二甲雙胍對人急性髓系白血病KG1a細胞增殖和凋亡的影響及其機制

崔珊珊,李雅慧，趙晨瑾，張 震，姬曼曼，王桐桐，司曉慧，牛新清

(新鄉醫學院醫學檢驗學院，河南 新鄉 453003)

二甲雙胍作為單磷酸腺苷激活的蛋白質激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)的激活劑，近年來已從治療2型糖尿病的一線藥物逐漸發展為抗癌藥物。二甲雙胍通過調控多種信號通路抑制腫瘤細胞的生長，對食管癌、肝癌、胃癌、結直腸癌等多種腫瘤細胞的生長均有抑制作用[1]。ARRIETA等[2]研究發現，二甲雙胍聯合酪氨酸激酶抑制劑可顯著延長攜帶表皮生長因子受體突變的晚期肺癌患者的無進展生存期和總生存期，且不良反應與單獨使用靶向藥物一致。但目前二甲雙胍對急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)作用的相關研究報道較少。急性髓系白血病KG1a細胞系在形態上處于細胞發育的早期階段，是具有白血病干細胞特性的早期髓系白血病細胞，對常規化學治療藥物耐藥[3-4]。因此，本研究選取KG1a細胞為研究對象，探討二甲雙胍對其增殖、凋亡的影響及作用機制，以期為二甲雙胍用于臨床難治性白血病的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器AML細胞株KG1a由南方醫科大學珠江醫院提供，本實驗室凍存。胎牛血清和RPMI1640 培養液購自美國Gibco 公司，100×鏈霉素/青霉素溶液購自美國Hyclone公司，二甲雙胍購自上海生工生物工程技術服務有限公司，細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自日本Dojindo公司，膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexinV-fluorescin isothiocyanate，AnnexinV-FITC)/碘化丙錠(propidium iodide,PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，放射免疫沉淀實驗細胞裂解液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer,RIPA)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒及羊抗兔二抗購自中國康為世紀生物科技有限公司，β-肌動蛋白(β-actin)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase α,AMPKα)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase，P70S6K)、4E-結合蛋白-1(eIF4E-binding proteins-1,4EBP-1)、Thr172位點磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶[phosphorylated AMP-activated protein kinase at Thr172 site,pAMPK(Thr172)]、磷酸化蛋白激酶B[phosphorylated protein kinase B at Ser473 site,pAKT(Ser473)]、Thr37/46位點磷酸化核糖體蛋白S6激酶[phosphorylated ribosomal protein s6 kinase at Thr37/46 sites，pP70S6K(Thr37/46)]、Thr389位點磷酸化4E-結合蛋白-1[phosphorylated eIF4E-binding proteins-1 at Thr389 sites,p4EBP-1(Thr389)]兔抗人一抗購買自美國CST公司。Thermo 酶標儀購自上海賽默生物科技發展有限公司，BD 流式細胞儀購自美國 BD 公司，Mini Trans-Blot 電泳儀購自美國Bio-Rad 公司，Thermo Scientific CO2恒溫培養箱購自鄭州金寧儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養取AML細胞株KG1a，接種于含體積分數 10% 胎牛血清、1 × 106U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置于37 ℃、含體積分數 5% CO2、相對濕度95%的恒溫培養箱中傳代培養，每1～2 d更換1次培養液，3～4 d傳代1次，使用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2 CCK-8測定法檢測細胞增殖能力取處于對數生長期KG1a細胞，用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基調整細胞懸液至終細胞濃度為8×107L-1，以每孔100 μL細胞懸液接種到96孔板中，隨機分為對照組及2、4、6、8、10、12、16、24、32 mmol·L-1二甲雙胍組，分別加入終濃度0、2、4、6、8、10、12、16、24、32 mmol·L-1二甲雙胍，另設一不含細胞與藥物的空白組作為比對，每個濃度設3個復孔。將96孔板置于37 ℃、含體積分數 5% CO2恒溫培養箱中培養48 h，然后分別加入10 μL CCK-8，置于37 ℃、含體積分數5% CO2恒溫培養箱中培養1.5 h，使用酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度值，設3個復孔，取平均值。計算細胞存活率，細胞存活率=(實驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡情況取對數生長期KG1a細胞，用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基調整細胞懸液至終濃度為1×109L-1，以每孔2.0 mL接種到6孔板上，隨機分為對照組及2、6 mmol·L-1二甲雙胍組，分別加入終濃度0、2、6 mmol·L-1二甲雙胍，將6孔板置于37 ℃、含體積分數 5% CO2恒溫培養箱中常規培養48 h，收集細胞，將細胞懸于300 μL 細胞結合緩沖液中，加入5.0 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，室溫避光孵育15 min后，加入5.0 μL PI，12 000 r·min-1離心 5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞。然后，加入10 μL PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。使用Flowjo軟件進行數據分析。

1.2.4 免疫印跡法檢測AMPK通路蛋白表達水平取對數生長期KG1a細胞，用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基調整細胞懸液至終濃度為1×109L-1，以每孔2.0 mL接種到6孔板上，隨機分為對照組及2、6 mmol·L-1二甲雙胍組，分別加入終濃度0、2、6 mmol·L-1二甲雙胍，將6孔板置于 37 ℃、含體積分數5% CO2恒溫培養箱中常規培養48 h;藥物作用完成后磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞2次，每組加入300 μL RIPA，冰上裂解30 min。將EP管放入離心機，12 000 r·min-1離心 15 min，離心后吸取上清用BCA進行蛋白濃度測定。根據蛋白濃度計算上樣體積，蛋白中加入上樣緩沖液，95 ℃煮蛋白10 min使其變性后進行丙烯酰胺垂直電泳，將膠上蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，轉膜結束置于50 g·L-1脫脂奶粉中封閉1.5 h，加入兔抗人β-actin、AMPKα、AKT、P70S6K、4EBP1、Thr172p-AMPKα、Ser473p-AKT、Thr37/46p-P70S6K、Thr 389p-4EBP1一抗(稀釋比例均為11 000)，4 ℃低溫孵育過夜，第2天用含Tween-20 的 PBS 洗膜3次，每次5 min;加入羊抗兔二抗(稀釋比例為15 000)，室溫孵育1 h，應用含 Tween-20 的 PBS洗膜 3 次，每次5 min;發光顯色、拍照，應用 Image J 軟件分析條帶灰度值。以目的條帶的灰度值與內參蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。

2 結果

2.1 10組KG1a細胞存活率比較對照組及2、4、6、8、10、12、16、24、32 mmol·L-1二甲雙胍組KG1a細胞存活率分別為(100.02±0.03)%、(73.23±4.47)%、(57.08±3.04)%、(50.51±1.09)%、(44.72±0.81)%、(39.29±0.63)%、(38.41±1.92)%、(30.33±1.48)%、(25.01±0.87)%、(22.65±1.19)%。與對照組比較，各濃度二甲雙胍處理組KG1a細胞存活率顯著減低，且呈濃度依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)。二甲雙胍對KG1a細胞的半數抑制濃度為6 mmol·L-1，以6 mmol·L-1為后續實驗工作濃度選擇的參考。

2.2 3組KG1a細胞凋亡率比較結果見圖1。對照組、2 mmol·L-1二甲雙胍組及6 mmol·L-1二甲雙胍組KG1a細胞凋亡率分別為(6.64±0.63)%、(19.14±1.21)%、(26.87±1.09)%。2 mmol·L-1二甲雙胍組和6 mmol·L-1二甲雙胍組KG1a細胞凋亡率高于對照組，6 mmol·L-1二甲雙胍組KG1a細胞的凋亡率高于2 mmol·L-1二甲雙胍組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

A：對照組；B：2 mmol·L-1二甲雙胍組；C：6 mmol·L-1二甲雙胍組

2.3 3組KG1a細胞AMPK信號通路蛋白比較結果見表1和圖2。2 mmol·L-1二甲雙胍組和6 mmol·L-1二甲雙胍組KG1a細胞中AKT、AMPKα、P70S6K、4EBP-1及p-P70S6K(Thr37/46)、p-4EBP1(Thr389)蛋白相對表達量顯著低于對照組，p-AMPKα(Thr172)、p-AKT(Ser473)蛋白相對表達量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。6 mmol·L-1二甲雙胍組KG1a細胞中AKT、AMPKα、P70S6K、4EBP-1及p-P70S6K(Thr37/46)、p-4EBP-1(Thr389)蛋白相對表達量顯著低于2 mmol·L-1二甲雙胍組，p-AMPKα(Thr172)、p-AKT(Ser473)蛋白相對表達量顯著高于2 mmol·L-1二甲雙胍組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 3組KG1a細胞AMPK通路蛋白相對表達量比較

1:對照組；2：2 mmol·L-1二甲雙胍組；3：6 mmol·L-1二甲雙胍組。

3 討論

AML是一種造血干細胞惡性克隆性疾病，主要采用聯合化學治療和造血干細胞移植治療。目前盡管AML緩解率很高，但仍有相當比例的AML患者復發[5]。AML復發主要原因是體內殘存少量的白血病干細胞。近年來，二甲雙胍已從治療2型糖尿病的一線藥物逐漸發展成抗癌藥。研究發現，二甲雙胍可通過抑制腫瘤干細胞的生長起到抗癌作用，其相關機制和影響因素已成為近年來的研究熱點[6]。PATIL等[7]研究發現，二甲雙胍能抑制原代口腔癌細胞干細胞相關基因的表達。CUYS等[8]研究發現，二甲雙胍能通過抑制核因子κB受體活化因子配體過表達增加乳腺癌干細胞系對地諾單抗的敏感性。KIM等[9]研究發現，二甲雙胍對部分結直腸癌干細胞的生長有抑制作用，且結直腸癌干細胞對二甲雙胍的敏感性可能與細胞谷氨酰胺的代謝水平有關，耐藥細胞的谷氨酰胺酶和谷氨酰胺轉運體的水平高于敏感細胞，谷氨酰胺酶抑制劑與二甲雙胍聯合應用可增加結直腸癌干細胞敏感株與耐藥株對二甲雙胍的敏感性。但目前國內針對二甲雙胍對AML的治療作用尚未見相關研究報道。本研究結果顯示，不同濃度二甲雙胍干預KG1a細胞后其存活率顯著降低，且隨二甲雙胍濃度的升高KG1a細胞存活率呈顯著下降趨勢，與PATIL等[7]和CUYS等[8]研究結果一致，進一步證實二甲雙胍可以誘導致KG1a細胞凋亡，且呈濃度依賴性，提示二甲雙胍可應用于臨床AML的治療。

AMPK是一種保守的蛋白激酶，能夠監測到細胞能量狀態，并在能量受限條件下保護細胞功能。AMPK被稱為代謝腫瘤抑制劑，可抑制細胞增殖，在被激活后，其合成代謝通路被抑制，分解代謝通路被激活，活化的AMPK可抑制糖異生及脂肪和蛋白質的合成，同時刺激肝臟中的脂肪酸氧化和葡萄糖攝取。AMPK下游靶蛋白P7OS6K和真核細胞啟動子4EBP1與致癌蛋白的合成有關[10]。二甲雙胍作為AMPK的激活劑，可抑制線粒體復合體Ⅰ抑制細胞的氧化磷酸化[11-12]。而細胞能量供應減少可導致單磷酸腺苷/三磷腺苷(adenosine monophosphate/adenosine triphosphate，AMP/ATP)比例升高，從而激活AMPK。AMPK激活可以直接或間接抑制其下游的哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白，導致其下游靶蛋白P70S6K和4EBP1的磷酸化水平降低，使細胞內蛋白質的合成下降，進而抑制腫瘤細胞生長[13-14]。本研究結果顯示，隨著二甲雙胍濃度的增高，KG1a細胞AMPKα、P70S6K、4EBP1 p-P70S6K、p-4EBP1相對表達量明顯下降，表明二甲雙胍可抑制KG1a細胞P70S6K、4EBP1的合成及其磷酸化，通過激活AMPK通路抑制KG1a細胞的增殖。

AKT可調控多個生物過程，包括細胞存活、凋亡和糖原代謝。AKT通過下游多種途徑對靶蛋白進行磷酸化而發揮抗凋亡作用，如ATK激活IkB激酶，導致核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抑制劑 IκB的降解，從而使NF-κB從細胞質中釋放出來進行核轉位,激活其靶基因而促進細胞的存活；AKT可磷酸化Bcl-2家族成員BAD，使其與14-3-3結合，從而阻止其與Bcl-XL結合而誘導細胞凋亡；此外，AKT能抑制蛋白水解酶caspase-9的活性而阻止凋亡級聯反應的激活。腫瘤抑制因子p53為轉錄因子，能夠調控細胞凋亡、DNA修復和細胞周期的停滯；AKT能通過磷酸化p53結合蛋白MDM2影響p53的活性，磷酸化的MDM2轉位到細胞核與p53結合，通過增加p53蛋白的降解而影響細胞存活。叉頭狀轉錄因子FOXO1調節涉及多種細胞功能基因的表達，包括凋亡、DNA修復、細胞周期的停滯和葡萄糖代謝等，AKT磷酸化FOXO1，抑制其核轉位而阻止其轉錄激活作用。本研究結果顯示，隨著二甲雙胍濃度的增高，AKT相對表達量呈顯著降低，p-AKT及p-AMPKα相對表達量顯著增高，與WANG等[15]研究結果一致，提示二甲雙胍可能通過抑制AKT的表達、增加AKT及AMPKα的磷酸化誘導了KG1a細胞凋亡。

綜上所述，二甲雙胍可抑制具有白血病干細胞特性的KG1a細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與二甲雙胍調控AMPK信號通路有關。