應用Illumina MiSeq測序技術對腹瀉北平頂猴腸道菌群的分析

金 潔 張飛燕 張慶宇 王 蕓 呂龍寶*

(1.中國科學院昆明動物研究所，昆明，650223；2.國家非人靈長類實驗動物資源庫，昆明，650223)

平頂猴(Macaca)是舊大陸猴中唯一易感艾滋病毒1型(HIV-1)的靈長類(Primates)動物[1]，其生理結構、機體代謝等方面與人類極為相似，是研究艾滋病病毒、新藥臨床前試驗和安全評價的理想動物模型[2-3]。此外，由于平頂猴具有復雜而精細的神經活動和行為，也常常用于研究腦結構和功能。根據所在地域，平頂猴被劃分為3個種：南平頂猴(M.nemestrina)、北平頂猴(M.leonina)和明打威猴(M.pagensis)，其中分布在中國的平頂猴被稱為北平頂猴[4]。2012年，中國科學院昆明動物研究所在國內率先建成北平頂猴飼養繁殖基地，通過長期的臨床病例統計分析發現，在北平頂猴消化道疾病中腹瀉的發病率較高，約占10%，嚴重者可出現脫水，甚至休克。據報道，在臨床上能引起腹瀉的病因非常多且復雜，如：腸源性疾病[5]、內分泌疾病[6]、腫瘤[7]和抗生素[8]等，其共同的臨床癥狀均包括腸道菌群失調。在健康動物體內，腸道菌群處于動態平衡中，與宿主協同進化互利共生，對維持宿主健康具有重要意義。當這種平衡被打破時，如：益生菌豐度減少、有害菌豐度大量繁殖，會造成各種炎癥、腸胃疾病等，常出現腹瀉癥狀。菌群失調可能是引起疾病的原因，或是疾病導致的結果。目前，對北平頂猴腸道菌群的研究尚未有報道。為了探究北平頂猴的腸道菌群結構及其腹瀉過程中腸道菌群的失調規律，本研究對健康和腹瀉北平頂猴的腸道菌群進行了對比分析，結合腸道微生態平衡的機理，揭示可能導致腹瀉的菌群及其變化規律，為平頂猴腹瀉治療用藥和益生菌制劑的合理使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品的采集

在中國科學院昆明動物研究所選取健康和腹瀉雄性成年(5—10歲)北平頂猴各6只，分別采集其新鮮糞便于采糞管中，并將裝有糞便的采糞管放入液氮罐中帶回實驗室。在超凈臺中取糞便內部分裝，對健康樣本編號H1—H6、腹瀉樣本編號D1—D6，所有樣本均置于冰箱中-80℃凍存，準備送樣測序。本試驗中的12只北平頂猴均單籠飼養于普通環境，每只北平頂猴的糞便樣品在排泄后10 min內完成收集。

1.2 細菌總DNA提取

使用MOBIO公司PowerFecalTMDNA試劑盒抽提12個糞便樣本中細菌的總DNA，分別用質量濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳和Qubit 4儀器檢測DNA質量。具體提取步驟按照說明書進行。

1.3 PCR擴增及高通量測序

PCR擴增及高通量測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。主要步驟如下：DNA質量合格后，用無菌水將其稀釋至1 ng/μL，利用稀釋后的總DNA為模板。使用特異引物515F(5′-GTGCCAGCMCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)選取細菌16S rRNA V3—V4區進行擴增。擴增PCR產物合格后，根據產物濃度等量混樣，并使用質量濃度2%的瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE)純化PCR產物，切膠回收目標條帶。使用高通量建庫試劑盒進行建庫，構建好的文庫經Qubit 4定量檢測合格后，采用高通量測序平臺Illumina HiSeq進行測序。

1.4 數據處理與分析

根據Barcode拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列得到原始數據。原始數據經FLASH拼接[9]、QIIME過濾[10]、Algorithm軟件去除嵌合體后[11]，通過Overlap關系將Reads拼接成Tags，從而得到有效數據。在97%的一致性下將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)。使用QIIME軟件計算每個樣品的Alpha多樣性指數，包括Chao1指數、ACE指數以及Shannon指數；用R軟件繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線；計算Unifrac距離，并利用OTUs的豐度信息得到weighted UniFrac距離[12]；同時通過PICRUSt菌群功能預測的方法評估北平頂猴腸道菌群的功能。各組數據組間差異的顯著性均采用IBM SPSS Statistics 24軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 測序結果與OTU聚類

12個樣本經測序后得到931 869條原始數據，通過拼接、質控和嵌合體過濾，共得到880 904條可用于后續分析的有效數據。在97%相似度下將所有樣品的有效序列聚類為用于物種分類的OTU，如表1所示，健康組OTUs數大于腹瀉組，且兩組間差異顯著(P=0.023)。

2.2 細菌群落豐富度和多樣性

從圖1A可以看出，稀釋曲線在序列數為46 846條后趨向平坦，說明取樣的數量合理，更多的取樣量只會產生少量新OTUs。Rank abundance曲線反映樣品中物種的豐富度和均勻度，如圖1B所示，健康組樣本的豐富度均高于腹瀉組樣本?；谝陨蟽牲c，此次測序數據量合理，測序深度已基本覆蓋樣品中所有細菌。

Alpha多樣性用于分析樣品內的微生物群落多樣性。其中，Shannon指數越大表明菌群多樣性越強，Chao1指數和ACE指數越大表明樣品中的物種越豐富。根據表1所示，健康組的細菌菌群多樣性顯著高于腹瀉組(香農指數，P=0.015)，健康組的細菌菌群豐度顯著高于腹瀉組(Chao1指數，P=0.014；ACE指數，P=0.032)。此外，覆蓋率(coverage)作為反映測序深度的指標，其值越接近于1，表明測序深度越能覆蓋到樣品中所有的物種。本試驗中各組樣本覆蓋指數均大于0.99，說明樣本中序列沒有被測出的概率極低。

2.3 Beta多樣性

Beta多樣性組間差異分析中，weighted UniFrac距離常用來衡量樣品間的物種多樣性的差異，距離與樣品間的物種多樣性差異呈正比。與健康組比較，腹瀉組的weighted UniFrac距離顯著降低(P=0.036)，表明腹瀉組與健康組在物種多樣性方面存在顯著性差異(圖2A)。主成分分析(PCA)能將樣本間的差異反映在二維坐標圖上。樣本的群落組成越相似，則它們在PCA圖中的距離越接近。圖2B顯示，健康組和腹瀉組分布在不同區域，表明健康平頂猴和腹瀉平頂猴的腸道菌群組成存在一定差異。

2.4 門分類水平上的細菌組成

從門分類水平，按相對豐度前10作圖(圖3)。健康組的厚壁菌門(Firmicutes，54.89%)顯著高于腹瀉組(45.63%)，而擬桿菌門(Bacteroidetes，42.87%)明顯低于腹瀉組(49.11%)。此外，平均相對豐度高于1%的門，健康組有螺旋體門(Spirochaetes，1.67%)，腹瀉組有變形菌門(Proteobacteria，1.33%)和未鑒定細菌(unidentified Bacteria，1.83%)。

2.5 屬分類水平上的細菌組成

在屬水平進行分析，按相對豐度平均值排名前10的菌屬作圖(圖4)。健康組乳桿菌屬(Lactobacillus，12.35%)、普氏菌屬(Prevotella，5.23%)和未鑒定瘤胃球菌屬(unidentified Ruminococcaceae，4.26%)的平均相對豐度明顯高于腹瀉組(3.57%，2.47%，3.40%)，而鏈球菌屬(Streptococcus，5.72%)、糞桿菌屬(Faecalibacterium，1.73%)和彎曲桿菌屬(Campylobacter，0.74%)的相對豐度明顯低于腹瀉組(10.25%，4.82%，2.09%)。

2.6 PICRUSt基因預測

PICRUSt根據測序數據預測樣品中的細菌功能類別相對豐度，獲得的預測結果通過KEGG基因家族進行分類，結果顯示健康組與腹瀉組優勢基因分區明顯(圖5)。共獲得六大類功能(不包含未預測出的和未分類的)：細胞加工、環境信息處理、有機體系統、人類疾病、代謝作用、基因信息處理?；蚬δ茴A測熱圖(圖6)表明，健康與腹瀉組的基因功能存在一定差異，其中健康組的優勢基因主要集中在與細胞加工、環境信息處理等功能方面，而腹瀉組則主要集中在與有機體系統、人類疾病和代謝作用相關的方面。

3 討論

本試驗分別采集了6只健康和6只腹瀉北平頂猴糞樣，利用Illumina MiSeq高通量測序技術對2組北平頂猴的腸道菌群進行分析比較，獲得稀釋曲線趨于平坦，測序覆蓋率已達99.99%，說明檢測出的微生物群落已基本覆蓋腸道內所有細菌。

健康組細菌的OTUs和Alpha多樣性均顯著高于腹瀉組；Beta多樣性分析顯示，健康組和腹瀉組的腸道菌群在物種多樣性方面存在顯著差異。揭示了北平頂猴發生腹瀉可能與腸道內細菌總數的變化和菌群結構的多樣性有關。

在門水平上，北平頂猴的優勢菌群為厚壁菌門和擬桿菌門，與非人靈長類(Primates)動物腸道的優勢菌群[13]相同，二者比例之和為70.50%—98.30%[14]。厚壁菌門可促進宿主吸收或儲存能量，擬桿菌門可通過降解碳水化合物、蛋白質等，促進宿主吸收營養，平衡腸道微生態[15]。當腸內菌群失調，厚壁菌門相對豐度顯著高于擬桿菌門時會導致食物中的熱量更為有效地被吸收，從而引起肥胖[16-18]。北平頂猴腹瀉組腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比值低于健康組，可能是腹瀉猴機體吸收能量較低所致。螺旋體門不僅能有效降解纖維素，還能利用碳水化合物形成揮發性脂肪酸，為動物機體提供能量[19]，健康組腸道內螺旋體門平均相對豐度高于腹瀉組，進一步解釋了健康動物精神狀況較腹瀉動物好的原因。變形菌門包括多種病原菌，例如：大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)等[20-21]，當腸內微生態失調，變形菌門相對豐度增加時常導致腹瀉。先前有報道，在健康人類的腸道內變形菌門豐度較低，但某些致病因素會誘發其大量增殖，產生促炎因子，引起腸道炎癥和腹瀉[13]，因此本試驗中腹瀉組腸道內高豐度的變形菌門可能是導致北平頂猴發生腹瀉的因素之一。另外，在平均相對豐度低于1%的門中，放線菌門的多數物種有益于人體或者對人體無害，其中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)通過生產醋酸鹽和乳酸鹽等調節腸道菌群[22]。腹瀉組放線菌門的平均豐度低于健康組，可能是菌群失調所致。

在屬水平上，乳桿菌屬可通過產酸改變腸道微生態環境，抑制病原菌與腸黏膜上皮細胞黏附，阻礙其在腸道內定植、繁殖，減少疾病的發生[23-24]；普氏菌屬善于合成維生素B1，可作為益生菌替代菌分解食物中的糖類[14]，普氏菌屬與擬桿菌屬的比值越高，可能越益于宿主的代謝調節[25]。本試驗中腹瀉組乳桿菌屬和普氏菌屬的平均相對豐度明顯低于健康組，導致腸內益生菌減少、菌群失調，可能是誘導機體發生腹瀉的病因之一。彎曲桿菌屬是導致人類細菌性腹瀉的主要原因，人感染該菌后主要表現為急性腹瀉、發熱、腹痛和伴有血便等癥狀[26]。本試驗中腹瀉組彎曲桿菌屬的相對豐度較健康組高也是引發腹瀉的因素之一。另外，某些鏈球菌屬可導致炎癥[27]，但本試驗中鏈球菌屬與腹瀉發生的關系還有待進一步探究。

腸道微生物與機體的免疫功能、消化吸收、能量代謝和生理功能等有關[28]。人類腸道微生態穩態被破壞后可導致過敏[29]、肥胖和糖尿病[30]等。由此可見，腸道微生物平衡對于維持機體的正常生理功能具有重要作用。腹瀉發生時，伴隨機體營養物質大量流失、免疫力下降，易增加疾病發生的概率，機體需要通過調節自身生理功改善這一現象，基因預測也驗證了這一結果：腹瀉組功能基因主要與有機體、疾病和代謝相關。

4 小結

腸道菌群的平衡和失調是可逆的，本研究從微生態學角度對北平頂猴腸道菌群失衡與腹瀉之間的關系進行了分析，以期為應用干預腸道微生態治療北平頂猴腹瀉提供實驗數據。