白細胞介素-10基因的3個單核苷酸多態性位點與慢性乙型肝炎病毒感染后炎癥程度的相關性分析

張 璋，林 勇，蘇成豪*

(1.廈門大學公共衛生學院，福建 廈門 361102；2.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院，福建 廈門 361015；3.廈門大學附屬中山醫院，福建 廈門 361004)

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝硬化和肝癌的主要危險因素.有研究表明乙肝表面抗原(HBsAg)陽性者的肝癌發生風險顯著高于陰性者[1].據估計全球約有2.4億慢性HBV感染患者，死亡人數每年超過68.6萬[2].據2019年的報道，我國HBsAg攜帶者約占總人口的10%，以此計算約有1.39億HBV攜帶者[3].目前沒有根除已感染患者體內HBV的治療方法，因此仍有大量慢性HBV感染人群，并且有可能出現肝硬化和肝癌等嚴重并發癥，迫切需要調查影響慢性HBV感染患者疾病進程的因素，并提供及時的干預措施以減少嚴重并發癥的發生.

以往研究表明，HBV和宿主免疫均與慢性HBV感染后的進程和結局有關[4-6].一項在中國漢族人群中進行的病例對照研究顯示，白細胞介素-10(IL-10)基因多態性對感染HBV的風險有顯著影響[7].IL-10可以通過抑制T淋巴細胞、自然殺傷(NK)細胞等介導的免疫應答，抑制促炎因子mRNA的表達，從而抑制促炎因子的合成和釋放，維持體內免疫反應與炎性反應平衡[8].IL-10基因啟動子區域存在單核苷酸多態性(SNP)位點，能改變IL-10基因的轉錄活性，進而影響IL-10的合成及分泌.大量研究表明IL-10基因多態性與多種肝臟疾病相關，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎等免疫性肝損傷及部分藥物性肝損傷[9-12]；但IL-10基因多態性是否與慢性HBV感染后的疾病進程相關有待進一步研究.

本研究基于212名劃分為輕度肝炎組(對照組，151例)和中、重度肝炎組(病例組，61例)的HBV感染者，選取IL-10基因中被研究最多的3個SNP位點rs1800871、rs1800872和rs1800896[13]進行基因分型，分析IL-10基因多態性與慢性HBV感染后炎癥程度的相關性，以期從基因層面探索HBV感染者疾病的進程，為開展HBV高危人群的預防和健康促進工作提供科學理論依據.

1 資料與方法

1.1 資料與數據收集

本研究在廈門大學附屬中山醫院選取212名慢性HBV感染患者.為排除以往抗病毒治療等因素引起的混雜效應，研究對象的納入標準為患者年齡20～79歲，HBV DNA含量≥107拷貝/mL，既往沒有抗病毒治療史；排除標準為患者拒絕參與或接受過抗病毒治療，合并感染丙型肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒[14].通過對患者肝穿刺活檢，結合國際常用的Metavir系統[15]進行肝組織纖維化分期和炎癥分級：將肝組織炎癥活動度評分為A0～A1的患者定義為輕度慢性肝炎患者，作為對照組；將評分為A2～A3的患者定義為中度至重度慢性肝炎患者，由于病例數較少，合并作為病例組.本研究的所有程序均符合《赫爾辛基宣言》要求且患者均已簽署知情同意書.通過面對面采訪的方式收集患者的性別、年齡和肝炎家族史等信息，通過醫院信息系統查閱電子病例，收集有關HBV感染的信息.倫理審批號：xmzsyyky倫審第(2018009)號.

1.2 基因型檢測

在入選患者進入研究當日收集其靜脈血樣，并將血液樣品以4 000 r/min離心10 min，分離血清和血細胞，-78 ℃下儲存.采用Magna Pure LC 2.0試劑盒(德國Roche Applied Science公司)從血細胞樣品中提取基因組DNA.利用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜對IL-10基因的3個SNP位點rs1800871、rs1800872和rs1800896進行基因分型，正/反向(F/R)引物設計見表1.所有程序嚴格按照用戶手冊(Sequenom，美國)進行.在基因分型測定過程中，采用陰性對照和參考DNA作為質量控制措施.此外，隨機選擇約5%的樣本重復進行基因分型，作為實驗重復對照.根據平臺的結果，基因分型率為100%.

表1 3個SNP位點的引物序列

1.3 統計方法

2 結果與分析

2.1 HBV相關的一般特征

運用Metavir系統對212名研究對象的肝組織炎癥活動度進行評分，并根據評分結果將研究對象分為對照組(n=151)和病例組(n=61).HBV相關的一般特征比較分析表明(表2)：對照組與病例組在性別分布和HBV家族史上差異顯著(p<0.05)；而年齡和HBV基因型分布在兩組間差異不顯著(p>0.05).

表2 212名慢性HBV感染者的人口學特征

2.2 IL-10基因各SNP位點的等位基因分布

利用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜對IL-10基因的3個SNP位點進行基因分型，各SNP位點的等位基因分布頻率見表3：其中，rs1800871和rs1800872位點的等位基因頻率分布在病例組和對照組間差異顯著(p<0.05)；而rs1800896位點的等位基因頻率分布在兩組間差異不顯著(p>0.05).這初步說明rs1800871和rs1800872位點與HBV感染后炎癥程度相關，而尚不能認為rs1800896位點與炎癥程度相關.

表3 IL-10基因SNP位點的等位基因分布

2.3 IL-10基因各SNP位點的基因型分布

經檢驗IL-10基因各SNP位點的基因型頻率在病例組和對照組中均符合Hardy-Weinberg平衡(p>0.05).如表4所示，rs1800871和rs1800872位點的各基因型在病例組和對照組間分布差異顯著(p<0.05)，rs1800896位點的各基因型在兩組間分布差異不顯著(p>0.05).rs1800871位點上，相較于基因型AA，基因型GG在HBV感染后炎癥重度化風險更高(OR為4.238，p<0.05)；基因型AG同樣提高了炎癥重度化的風險(OR為2.410，p<0.05).rs1800872位點上，與基因型TT相比，基因型GT和GG增加了HBV感染后炎癥重度化的風險，OR分別為2.270和3.202，差異顯著(p<0.05)；而rs1800896位點的各基因型分布差異不顯著(p>0.05).

表4 IL-10基因各SNP位點的基因型分布

2.4 IL-10基因各SNP位點的單倍型分析

運用SHEsis在線遺傳分析軟件對IL-10基因位點進行連鎖不平衡分析(頻率低于0.03的單倍型不分析其分布的差異)，結果顯示，rs1800871、rs1800872和rs1800896這3個SNP位點間存在連鎖不平衡(標準化后各單倍型分布頻率之間的差異D′>0.813，r>0.145).如表5所示，IL-10基因的4個單倍型A-G-T、A-T-T、G-G-T和G-T-T在病例組和對照組間的分布差異顯著(p<0.05).其中，單倍型A-G-T、G-G-T和G-T-T均可使HBV感染后炎癥重度化的風險顯著提高，OR分別為8.717，1.670和14.436(p<0.05)；而單倍型A-T-T則顯著降低了炎癥重度化的風險，OR為0.346(p<0.05).

表5 IL-10基因單倍型分布比較

2.5 3種遺傳模型下IL-10基因多態性與HBV感染發展的關聯

因本研究中3個SNP位點的純合子突變患者數量有限，故運用顯性模型將純合子突變和雜合子突變歸為一組.以rs1800871為例，基因型AA為對照組，基因型AG+GG為病例組.如表6所示，病例組和對照組相比，AG+GG型和AA型的差異顯著(p<0.05)，相較于基因型AA攜帶者，基因型AG+GG攜帶者在HBV感染后炎癥重度化的風險提高(OR為2.734).在顯性、隱性和相加3種遺傳模型下比較各SNP位點在病例組和對照組中的關聯性，結果顯示(表6)：除上述rs1800871顯性模型外，rs1800872顯性模型下，與基因型TT攜帶者相比，基因型GT+GG攜帶者在HBV感染后炎癥重度化的風險提高(OR為2.438，p<0.05)；而rs1800871隱性模型下，與基因型GG攜帶者相比，基因型AA+AG攜帶者在HBV感染后炎癥重度化的風險降低(OR為0.357，p<0.05)；其他模型在病例組和對照組間的差異均不顯著(p>0.05).

表6 顯性、隱性和相加模型下IL-10基因多態性與HBV感染的關聯

3 討論與結論

宿主免疫系統影響HBV感染后的轉歸，而細胞因子與機體免疫系統功能狀態密切相關.以往研究表明，細胞因子的多態性會影響其自身mRNA的表達水平，因此細胞因子基因的SNP與多種肝炎相關疾病的分子機制密切相關[13].IL-10被認為是一種重要的抗炎介質及免疫抑制因子，可抑制促炎介質的合成和活性，并與抗炎介質有協同作用[16].

有研究顯示IL-10基因位點的突變會對該位點所在區域與轉錄因子的結合造成影響, 從而影響mRNA的轉錄，使得IL-10基因在個體間的表達水平存在差異[17].而突變對IL-10基因表達水平產生的影響尚存在爭議：向瑜等[18]研究發現rs1800872位點上的突變基因型GG促進IL-10基因高表達，野生基因型TT則引起其低表達.王云英等[19]發現位點的基因突變會顯著降低IL-10基因的表達水平.王少揚等[20]研究發現，rs1800872位點上的野生型T等位基因與肝功能損害和激發免疫應答反應有一定相關性；而rs1800871位點上的突變型G等位基因則與免疫耐受相關，提示IL-10基因多態性可影響 HBV感染者病情發展.陳望等[21]在深圳地區進行的一項IL-10基因血清表達水平及其SNP與HBV感染的研究顯示：rs1800872位點上的突變基因型GG和G等位基因可能是該地區的HBV易感基因，且與IL-10基因表達水平有關；rs1800871位點上A被G替換和rs1800872位點上T被G替換，可使IL-10基因在不同個體間的表達水平出現差異；IL-10基因的低表達可能使機體在HBV感染后炎癥程度加重，而IL-10基因的高表達可能使HBV感染出現持續性和慢性化.上述研究結果間存在差異可能受到研究對象族群不同和樣本量大小等因素的影響.

本研究探討了IL-10基因SNP與慢性HBV感染后轉歸的相關性.研究結果顯示rs1800871和rs1800872位點上的等位基因和基因型在病例組和對照組間頻率分布差異顯著(p<0.05).在rs1800871位點上，與AA基因型攜帶者相比，AG和GG基因型攜帶者炎癥重度化的風險分別提高至2.410倍和4.238倍；在rs1800872位點上，與TT基因型攜帶者相比，GT和GG基因型攜帶者炎癥重度化的風險分別提高至2.270倍和3.202倍；而在rs1800896位點上，等位基因和基因型在兩組間頻率分布差異不顯著(p>0.05).rs1800871和rs1800872位點顯性模型及rs1800871位點隱形模型在病例組和對照組間差異均顯著(p<0.05)，AG+GG和GT+GG基因型攜帶者炎癥重度化的風險提高，而AA+AG基因型攜帶者炎癥重度化的風險則降低.A-G-T、G-G-T和G-T-T單倍型攜帶者炎癥重度化的風險分別提高至8.717倍、1.670倍和14.436倍，而A-T-T單倍型攜帶者則降低了炎癥重度化的風險(OR為0.346).

綜上所述，IL-10基因rs1800871和rs1800872位點的SNP與HBV感染后炎癥重度化相關，而rs1800896位點與炎癥轉歸尚不能證明有顯著相關性，提示IL-10基因多態性與HBV感染后臨床發展過程的相關性可作為病毒感染后臨床發展的一個預測因素.本研究樣本量有限，還需要增大樣本量進一步深入研究；同時，將重點關注IL-10基因SNP對IL-10基因轉錄活性及血清表達水平的調控對乙型肝炎轉歸產生影響的機制.