鴨坦布蘇病毒熒光定量RT-PCR 方法的建立及應用

王巧萍，嚴紅亞，李 珂，朱鶴然，元正菊，常志順，張以芳，信愛國

（1.云南農業大學動物醫學院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫科學院養禽與禽病研究所，云南昆明 650224）

鴨坦布蘇病毒病是一種由鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus，DTMUV）引起的傳染病。它于1955 年被發現，2010 年傳入我國，且在我國東南部地區大范圍擴散，造成了至少數十億的經濟損失[1-2]。該病主要危害鴨和鵝，以產蛋量持續下降為主要特征[3]，降至低谷后由于機體康復而慢慢恢復，但種蛋的受精率和孵化率受到極大影響[4]。病鴨還表現為不愛下水、采食量下降，種鴨在恢復后期大多出現換羽現象[5]。感染鴨剖檢最明顯的病變主要見于卵巢，可見卵泡充血、出血、變性和萎縮，發生卵黃性腹膜炎[6]，輸卵管覆蓋黏液等，肺和脾臟腫大出血[7]；部分病例可見肝臟表面有針尖狀白色壞死點、出血、淋巴細胞滲出和增生[8]；腦組織水腫、出血、呈樹枝狀充血，偶見胰腺出血和壞死，心臟內膜出血；部分患病鴨盲腸內容物呈綠色或黑色，有的可見霉斑附著[9]。本病病程較長，嚴重者可出現死亡，但死亡率較低[10]。

該病在我國大多數養鴨地區均造成了一定經濟損失，因此建立一種快速而靈敏的檢測方法極為重要。其臨床診斷主要是觀察癥狀及制作病理切片，但是通過觀察很難與其他引起相似癥狀的疾病做區分，而制作病理切片耗時較長，因此需要將臨床診斷與實驗室診斷相結合。目前可用于DTMUV 的實驗室診斷方法有病原學診斷、血清學診斷、分子生物學診斷等。病原學診斷中的病毒分離鑒定耗時長，技術難度大[11]，對試驗人員安全有一定程度威脅；血清學檢測耗時費力，在臨床診斷方面局限性較大，病毒分離鑒定和血清學診斷的敏感性和特異性都較差；普通RT-PCR 檢測費時較多，過程中包含變性、退火、延伸等階段，較為復雜，且敏感性較低，而qRT-PCR 技術具有高通量、花費時間少等優點[12]，是一種成熟的核酸擴增技術，自問世以來在病毒檢測上發揮著極大作用[13-14]。

DTMUV 基因組包含一個開放閱讀框（ORF），編碼3 種結構蛋白（C、PrM/M、E）和7 種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。其中NS5 蛋白具有RNA 依賴的RNA 聚合酶活性，而且是黃病毒中最保守的非結構蛋白，因此試驗基于DTMUV 的保守基因NS5建立了MGB 探針qRT-PCR 檢測方法，可從病料中快速檢測出DTMUV，具有特異性強、靈敏性高、花費時間少等優點，為該病的防控和診斷提供了可靠方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 DTMUV YN2019 株BHK-21 細胞適應毒，由本研究所分離并保存；新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、Ⅰ型和Ⅲ型鴨肝炎病毒（duck hepatitis virus，DHV）、傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV），均由本研究所保存；H5、H7 和H9 亞型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）滅活抗原，購自華南農大生物藥品有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 病毒RNAiso Plus試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；pEASY?-T1 Cloning Kit、Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒，購自北京全式金公司生物技術有限公司；One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit（Perfect Real Time），購 自TaKaRa 公司；LightCycler 96 Real-time RT-PCR 擴增儀，購自Roche Diagnostics 公司。

1.2 引物、探針設計與合成

根據已發表的DMTUVNS5基因序列（登錄號：KJ958533），采用VectorNTI 8.0 序列分析軟件做對比分析，利用Primer 5.0 軟件自主設計了2對針對NS5基因的檢測引物和1 條MGB 探針。RT-PCR 檢測引物同時用于制備標準陽性質粒，在探針的5'和3'端分別標記FAM 熒光報告基團和MGB 非熒光淬滅基團。引物序列見表1，所有引物均由碩擎生物科技有限公司合成，并稀釋成工作濃度（10 pmol/L）置于-20 ℃保存備用。

表1 DTMUV 引物信息

1.3 陽性標準品制備

將保存的DTMUV 細胞毒、NDV、Ⅰ型和Ⅲ型DHV、AIV 滅活抗原（H5、H7、H9 亞型）分別取200 μL，用病毒RNAiso Plus 試劑提取核酸。然后用DTMUV-uF/uR 引物對DTMUV 核酸進行RT-PCR 擴增。擴增體系為50.0 μL：Prime Script 1step Enzyme Mix 2.0 μL，2×1 step Buffer（Dye plus）25.0 μL，DTMUV-uF/uR 各1.0 μL，total RNA 2.0 μL，RNase-free ddH2O 19.0 μL。反應程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進行35 個循環；72 ℃ 15 min，最后4 ℃冷卻。RT-PCR 結束后，取5.0 μL 產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，然后用凝膠成像系統進行初步鑒定。

對凝膠電泳產物按照DNA 凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收純化，然后按照pEASY?-T1 Cloning Kit 說明書將擴增片段連接至pEASY?-T1克隆載體；將連接產物轉化到Trans1-T1 感受態細胞中，挑選平板上的單個克隆菌落置于7 mL LB液體培養基（含氨芐青霉素）中進行過夜擴大培養。菌液經PCR 鑒定為陽性的克隆送擎科生物科技有限公司測序，挑選測序正確的質粒按照質粒小量提取試劑盒說明書提取質粒DNA，經PCR 鑒定為陽性的質粒DNA 用核酸定量儀測定其濃度。

1.4 qRT-PCR 方法及標準曲線建立

按照TaKaRa 公司One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit（Perfect Real Time）說明書，進行qRTPCR 體系配置及擴增。擴增體系為20.0 μL：2×One Step RT-PCR Buffer II 10.0 μL，TaKaRa ExTaqHS（5 U/μL）0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4 μL，DTMUV-qF/qR（10 pmol/L）各0.4 μL，DTMUV-qP 0.3 μL，RNA 2.0 μL，最后用RNase-Free ddH2O 補足到20.0 μL。擴增程序：42 ℃5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 個循環。

標準曲線建立：將1.3 中制作好的陽性標準品測定濃度后，通過10 倍連續梯度稀釋作為標準模板，共設置108～102copies/μL 7 個濃度梯度，同時設立空白對照，試驗進行3 次平行重復，建立DTMUV qRT-PCR 檢測方法的標準曲線。

1.5 MGB 探針法qRT-PCR 引物特異性驗證

為探明MGB 探針法qRT-PCR 的引物是否有非特異性擴增及產物是否單一，將DTMUV 核酸用剔除MGB 探針后的SYBR Green I 染料法進行擴增，并比較兩種情況下的熔解曲線。MGB 探針法qRT-PCR 按照1.4 中的步驟進行。

SYBR Green I 染料法qRT-PCR 具體如下：將DTMUV RNA 按照Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒說明書，進行以下20.0 μL 反轉錄體系配置：Random Primer（0.1 μg/μL）1.0 μL，2×TS Reaction Mix 10.0 μL，gDNA Remover 1.0 μL，RNase-Free ddH2O 4.0 μL，Trans Script RI/RT Enzyme Mix 1.0 μL，最后加入RNA 3.0 μL。反轉錄于普通PCR儀中進行，程序為25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，最后4 ℃冷卻。

用反轉錄好的cDNA 配置SYBR Green I 20.0 μL體 系：DTMUV-qF/qR（10 pmol/L）各0.4 μL，2×Perfect StartTMGreen qPCR Super Mix 10.0 μL，RNase-Free ddH2O 7.2 μL，最后加入cDNA 2.0 μL。qRT-PCR 程序：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s；54 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40 個循環。在LightCycler 96 qRT-PCR擴增儀中開展擴增。

1.6 qRT-PCR 和普通RT-PCR 敏感性試驗

對1.3 中制備的DTMUV 陽性質粒測定濃度后，用RNase-Free ddH2O 進行10 倍梯度倍比稀釋（100～10-7copies/μL），按1.4 中的步驟和體系進行qRT-PCR 反應，以確定其最低檢出量；普通RTPCR 用DTMUV YN2019 株提取的RNA 進行梯度稀釋，按1.3 中的程序進行，結束后進行核酸電泳查看結果。

1.7 qRT-PCR 特異性試驗

對DTMUV YN2019 株、I 型和III 型DHV、NDV、AIV 滅活抗原（H5、H7、H9 亞型）提取的核酸樣品，進行qRT-PCR 擴增，以驗證其特異性。

1.8 重復性試驗

將DTMUV 陽性標準品進行10 倍梯度稀釋為7 個濃度梯度（108～102copies/μL），用建立的qRT-PCR 方法檢測，每個濃度重復3 次。在試驗的第1、3 和5 天重復檢測3 次為批間重復試驗，在同一天的早、中、晚3 個時段重復檢測3 次為批內重復試驗。根據Cq 值計算批內和批間的平均值、標準差（standard deviation，SD）和變異系數（coefficient of variation，CV），以驗證其重復性和穩定性。

1.9 臨床樣品檢測

從云南不同地區的養鴨場收集20 份有產蛋下降臨床疑似癥狀的樣品，將每份樣品取約5.0 g 剪碎；加入與樣品體積比為1:4 的PBS（pH7.2），用研缽研磨，反復凍融3 次并低速離心；取上清提取總RNA 并按照1.4 中的qRT-PCR 方法進行檢測，以確定其臨床適用性。

2 結果

2.1 標準曲線建立

經核酸定量儀測定可知，DTMUV 陽性質粒濃度為355.85 ng/μL，根據公式計算得出拷貝數為3×109copies/μL。先 用RNase-Free ddH2O 將 其稀釋至1×109copies/μL，再進行連續10 倍倍比稀釋，使其濃度為108～102copies/μL。以質粒標準品濃度的對數為x軸，以Cq 值為y軸，繪制回歸方程，可得到DTMUV qRT-PCR 標準曲線（圖）1，其相關系數R2=0.999 3，擴增效率E=1.93，回歸方程為y=-3.513 3x+32.125，具有良好的線性關系。

圖1 qRT-PCR 標準曲線

2.2 MGB 探針法qRT-PCR 引物特異性驗證

將同一核酸樣品通過MGB 探針法與無MGB探針的SYBR Green I 染料法擴增，比較兩者的熔解曲線。結果顯示：SYBR Green I 染料法擴增的熔解曲線出現尖峰狀的單一曲線（圖2），說明產物單一，無非特異性反應；而MGB 探針法的熔解曲線則不出現單一峰值，總體呈現波浪狀（圖3）。

圖2 SYBR Green I 染料法熔解曲線的單一尖峰

圖3 MGB 探針法的波浪狀熔解曲線

2.3 qRT-PCR 和普通RT-PCR 敏感性試驗

對制備的DTMUV 陽性質粒（濃度為355.85 ng/μL）連續10 倍稀釋至100～10-78 個稀釋度，進行qRT-PCR 檢測。結果顯示，最低檢出量為10-7稀釋度，即3×102copies/μL（圖4）。經測定，DTMUV YN2019 株核酸濃度為32.4 ng/μL，普通RT-PCR 可檢出的最低稀釋度為10-3，因此普通RT-PCR 最低檢出量為32.4 pg/μL（圖5），即2.8×106copies/μL，說明qRT-PCR 的靈敏度比普通RT-PCR 高出約10 000 倍。

圖4 qRT-PCR 檢測DTMUV 不同稀釋度質粒的敏感性試驗結果

圖5 不同稀釋度DTMUV YN2019 株普通RT-PCR 檢測結果

2.4 特異性試驗

擴增曲線（圖6）顯示，使用建立的qRT-PCR方法僅對DTMUV 能擴增出特異性曲線，而對其他禽源病毒（DHV、AIV、NDV、IBDV）檢測結果均為陰性。

圖6 qRT-PCR 檢測DTMUV 特異性試驗結果

2.5 重復性試驗

表2 qRT-PCR 重復性試驗結果

2.6 臨床樣品檢測

對云南不同地區養鴨場收集的20 份臨床疑似樣品提取RNA，采用qRT-PCR 方法進行檢測，結果測定為陽性的有12 份，其陽性率為60%，而普通RT-PCR 的陽性率僅為50%，兩者符合率為90%（表3），說明qRT-PCR 檢出率更高，更適合于臨床樣品檢測。

表3 臨床樣品檢測結果

3 分析與討論

本試驗針對DTMUVNS5基因設計了特異性引物和MGB 探針，建立了DTMUV 的qRT-PCR檢測方法。用普通RT-PCR 擴增后進行T-A 克隆構建重組質粒，并用其制作了標準曲線；用SYBR Green I 染料法驗證了MGB 探針法引物是否會產生非特異性擴增，對qRT-PCR 檢測方法的特異性、敏感性、重復性進行了驗證，并將其應用于臨床樣品檢測。

SYBR Green I 是一種可與所有ds DNA 雙螺旋小溝區域非特異性結合、具有綠色激發波長的染料，其在游離狀態下僅發出微弱熒光，但是與雙鏈DNA 結合后熒光信號將會大大增強[15]。實際上其通過熒光信號直觀反映了模板數量：在反應最初雙鏈DNA 產生的量少，SYBR Green I 染料與之結合也較少，因此收集到的熒光信號較弱；由于積累效應，在某一時刻雙鏈DNA 量可達最高值，染料與之大量結合并發出熒光信號；雙鏈DNA 逐漸消耗染料，在兩者的量都減少的同時熒光信號也逐漸變弱，兩者的反應在整個核酸擴增過程中大體上呈現正態分布。由于SYBR Green I 染料法的非特異性，在臨床上產生假陽性的概率極大，所以通常需要繪制熔解曲線來確定反應產物。

MGB 探針診斷技術基本原理是堿基互補配對原則。通過在探針5'端標記FAM 熒光報告基團，在3'端標記MGB 非熒光淬滅基團，利用Taq酶的5'—3'聚合酶活性和3'—5'外切酶活性，根據能量共振轉移原理，當整個MGB 探針完整存在時，熒光信號被外切核酸酶3'端淬滅基團吸收，不能發出熒光，只有探針和目的基因特異性結合時，即探針被分解后，5'熒光物質便會游離出來發出熒光，熒光檢測系統接收到熒光信號，進而能夠實現熒光信號的累積，PCR 產物形成量與熒光信號的累積和收集處于完全同步狀態[16]，即探針法根據熒光信號值的變化可以實時檢測每一輪擴增過程中循環產物的變化量，所以探針法的熔解曲線并不是單一的尖峰狀，而是波浪形，其無法證明引物的特異性，所以結合SYBR Green I 染料法證明了試驗中的MGB 探針法的產物單一，熔解曲線單一，且無非特異性擴增。

用標準陽性質粒繪制的標準曲線線性關系顯著，其相關系數R2=0.999 3，擴增效率E=1.93，回歸方程為y=-3.513 3x+32.125；普通RT-PCR 重復性良好，qRT-PCR 批內重復性和批間重復性的變異系數為0.08%～0.49%，均小于0.5%，說明兩者的重復性和穩定性均良好。有國內學者[17-20]報道建立的TaqMan 探針法的批內變異系數和批間變異系數均大于0.5%，標準曲線的擴增效率E均小于1.93，這表明本試驗建立的標準曲線線性關系較前人的好，且該方法的重復性和穩定性也更好。

特異性檢測結果顯示該方法只能檢出DTMUV，對于NDV、I 型和III 型DHV、IBDV、H5/H7/H9 亞型AIV 滅活抗原則均不能檢出，表明其特異性良好；于春梅等[21]建立的SYBR Green I染料法需要設立內參基因β-actin，而且存在反轉錄過程，過程中增加了核酸和引物被污染的概率；且SYBR Green 染料既能與特異性產物結合，也能與非特異性產物結合[22]，其假陽性高于MGB 探針法，故MGB 探針法的特異性也更強。

本試驗建立的qRT-PCR 可檢測的最低限度為3×102copies/μL，普通RT-PCR 的敏感性為2.8×106copies/μL，說明qRT-PCR 的敏感性是普通RT-PCR 的約10 000 倍；應用該方法檢測20 份相同的臨床樣品，qRT-PCR 檢出12 份為陽性，其陽性率為60%，而普通RT-PCR 只檢出10 份為陽性，其陽性率為50%，說明qRT-PCR 的檢出率更高，更適合于臨床樣品檢測；在150 min 內qRTPCR 能夠完成所有檢測過程，而普通RT-PCR 則需要240 min 才能完成，萬春和等[23]建立的SYBR Green I 染料法整個過程也需花費240 min，以上數據說明本試驗建立的qRT-PCR 花費時間更短，檢出率更高，敏感性更強。

綜上所述，本試驗針對DTMUV 保守基因NS5建立的MGB探針qRT-PCR具有良好的敏感性、特異性和重復性，耗時少，適用于臨床樣品檢測，可為DTMUV 的臨床檢測和監控提供技術手段。