銀摻雜二氧化鈰的制備及其抗菌性能探究

● 姚叔辰 朱雪琦 韓汀蘭 丁葉彤 鄧婕 馬騰飛 翟欣昀/文

二氧化鈰具有改變細菌細胞表面形態、促進新陳代謝以及抗氧化的作用，在抑菌、免疫調節、燒傷診療、皮膚修復等各個方向具有巨大優勢。本項目用水熱法合成納米二氧化鈰，以其為載體用浸漬法負載納米銀得到新型復合粒子。通過對其進行SEM、XRD 表征，證明已成功合成了符合預期的復合粒子產品。為了更好的確定其性質，本項目進行了細胞相容性測試和抗菌測試，證明其在特定濃度下，對細菌有很好的殺滅效果，同時不影響正常細胞的生理活動。

1 引言

皮膚是人體免疫組織的一道重要防線，在抵抗外來病菌入侵方面發揮著巨大的作用。因此，增強皮膚的保護性能，在皮膚受損時使其盡快修復對于科研領域和日常生活都具有重大意義。皮膚傷口的愈合分為急性炎癥期、細胞增殖期和瘢痕形成期三個階段。目前醫學手段下，皮膚傷口愈合除大面積植皮外仍主要依靠人體自身免疫和再生功能。由于皮膚作為人體外表的特殊性，在傷口愈合過程中極易發生細菌感染，因此，如何利用合成藥物抵抗外來細菌感染、使皮膚快速再生至關重要。

二氧化鈰（CeO2）具有改變細菌細胞表面形態、促進新陳代謝以及抗氧化的作用，在抑菌、免疫調節、燒傷診療、皮膚修復等各個方向具有巨大優勢。CeO2是最具有代表性的鈰的氧化物，為立方螢石結構，其中每個Ce 原子周圍繞八個O 原子，而每個O原子周圍圍繞四個Ce 原子。因其特殊的4f 電子結構，在化學領域得到廣泛的研究以及應用。二氧化鈰中同時包含+3 價以及+4 價的Ce 原子，因此具有O空位，用于化學反應時能夠起到轉移氧離子的作用，從而加速反應的進行。而將CeO2的粒徑降低至納米尺寸有助于O 空位的形成，并且伴隨著CeO2納米粒子的尺寸降低，較大的比表面積會帶來特殊的性質。

納米銀（Ag）是目前技術較為成熟的抗菌材料之一，研究成果較多，且已應用于臨床。納米銀對致病菌具有廣譜、高效和不易使致病菌產生耐藥性等特點。因此，銀系抗菌劑在紡織、塑料、橡膠、陶瓷等多種現代工業中得到廣泛應用，在醫療、生物材料領域也是目前熱門的研究對象。Ag 的殺菌機理為：Ag+進入細胞與DNA 分子結合，置換出其雙螺旋結構中的氫鍵，最終導致細菌的DNA 分子結構變形損壞，從根源上抑制DNA 復制、RNA 形成和蛋白質合成等多個步驟，使病菌失活。

有鑒于此，在本研究中，先通過實驗合成粒徑均勻的CeO2并實現CeO2對納米Ag 顆粒的負載，從而制備出具有優良的殺菌性能和抗氧化性能的新型材料。之后再對新型材料進行分析和表征，并通過抗菌實驗和細胞實驗測試新型材料的抗菌和抗氧化性能，力求能夠找到該新型材料抗菌的最適合比例，在保證人體安全的情況下適用的濃度范圍，為日后該類新型材料的實際生產和大面積使用做出貢獻。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（天津大學化工學院提供）

試劑：乙酸鈉（南開大學精細化學實驗廠，分析純）、硝酸鈰六水合物（上海麥克林生化科技有限公司，99.5%）、硝酸鈰銨（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析純）、硝酸銀（西隴科學股份有限公司，分析純）、冰乙酸（上海麥克林生化科技有限公司，99.9%）、乙二醇（天津市康科德科技有限公司，分析純）、聚乙烯吡咯烷酮（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、胰蛋白胨大豆肉湯（北京索萊寶科技有限公司）、金黃色葡萄球菌（天津大學化工學院）、大腸桿菌（天津大學化工學院）、PBS（北京索萊寶科技有限公司）、MTT（羅恩化學試劑）、去離子水、乙醇等。

儀器：電子天平，SB-800DTD 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、DGG-101-1BS 型烘箱（天津市天宇實驗儀器有限公司）、KQ-200KDE 型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、磁力攪拌器，湘儀TG16-WS 臺式高速離心機、BECKMAN COULTER Allegray 64R Centrifuge 離心機、移液槍，高溫高壓反應釜、BPG-9070A 精密鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、SX-G12123 節能箱式電爐（天津中環電路股份有限公司）、真空冷凍干燥機（LABCONCO 公司）、透射電子顯微鏡，X 射線衍射儀、二十四孔板、Thermo STERI-CYCLE i160 細胞培養箱、澳柯瑪AUCMA 冰箱、Thermo 1300 SERIES A2 超凈工作臺、Thermo Varioskan LUX 酶標儀、SPX-150B-Z 型生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、BIOBASE BSC-1500IIA2-X 型生物安全柜、101-1AB型電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）、歐諾NHY-2102C 立式雙層小容量全溫度恒溫培養搖床。

2.2 銀摻雜二氧化鈰復合材料的制備

2.2.1 5 nm 粒徑納米CeO2的制備

本階段主要采用水熱法制備粒徑為5 nm 的CeO2顆粒。水熱法為各種前驅物的反應和結晶提供了一個在常壓條件下無法得到的物理和化學環境，在本實驗中可以為CeO2的合成提供有利條件。在制備過程中，CeO2粉體的形成經歷了溶解、結晶兩個主要過程，為避免可能形成的粉體硬團聚，去除溶劑時不選擇傳統的烘干方式，改用冷凍干燥法，得到了均勻疏松的粉末材料。

具體的制備步驟為：室溫下在56 mL 去離子水中溶解2.199 g 硝酸鈰銨和8.015 g 乙酸鈉，加入8 mL 乙酸，攪拌30 min。將混合溶液轉移至100 mL不銹鋼高壓釜中，置于烘箱中，在180 ℃溫度下保溫200 min 后取出。待溶液冷卻到室溫，傾去上層半透明黃綠色清液，得到白色沉淀。用蒸餾水和乙醇各洗滌3 次，然后放入-80 ℃冰箱中預凍，隨進通過冷凍干燥即得到蓬松的5 nm 粒徑的CeO2。

2.2.2 100 nm 粒徑納米CeO2的制備

在合成粒徑為5 nm 的CeO2后，利用干燥后的產品進行了負載Ag 的實驗。在對負載后的產品進行掃描電子顯微鏡（SEM）表征時觀察到，由于5 nm粒徑的CeO2尺寸過小，嚴重影響了Ag 在CeO2上的負載，實驗效果不理想。為解決這一問題，對合成CeO2的實驗方法進行了調整，合成了粒徑約為100 nm 的CeO2。

具體制備步驟如下：在室溫下，將2.017 g硝酸鈰、2 mL 去離子水、2 mL 冰乙酸和52 mL 乙二醇混合，攪拌30 min。將混合溶液轉移至100 mL 不銹鋼高壓釜中，置于烘箱中，在180 ℃下保溫200 min 后取出。待溶液冷卻到室溫，傾去上層黃褐色清液，得到紫色沉淀。將沉淀用蒸餾水洗滌2 次、乙醇洗滌1 次后放入70℃烘箱內干燥。待干燥完全后將產品轉移至坩堝中，放入馬弗爐爐膛中心，在400 ℃高溫下反應4 h 得到粒徑為100 nm 的CeO2顆粒。

2.2.3 納米銀的負載

用浸漬法在CeO2上負載Ag。實驗過程的具體步驟如下：稱取0.1 g CeO2，將其分散在4 mL 去離子水中。按照一定比例稱取一定量的AgNO3晶體，溶解在2.0 mL 去離子水中。將AgNO3溶液加入CeO2懸濁液中，包錫箔紙避光，避免AgNO3因光照分解。將混合液攪拌10 h 后，置于70 ℃烘箱中烘干。將烘干后產品取出，蒸餾水洗滌2 次，即得到CeO2-Ag復合粒子。

3 結果與討論

3.1 CeO2-Ag 復合材料的制備和表征

首先嘗試將不同濃度的AgNO3（即5%、10%、20%質量濃度梯度）負載到5 nm CeO2的表面，對所得的系列產品進行X 射線粉末衍射（XRD）表征，以初步確定產品負載階段利用浸漬法是否能將Ag 負載上5 nm 的CeO2。（見圖1）

圖1 Ag 負載5 nm CeO2 的XRD 譜圖

X 射線粉末衍射譜的內容表明，樣品在20～80°（大角峰衍射）掃描范圍內有明顯的衍射峰，其中四組XRD 譜線大角度衍射峰中位于28°、32°、47°、56°、69°的五個衍射峰，分別對應CeO2的（111）、（200）、（220）、（311）和（420）衍射面（JCPDS:34-0394-CeO2)。大角衍射峰在38°、43°出現的小衍射峰，分別與Ag對應的（111）、（200）衍射面（JCPDS:04-0783-Ag）吻合，但Ag 的特征小峰在摻雜Ag 含量10%和20%譜線中才可清晰看出，且隨Ag 摻雜量的提高，Ag 的特征峰愈加明顯。在后續角度的譜線中，雖然譜線變得較為平緩，但相應的特征峰還是能繼續對應出現，并且Ag 的特征峰高度呈現出的比例和制備過程中AgNO3原料的加入比例是一致的。該表征結果初步證明了Ag 成功負載于5 nm CeO2顆粒之上。

利用掃描電子顯微鏡（SEM）表征技術可以直觀地了解材料顆粒的形貌、幾何形態和粒度分布等，從而輔助證明材料顆粒的外觀特性與負載情況。通過對首次制得的Ag 負載100 nm CeO2進行SEM 表征，得到了較為直觀的材料粒子微觀形貌。（見圖2）

圖2 首次Ag 負載100 nm CeO2 實驗材料的SEM 圖譜

SEM 所得表征畫面顯示，首次Ag 負載100 nm CeO2實驗材料中，粒子呈現較為規則的球形，直徑約為100 nm。粒子排布較為分散，部分有團聚現象。需要注意的是，在CeO2顆粒之間存在部分預期未出現的纖維狀結構，導致所觀察的顆粒不能清晰分明，且該纖維狀成分無法確定。

SEM 元素含量分析中顯示，首次SEM 表征的材料中并無任何存在形式的Ag，這與之前Ag 負載5 nm CeO2合成材料的XRD 表征結果有很大差異。據推測，Ag 未在材料中出現這一現象可能是由于實驗過程中在高溫加熱前對材料進行水洗，導致未與CeO2充分結合的Ag 脫落所致；CeO2顆粒中意外出現的纖維狀結構，可能是未能形成球狀結構的CeO2。

為更好探究AgNO3在反應體系中的濃度和實驗流程對最終產品的影響，在第二次進行100 nm CeO2顆粒負載Ag 的實驗時，設計了四組不同的實驗條件，見表1。

表1 四組對照實驗的實驗條件

經過掃描電子顯微鏡（SEM）檢測，產品中三種元素的質量占比，見表2。

表2 CeO2-Ag 復合材料中各元素占比

由上表可明確得出，產品中，Ag 的質量占比與實驗的預期結果是一致的。

若取1、3 組，2、4 組作為對照實驗組，即可證明AgNO3原料加入量的改變引起了產品中Ag 濃度的改變，亦可推測目前Ag 的加入濃度尚未超過CeO2顆?？韶撦d的Ag 濃度上限。在后續的抗菌實驗中，若因Ag 在復合粒子中的濃度太低導致所需的復合粒子濃度過高，可以通過進一步提升Ag 負載量的方式降低復合粒子的總量，從而降低成本、減少浪費。

若取1、2 組，3、4 組作為對照實驗組，則可證明水洗離心清洗掉部分與CeO2結合不牢固的Ag，保證了產品中的Ag 并非與CeO2簡單混雜在一起，而是通過范德華力成功負載于CeO2顆粒之上。（見圖3）

圖3 Ag 負載100 nm CeO2 方法調整后實驗的1 號產品SEM 圖譜

由于該實驗使用的CeO2原料與首次Ag 負載100 nm CeO2實驗的CeO2是同批次制成，因此SEM 表征圖中仍然存在纖維狀結構。實驗所得顆粒形狀為較規則的球形，直徑約為100 nm。由于Ag 的粒徑相較于CeO2顆粒較小，在SEM 圖中并不顯著，無法直觀觀察到Ag 顆粒的存在。（見圖4）

圖4 Ag 負載100 nm CeO2 方法調整后實驗的1 號產品元素掃描結果

為證明產品中Ag 的存在，對產品進行元素掃描。由上圖可以清晰直觀地確定O、Ag、Ce 三種元素在樣品中的分布。很顯然，Ag 在樣品中廣泛存在，其分布是分散、均勻、無團聚的。通過SEM 元素掃描，成功確定Ag 的存在，證明新的實驗方式成功將Ag均勻負載上了100 nm 粒徑的CeO2。

為解決前文提到的CeO2顆粒之間的纖維狀結構，改善CeO2原料的分散性，從而保證Ag 在CeO2上的高度分散，在后續實驗中向合成體系中加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP），進一步調控CeO2顆粒的粒徑、均勻度以及分散性。

圖5 可以看出，向合成體系中加入PVP 對改進產品分散性有很大作用。在新的SEM 表征圖內，CeO2顆粒呈現規則球形，直徑大多為100 nm左右，邊緣清晰可視，不再存在纖維狀絮狀結構，顆粒分散均勻，沒有明顯團聚現象，有利于后續實驗中Ag 的負載。

該表征階段利用XRD 與SEM 所得出的結果，為后續CeO2-Ag 復合材料的大量制備使用與抗菌實驗相應銀負載濃度的確定和粒徑大小的選擇提供了詳實數據與修整方案。圖6 是CeO2-Ag 復合材料表面元素分布和占比圖。

從圖6 可以看出，試樣中Ag 的平均含量為[(2.7+4.8)/2]×100%=3.75%（質量占比）。在進行細胞相容性和抗菌測試的過程中，均以此含量作為樣品中Ag 的含量進行計算。以Ag 的濃度作為測試的自變量，設計了抗菌測試與細胞相容性測試的濃度梯度。（見表3）

圖5 加入PVP 后水熱法制備100nm CeO2 的SEM 表征

圖6 CeO2-Ag 復合材料的元素分布譜和占比

表3 Ag 濃度與復合粒子濃度的對應關系

3.2 CeO2-Ag 復合材料抗菌性能和細胞相容性測試

選取較為典型的革蘭氏陰性大腸桿菌（E.coli）和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌（S.aureus）作為實驗菌種，對CeO2-Ag 復合材料抗菌性能進行測試。確定了有效殺菌濃度之后，選取小鼠成纖維細胞作為實驗細胞，對CeO2-Ag 復合材料的細胞毒性進行測試。

3.2.1 抑菌測試

抑菌測試的實驗結果是對CeO2-Ag 復合材料抗菌效果的直接體現。抑菌實驗的最終實驗結果如圖7所示。

圖7 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在銀濃度分別為0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL 培養液中的生長情況

當細菌在培養基中生長時，會出現液體變渾濁、表面形成菌落、底部有沉淀物的現象。通過直接觀察培養基，可以看到，隨著銀濃度的逐漸增加，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養基中，液體明顯變清澈，表面形成的菌落也逐漸減少，這說明CeO2-Ag 復合材料表現出了明顯的抑菌特性。同時也能看到，在Ag 濃度達到40 μg/mL 時，該復合材料對大腸桿菌生長抑制明顯；在Ag 濃度達到20 μg/mL 時，對金黃色葡萄球菌的抑制非常明顯。

通過測定最終菌體懸液的吸光度，得到了不同銀濃度下培養基中的細菌存活率。（見圖8）

通過以上分析，可以明顯地看到，當Ag 的濃度達到40 μg/mL 時，培養基中大腸桿菌的存活率僅為13.24%，說明在該濃度下CeO2-Ag 復合材料能夠有效地殺滅大腸桿菌。（見圖9）

從圖9 中可以看到，當銀濃度達到20 μg/ml 時，金黃色葡萄球菌的存活率迅速下降到14.62%。說明在該濃度下，CeO2-Ag 復合材料能有效地殺滅金黃色葡萄球菌。當Ag 濃度達到40 μg/ml 時，金黃色葡萄球菌的存活率為13.37%，此濃度下復合材料對大腸桿菌的抑菌效果顯著。（見表4）

綜合表4，容易看出，當Ag濃度達到40 μg/ml時，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的存活率均降到14%以下。因此可以證明在該濃度下CeO2-Ag 復合材料具有顯著的殺菌效果。

3.2.2 細胞相容性測試

將不同濃度的CeO2-Ag 與小鼠成纖維細胞共孵育48 小時后，加入0.5 mg/mL 的噻唑藍溶液，噻唑藍可以被活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶還原成非水溶性的甲瓚晶 體。用DMSO 將不同組產生的甲瓚晶體溶解后，檢測其在490 nm 處的吸光度，判斷小鼠成纖維細胞在不同銀濃度下的存活率，如圖10 所示。

從圖10 可知，當Ag 濃度達到40 μg/ml 時，小鼠成纖維細胞的存活率為94.25%，接近100%。這說明在銀濃度為40 μg/ml 時，該復合粒子對于生物體本身細胞沒有太多的毒性，處于安全范圍。

圖8 大腸桿菌在不同Ag 濃度下存活率

圖9 金黃色葡萄球菌在不同Ag 濃度下存活率

表4 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在不同銀濃度的培養基中的存活率

圖10 不同銀離子濃度下細胞的存活率

4 結論

本項目旨在將CeO2和Ag 結合，通過構建CeO2負載Ag 納米粒子的手段，結合Ag 優良的殺菌性能和CeO2抗氧化、清除自由基的獨特能力，以皮膚修復為目標問題，構建新型生醫材料——銀摻雜二氧化鈰納米粒子。項目通過水熱法合成納米CeO2，再以納米CeO2為載體通過浸漬法制備CeO2-Ag 復合材料，借助TEM、XRD、FT-IR 等手段進行表征，利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行了抗菌實驗測試其抗菌性。

（1）利用水熱法制備出了粒徑為5 nm 和100 nm 的CeO2，通過調整浸漬法中使用硝酸銀的用量，控制負載到CeO2上Ag 的量，制備出了不同負載量的復合粒子。通過設計負載完后用蒸餾水洗和不用蒸餾水洗這一組對比試驗，表明Ag 確實負載在了CeO2上。

（2）通過細胞相容性測試以及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抗菌實驗，得出結論：在銀濃度為40 μg/ml 時，該二氧化鈰負載納米銀材料具有顯著的殺菌效果，且對細胞的毒性較小，處于安全范圍。

綜上所述，本工作制備的CeO2-Ag 復合材料在不影響正常細胞生物相容性的基礎上，顯示出針對革蘭氏陰性菌和陽性菌顯著的抑菌效果。因此，我們提出的這一策略為新一代納米抗菌材料的發展提供了寶貴的經驗，具有較高的指導和借鑒意義。

1、相對過高的納米CeO2基材料制備成本仍是其在水處理中的應用絕大多數仍處于實驗室研究階段的重要因素。探索低成本、工藝簡單并能有效調控納米CeO2基材料形貌和尺寸的制備方法仍是研究的重點。

2、納米CeO2基材料由于顆粒小，使用后的回收及再生問題也是限制其應用的重要因素。其與樹脂類材料或磁性材料的復合，將是其材料制備和回收技術研究的重點方向。

3、開發納米CeO2基材料水處理技術和傳統污水處理技術的聯合工藝，將極大的促進納米CeO2基材料催化技術在水處理領域中的應用。

4、納米CeO2基材料相關毒性研究仍然較少，其在水處理系統中的環境行為及毒性機制還沒有定論。實際的污水處理工藝往往是多種污染物共存的，而共存的污染物之間會發生相互作用，進而改變納米材料的表面特性及潛在毒性。因此亟須開展更多相關方面的研究。