋白可通過調控心肌細胞自噬功能來改善小鼠心肌缺血再灌注損傷[10]；(3)CREG表達降低可加重心肌梗死后心功能損傷，增加梗死后心肌纖維化，而外源性給予CREG重組蛋白后可改善心肌梗死后心功能，并顯著減輕梗死后心肌纖維化[13]；(4)CREG過表達可改善AngⅡ誘導后心肌細胞的自噬功能[15]。

本研究采用AngⅡ刺激小鼠心肌細胞來建立心力衰竭的細胞學模型[19-20]。本研究結果發現，AngⅡ刺激后，CREG蛋白表達明顯下降，凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3和Bax蛋白表達升高，提示CREG表達可能與AngⅡ引起的心肌細胞凋亡存在一定的相關性。為進一步明確CREG在AngⅡ誘導心肌細胞凋亡中的作用，首先使用CREG過表達腺病毒感染細胞建立CREG過表達的心肌細胞，在后續的研究中發現，CREG過表達可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡。本研究的結果與以往研究結果[11-15]一致，提示CREG是一個重要的心肌保護因子。

本研究存在一定的局限性。在本研究中，AngⅡ刺激后CREG基因mRNA表達無變化，而蛋白表達水平卻顯著下降，提示AngⅡ刺激后，CREG表達水平變化是發生在轉錄后，在蛋白降解層面出現異常，后續工作中可深入研究AngⅡ刺激后CREG蛋白降解的相關途徑，如蛋白酶體途徑或溶酶體途徑。此外，本研究結果表明CREG過表達可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡，但具體機制仍不清楚，CREG是否通過影響某些凋亡相關的信號通路發揮作用有待進一步深入研究。

綜上所述，AngⅡ刺激后降低心肌細胞中CREG蛋白表達，CREG過表達后可顯著抑制AngⅡ引起的心肌細胞凋亡。本研究將為深入明確心力衰竭的發病機制、尋找新的防治靶點提供理論支撐。