高甲基化CD36基因對老年中晚期肺癌患者病情進展的影響

江山 李輝 鄧智霞 謝寒丹 藍楠

肺癌是死亡率較高的惡性腫瘤之一，其發病的原因有多種，其中最危險的因素是吸煙，吸煙量與肺癌之間存在著明顯的量-效關系，被動吸煙或環境吸煙也是肺癌的病因之一；工業生產中接觸與肺癌發病有關的特殊物質，如石棉、煤焦油、煙草的加熱產物及鈾、鐳等放射性物質衰變時產生的電離輻射和微波輻射等可使肺癌的發生風險增加[1]。與交通相關的石油、煤等燃燒后產生的致癌烴等有害物質污染大氣也會促使肺癌的發生[2]。在臨床治療中，由于肺癌的癥狀具有較強的隱匿性，通常在發現時患者已處于病情發展的中晚期，此時及時準確判斷病情十分重要。CD36是B類清道夫受體家族的成員之一，是跨膜糖蛋白的受體，在毛細血管內皮細胞、血小板和巨噬細胞表面都有表達，能夠與脂蛋白、絲氨酸磷脂和血小板反應蛋白-1等配體相結合從而發揮不同的功能[3]。CD36基因甲基化表達對肺癌患者的診斷及判斷分期和預后具有一定價值。本研究對比老年中晚期肺癌患者甲基化CD36基因表達情況，探討高甲基化CD36基因對老年中晚期肺癌患者病情進展的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選擇我院收治的62例老年中晚期肺癌患者，按病情進展情況將其分為A組（Ⅲ期患者）和B組（Ⅳ期患者），每組31例。其中A組男15例，女16例，年齡55～75歲，平均（61.02±6.32）歲，腺癌11例，鱗癌14例，小細胞癌6例；B組男17例，女14例，年齡52～82歲，平均（61.56±5.64）歲，腺癌10例，鱗癌16例，小細胞癌5例。

1.2 納入標準出現面部頸部水腫、聲音嘶啞、胸悶氣短等癥狀；經病理檢查確定腫瘤已處于中晚期；年齡大于50歲；臨床資料完整；同意接受本研究所涉及的相關檢查，配合研究；簽署知情同意書。

1.3 排除標準其他惡性腫瘤；自身免疫系統疾??；顱內轉移；有肝腎功能異常、凝血功能障礙。

1.4 方法CD36基因檢測：進行初次治療前，患者均在空腹狀態下進行凝血功能測定后，抽取5ml血液留用，以CD36FTTC/TSPPE對全血進行雙標記染色， 染色基質為2%PBS液，染色在暗環境下操作，染色結束后使用終濃度1%PFA固定待測。使用Attune NxT流式細胞儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產]進行測定，對儀器進行調試后，以前向角和側向角散射光形成的對數散點圖在血小板位置設定收集門，以固定條件收集樣本。每個樣品管收集104個血小板留待分析。使用Macintosh Quadra 650計算機和Cell Quest軟件對樣品數據進行收集處理。設置機器測試條件為FSC電壓E00，增益1.00，對數，SSC電壓347mV，對數；FL1電壓674mV，對數；FL2電壓517mV，對數；熒光補償FL1-0.8%FL2，FL2-24.6% FL1；激光功率15mW，激發光波長488nm。

腫瘤標志物檢測：兩組患者均接受常規抗腫瘤治療，于初次治療前及第1個治療周期結束后分別進行血清檢測。在患者空腹狀態下抽取5ml血液儲存于-80℃環境中保存待用，使用Avanti J-E多用途高效離心機（美國貝克曼庫爾特公司生產），以 1 500r/min的速度對血液離心15min，離心血液時間和采血時間間隔應不超過30min，離心結束后取上清液用全自動血液分析儀（美國貝克曼庫爾特公司生產）對CYFRA 21-1、NSE、CEA進行檢測。

1.5 統計學方法采用SPSS 21.0軟件分析數據，計量資料用±s表示，采用t檢驗，計數資料用%表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者血小板粘附蛋白情況比較A組患者血小板數量和CD36基因表達量明顯低于B組患者，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 兩組患者血小板粘附蛋白情況比較（±s）

表1 兩組患者血小板粘附蛋白情況比較（±s）

組別 n 血小板數 CD36表達平均熒光道數CD36-TSP+ CD36+TSP+ CD36+TSP- CD36-TSP+ CD36+TSP+ CD36+TSPA組 31 43.93±15.45 726.87±137.62 8762.13±534.45 35.13±15.22 197.30±95.15 201.94±51.41 B組 31 35.08±12.24 798.46±126.25 9439.73±514.96 27.80±10.06 242.15±58.88 232.90±53.34 t 2.500 2.134 5.083 2.237 2.232 2.327 P 0.015 0.037 0.000 0.029 0.029 0.023

2.2 兩組患者CD36基因甲基化情況比較A組患者CD36基因甲基化率明顯低于B組患者，差異有統計學意義（P<0.05），但兩組半甲基化和完全甲基化對比差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 兩組患者CD36基因甲基化情況比較[n（%）]

2.3 治療前后兩組患者血清腫瘤標志物水平及CD36基因甲基化率比較治療前及治療后兩組患者血清腫瘤標志物水平及CD36基因甲基化率差異均有統計學意義（P<0.05）；治療后兩組患者血清腫瘤標志物水平及CD36基因甲基化率均明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 治療前后兩組患者血清腫瘤標志物水平及CD36基因甲基化率比較

3 討論

肺癌是對人類生命造成嚴重威脅的疾病之一，具有較高的死亡率，引起肺癌的原因較多，預防難度較大，而且肺癌患者常伴有咳嗽、咯血、發熱、胸部疼痛、胸悶氣急、聲音嘶啞等癥狀，對患者的生活質量造成嚴重影響[4]。老年肺癌患者身體機能逐漸退化，面臨多重疾病困擾，因此身體出現異常狀況時難以引起重視，就診時病情往往已發展至中晚期，容易對治療失去信心[5，6]。及時準確判斷患者病情有利于制定針對性治療方案，樹立患者治療信心。近年來隨著環境及生活方式改變，肺癌的發病率呈較為明顯的上升趨勢，對肺癌患者的診斷主要有病理、影像學和免疫學等檢查方式，隨著醫療技術的不斷發展，檢測方法也逐漸豐富[7]。

隨著對癌癥發病機制研究的不斷深入，發現基因的表達對癌癥病情的預測和判斷具有重要作用。中晚期腫瘤患者通常會出現廣泛的血小板激活，激活的血小板會使粘附分子表達和釋放的產物隨之增加，進而引起血液出現高粘高凝狀態。血小板能夠通過癌細胞循環運輸、癌細胞隨血細胞栓子粘附在血管內皮表面、癌細胞移出血管壁浸潤及癌細胞增殖形成轉移灶等促進腫瘤細胞發生轉移，血小板的激活狀態與腫瘤患者病情發展存在明顯關系[8，9]。 CD36是一種存在于多種細胞表面且能夠與多種細胞因子結合從而產生不同生理功能的基因，其配體有膠原蛋白、長鏈脂肪酸（Long chain fatty acid，LCFA）、抗血管發生因子血小板反應蛋白（TSP-1）以及氧化修飾的低密度脂蛋白。粘附于血管內皮的CD36受體與TSP-1相結合會使血管內皮細胞發生凋亡從而起到抗血管發生的作用。其發生過程是CD36受體通過Type-1與TSP-1進行結合，將酪氨酸蛋白激酶、P59、細胞分裂活化蛋白激酶P38依次激活，進而促進凋亡蛋白酶3的表達，引起細胞凋亡[10，11]。此外，CD36在巨噬細胞上表達會受到包括巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）在內的細胞因子和過氧化物酶體增殖因子激活受體（PPAR）的調節。CD36在正常動脈壁巨噬細胞上的表達很低，當腫瘤細胞出現轉移時會呈現較高的表達。

基因甲基化是最早發現并進行深入研究的表觀遺傳調控機制之一，能夠在不改變基因序列的前提下使基因的遺傳表觀得以改變，在甲基酶的作用下使基因的染色體結構和作用方式發生改變，從而達到控制基因表達的目的。在癌癥患者中，抑癌基因的高甲基化已成為癌癥發展的重要判斷參數，在癌癥發展進程中，大量基因被沉默或激活使基因表達失常從而促進癌癥發生，所以基因甲基化檢測能夠對癌癥的發生進行預測以及對病情發展進行判斷[12]?；蚣谆癄顟B是腫瘤發生的一種敏感指標，當癌細胞產生時會釋放DNA到外周血中，在血清和血漿中表現尤為富集，此外在人體腫瘤細胞累及的相關體液中也能檢測出腫瘤相關基因的異常甲基化，如唾液和痰液等，這些生物樣品在收集過程中更加容易獲得，因此相較于其他腫瘤發生和發展標志物，基因甲基化的檢測更加容易被接受且能夠提供具有價值的信息[13，14]。此外，在不同腫瘤中某一基因的甲基化區域通常是一樣的，在檢測時也更加方便，容易與正常組織中的陰性背景進行 區分。

由于基因甲基化變化在癌癥病情發展中具有較為明顯的作用，因此對癌癥患者的治療措施也能夠以此為出發點進行選擇，基因去甲基化的機制包括主動去甲基化和特定位點的去甲基化，基于基因甲基化的可逆性可將高甲基化基因作為癌癥治療的重要靶點，使用藥物促使其恢復表達。腫瘤細胞轉移是導致患者病情惡化的重要原因之一，腫瘤細胞可通過侵犯臟層胸膜、癌細胞脫落進入胸膜腔，形成種植性轉移，癌細胞隨肺靜脈回流到左心后，可經過血行轉移轉移到體內任何部位，此外，淋巴道轉移是肺癌最常見的轉移途徑，腎臟、消化道、骨組織和中樞神經系統等也是肺癌細胞轉移的通道和途徑。因此對患者血清腫瘤標志物進行檢測能夠有效判斷患者發生轉移的風險，同時還能掌握患者病情發展狀況。目前臨床上還未發現對肺癌具有特異性的標志物，與之相關的研究較多。陳從華等[15]研究指出CYFRA 21-1、NSE、CEA與肺癌患者出現復發轉移及其預后狀況存在密切關系。本研究結果顯示，不同病程分期患者血清腫瘤標志物水平有明顯差異，且治療后血清腫瘤標志物水平下降。此外，治療前后兩組患者CD36基因甲基化率也存在明顯差異，且治療后兩組患者CD36基因甲基化率下降，說明治療對患者基因甲基化水平存在影響，提示對CD36基因甲基化表達進行調控有望實現腫瘤控制。去甲基化藥物在改變基因甲基化表達的同時還能夠抑制腫瘤細胞產生和轉移以達到緩解病情的目的。CD36基因的表達強度也可以進行控制，核激素受體超家族中的PPAR被認為是對CD36進行調節的關鍵性因子，在具有表達缺陷的巨噬細胞上原來對CD36進行上調的激動劑在PPAR的作用下已不能再誘導CD36產生，此外，PPAR能夠與黃醇類似物X受體（RXR）結合形成異源二聚體，對脂代謝和多種蛋白的形成起到轉錄調節作用[16]。當然，并不是所有細胞中的PPAR都對CD36具有主要調節作用，如在心肌細胞中CD36的表達就只對PPAR的激動劑產生反應，在骨骼肌和心肌細胞中CD36表達的改變也與LCFA的水平存在關系。由于CD36配基的多樣性，臨床中研究相關調節藥物時需要對其是否會引發副作用進行慎重考慮，噻唑阮二酮（TZD）類胰島素增敏藥物能夠對巨噬細胞上CD36的表達進行調節，但是也會引起肝X受體（LXR）激活并增加ATP結合盒轉運體AI（ABCAI）所調節的膽固醇流出，最終可以達到相對平衡的狀態[17，18]。而他汀類藥物能夠通過抑制巨噬細胞CD36的表達發揮作用[19，20]。這為中晚期肺癌患者的臨床治療提供了新的方向，但是其藥物應用的合理性和對人體的實用性還需要進行多次實驗確定。

本研究結果顯示，Ⅲ期老年中晚期肺癌患者血小板數以及CD36基因表達量均較Ⅳ期患者低，血小板活化時TSP的分泌能夠使其局部濃度得到顯著提高，對腫瘤轉移具有明顯的促進作用，老年中晚期肺癌患者的血小板呈現明顯的廣泛激活狀態，且隨著病情的發展具有明顯差異，因此CD36基因的表達對中晚期肺癌患者病情判斷具有重要作用。此外，CD36基因的高甲基化表達在老年中晚期肺癌患者的病情發展中具有明顯差異，CD36基因甲基化率較高，而Ⅳ期患者又明顯高于Ⅲ期患者。因此說明高甲基化CD36基因對老年中晚期肺癌患者病情的發展具有明顯作用，且可以將其作為治療的重點靶向。兩組半甲基化和完全甲基化對比差異無統計學意義（P>0.05），但數據存在差異，有待積累更多樣本進行驗證。

綜上所述，CD36基因高甲基化表達對老年中晚期肺癌患者的病情發展具有明顯影響，在臨床治療中可通過探究其生理機制進行針對性藥物研究，對CD36基因表達進行調控，從而抑制腫瘤產生和轉移，進而對病情起到控制作用。