貓細小病毒VP2 基因克隆與生物信息學分析

姜 偉，郭明佳，吳樹康

（龍口市動物疫病預防控制中心，山東省龍口市 265701）

貓細小病毒（feline parvovirus，FPV）又被稱為貓泛白細胞減少癥病毒（feline panleukopenia virus），是一種可以感染貓科、浣熊科及鼬科等多種動物的急性、致死性烈性傳染病病原[1]。該病原主要通過帶毒的糞便、尿液及口腔分泌物傳播，可以導致感染動物出現體溫升高、嘔吐、腹瀉及白細胞數量嚴重減少等多種臨床癥狀，且小型貓科動物對其易感性最高[2]。

FPV 屬于細小病毒科（Paroviridae）細小病毒屬（Parvovrius），是無囊膜的單股正鏈DNA 病毒，其基因組主要有兩個開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成，其中右側ORF 編碼重要的病毒結構蛋白——VP1 和VP2[3]。FPV 衣殼主要由VP2 結構蛋白組成，其含量可高達90%。同時，VP2 結構蛋白也是FPV 的主要抗原蛋白及受體結合蛋白，可以有效刺激機體產生針對FPV 的中和抗體并影響其致病性、宿主范圍及血凝活性等多種生物學特性[4-5]。

因此，本研究通過對龍口市動物疫病預防控制中心分離保存的FPV 毒株（SD-01）VP2基因進行克隆及生物信息學分析，了解VP2 蛋白的分子特點及變異規律，以期為后續疫苗及診斷試劑盒研發提供參考及理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

全基因組DNA 提取試劑盒（D1800）、質粒小量提取試劑盒（D1100），購自于北京索萊寶科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker（3427A）、DH5α 感受態細胞（9057）、pMD18-T（6011），購自于寶生物工程（大連）有限公司；EasyTaqDNA Polymerase（AP111）酶，購自于北京全式金生物技術有限公司。

1.2 毒株

FPV 毒株（SD-01）由龍口市動物疫病預防控制中心從2021 年5 月山東省龍口市采集病料中分離鑒定及保存。

1.3 主要方法

1.3.1 引物設計與合成 參照GeneBank 中公布的FPV 全基因組序列（登錄號MT614366），使用Primer 5.0 軟件設計1 對引物用于擴增SD-01 毒株的VP2基因及其兩端非編碼區（上游引物序列：5'-aagtaaaaagagacaatcttgcacca-3'；下游引物序列：5'-catacttactatgtttttatg-3'），預期擴增目的片段大小約為1 755 bp。引物序列送至上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2VP2基因克隆及序列分析 參考說明書使用全基因組DNA 提取試劑盒提取SD-01 毒株的全基因組DNA，然后以此為模板使用1.3.1 中設計的引物進行PCR 擴增。PCR 反應體系：EasyTaqDNA Polymerase 25.0 μL，上、下游引物各2.5 μL，DNA 模板2.0 μL，DEPC 水補足50.0 μL。PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。使用1.0%的瓊脂糖凝膠對PCR 產物進行電泳檢測，并使用膠回收試劑盒回收PCR 陽性產物，將回收產物于-20 ℃保存備用。將回收的擴增片段與pMD18-T 載體連接。連接體系：5.0 μL Solution、4.5 μL 膠回收產物、0.5 μL pMD18-T 載體，16 ℃連接30 min。將連接產物轉化至DH5α 感受態細胞后涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養基，37 ℃恒溫培養16 h，挑取單個菌落培養并進行菌液鑒定。將菌液鑒定陽性的樣品送至上海生工生物工程有限公司進行測序，并參考NCBI 上公布的FPVVP2基因序列，以犬細小病毒（CPV）毒株作為對照，使用DNAstar 及Mega 5.0[6]軟件進行同源性分析并構建發育進化樹。參考序列詳情見表1。

表1 NCBI 上公布的參考毒株VP2 基因序列信息

1.3.3VP2基因生物信息學分析 使用多種軟件對FPVVP2基因進行生物信息學分析，具體軟件見表2。

表2 本研究所使用的生物信息學工具

2 結果與分析

2.1 VP2 基因擴增與克隆

以1.3.2 中提取的SD-01 株DNA 為模板，1.3.1 中設計的序列為引物，成功擴增出片段大小為1 755 bp 的PCR 產物，與預期結果一致。將PCR 產物回收后連接至pMD18-T 載體上，進行菌液鑒定后送至生物公司進行測序，并將測序結果進行BLAST 比對。比對結果顯示，擴增出的PCR產物為FPVVP2基因，并成功構建了重組質粒，將其命名為pMD18-T-FPV SD-01-VP2。

2.2 VP2 蛋白氨基酸同源性比對及系統進化樹分析

從GeneBank 中下載已公布的國內FPV 毒株序列及部分國外代表株序列（表1），使用DNAstar 和Mega 5.0 軟件，對SD-01 株及其他FPV 毒株的VP2 蛋白進行氨基酸同源性分析并構建系統進化樹。氨基酸同源性比對結果顯示，SD-01 株VP2 蛋白與其他FPV 株VP2 蛋白相比，氨基酸同源性為99.0%～100%，與CPV 參考序列VP2 蛋白的氨基酸同源性為97.9%～98.1%（圖2）。氨基酸序列進化樹結果顯示，SD-01 株VP2基因與其他FPV 毒株的VP2基因處于同一個大分支，且與葡萄牙分離株PT09 的親緣關系最為相近（圖3）。

圖1 FPV SD-01 株VP2 基因PCR 擴增結果

圖2 SD-01 株VP2 基因氨基酸同源性分析結果

圖3 SD-01 株VP2 基因氨基酸序列系統進化樹

2.3 VP2 蛋白基本理化性質

使用在線軟件Prot-Param 對SD-01 株VP2蛋白的基本理化性質進行預測[5]。結果顯示：VP2 蛋白共由584 個氨基酸組成，其分子式為C2884H4357N785O882S17，共含有8 925 個原子，理論相對分子質量為64 683.07 u；含有56 個負電荷氨基酸殘基，44 個正電荷氨基酸殘基，理論等電點為5.44；理論的不穩定系數為27.80，屬于穩定蛋白。蛋白的親疏水性預測結果為-0.508，表明VP2 蛋白可能為親水性蛋白。

2.4 VP2 蛋白結構分析

使用在線軟件SignalP-5.0 和TMHMM Server v.2.0，預測SD-01 株VP2 蛋白信號肽和跨膜區域，發現信號肽預測值為0.002（圖4），表明VP2 蛋白無信號肽區域，推測其可能為非分泌型蛋白?？缒^預測結果（圖5）顯示，VP2 蛋白可能為非跨膜蛋白，且主要定位于膜外區域。

圖4 SD-01 株VP2 蛋白信號肽預測結果

圖5 SD-01 株VP2 蛋白跨膜區預測結果

應用SOPMA 軟件和SWISS-Model 數據庫，對SD-01 株VP2 蛋白的二級結構和三級結構進行預測。結果（圖6）顯示，VP2 蛋白二級結構中含有51 個α 螺旋（藍色）、143 個延伸鏈（紅色）、25 個β 轉角（綠色）和365 個無特定結構的卷曲（橘色），分別占二級結構的8.7%、24.5%、4.3%和62.5%。SWISS-Model 同源建模結果（圖7）顯示，VP2 蛋白三級結構中，以無規則卷曲為主，該結果與二級結構預測結果相一致。

圖6 SD-01 株VP2 蛋白二級結構預測結果

圖7 SD-01 株VP2 蛋白三級結構預測結果

2.5 VP2 蛋白亞細胞定位預測

使用在線軟件TargetP 1.1 和PSORT II Prediction，對FPV SD-01 株VP2 蛋白的亞細胞定位進行預測。結果顯示：VP2 蛋白不含有線粒體導肽（mTP）或分泌通道信號肽（SP）；VP2 蛋白定位在細胞質和細胞核中的概率較高，分別為47.8%和26.1%；定位在線粒體、細胞質膜和細胞骨架的可能較低，分別為17.4%、4.3%和4.3%。同時，VP2 蛋白的C 端含有一個過氧化物酶靶向信號，可能會被過氧化物酶識別從而發揮其生物學功能。

2.6 VP2 蛋白B 細胞抗原表位分析

采用在線軟件Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0，對VP2 蛋白的B 細胞抗原表位進行預測，并結合蛋白的二級結構、表面可及性及抗原指數性等因素，預測VP2 蛋白可能存11 個氨基酸數目大于7 的抗原表位，分別為4～56、86～99、156～167、213～239、270～279、294～315、322～328、337～445、507～520、551～562 和574～580，抗原趨勢最高值為0.681，是位于第18位氨基酸殘基精氨酸上（表3、圖8）。

表3 SD-01 株VP2 蛋白B 細胞抗原表位預測結果

圖8 SD-01 株VP2 蛋白的B 細胞抗原表位預測結果

2.7 VP2 蛋白翻譯后修飾位點預測

本研究采用多種蛋白翻譯后修飾預測軟件（NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0），對FPV VP2 蛋白進行修飾位點預測。結果顯示：VP2 蛋白可能存在49 個磷酸化修飾位點，其中絲氨酸（S）12個、酪氨酸（T）9個、蘇氨酸28個（圖9）；6 個N-糖基化修飾位點，分別為第25、47、64、180、443、505 位（圖10）；21 個O-糖基化修飾位點，分別為第2、21、23、27、41、221、223、225、226、228、230、348、349、355、388、389、390、391、394、399、433 位。這些修飾位點在FPV VP2 蛋白內高度保守，因此推測這些位點可能影響了VP2 蛋白的構象或生物學功能。

圖9 SD-01 株VP2 蛋白的磷酸化修飾位點預測結果

圖10 SD-01 株VP2 蛋白的N-糖基化修飾位點預測結果

3 討論

無囊膜病毒主要由衣殼蛋白及遺傳物質組成。其中衣殼蛋白在無囊膜病毒感染細胞及其復制過程中發揮著關鍵作用，影響著病毒的宿主嗜性、細胞敏感性、致病性以及對宿主天然免疫的拮抗能力。同時，衣殼蛋白也是無囊膜病毒的重要抗原蛋白，具有良好的免疫原性，可以誘導機體產生高水平的細胞免疫和體液免疫。FPV 衣殼蛋白主要由結構蛋白VP1 和VP2 組成。VP1 雖占衣殼蛋白的總量不高，不足15%，但其是產生具有感染性病毒粒子的必要組分[7]。VP2 蛋白是衣殼蛋白的主要成分，其含量占衣殼蛋白的80%以上，同時也是FPV 主要的抗原蛋白，可以誘導機體產生有效的中和抗體[8]。同時，VP2 蛋白也是面對宿主壓力重要的變異蛋白，因此對細小病毒的遺傳進化分析主要是針對VP2 蛋白。

本研究克隆了FPV SD-01 株的VP2基因，測序得知VP2基因全長為1755 bp，共編碼584 個氨基酸。根據VP2 蛋白氨基酸序列構建的系統進化樹可知，分離毒株SD-01 雖為國內分離株，但在親緣關系上與葡萄牙分離株PT09 更為接近，而PT09 株分離時間較早，因此推測SD-01 株可能是從國外傳播到國內的。目前CPV 雖有多種亞型的報道，且新亞型有取代傳統亞型成為主要流行毒株的趨勢，但是關于FPV 亞型的分類還未見到相關報道[9-11]。本研究構建的FPV VP2 蛋白氨基酸序列系統進化樹顯示，所有FPV 毒株位于一個大分支上，但除了少數毒株外，大部分FPV 毒株又可被分為3 個小分支。由此推測在宿主和免疫的雙重壓力下，FPV有進一步進化從而產生亞型分化的趨勢，所以臨床上要加強對FPV 的流行病學監測，以便在新變異亞型出現時可以快速應對。

通過對SD-01 株VP2 蛋白的理化性質及高級結構預測分析可知，VP2 蛋白為親水性非分泌性蛋白，沒有跨膜區，因此推測大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞-桿狀病毒、真核細胞等多種表達系統都可被用于高效表達VP2 蛋白。VP2 蛋白上有兩個主要的抗原決定簇A 和B，其中決定簇A 由第93、222、224、426 位氨基酸殘基組成，B 由第299、300、302 位氨基酸殘基組成[12]。通過對SD-01 株VP2 蛋白的B 細胞抗原表位進行預測可知，這兩個抗原決定簇都位于SD-01 株VP2 蛋白的B 細胞優勢表位內，且SD-01 株VP2 蛋白的兩個抗原決定簇與疫苗株一致，因此推測疫苗株可以給動物提供針對SD-01 株的有效保護。

FPV、CPV、豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）及小鼠細小病毒（mouse parvovirus，MPV）等均屬于細小病毒科、細小病毒屬。根據遺傳進化分析可知，FPV 與CPV 親緣關系最為接近，與PPV 親緣關系次之，而與其他細小病毒親緣關系較遠。通過比較FPV 及其他細小病毒VP2 的生物信息學差異發現，不同動物源細小病毒的VP2 蛋白氨基酸序列存在差異，但生理生化性質較為相似，均為親水性無跨膜區的穩定蛋白。蛋白質高級結構比較發現，不同種細小病毒VP2 蛋白均主要由無規則卷曲組成，α 螺旋及β 折疊所占比重較小，且三級結構高度一致。除氨基酸序列本身，蛋白翻譯后修飾同樣對抗原的免疫原性有著重要作用，通過比對不同細小病毒 VP2 蛋白的重要抗原表位及潛在翻譯后修飾位點，可見不同細小病毒的VP2 蛋白存在部分一致的蛋白翻譯后修飾位點，但抗原表位仍具有明顯差異。比較不同細小病毒VP2 蛋白的生物信息學差異，有利于更好地研究VP2 蛋白在不同細小病毒進化過程中所發揮的作用，為廣譜的抗細小病毒藥物及分子制劑篩選及研發奠定基礎。