PKC/CUGBP1信號通路與強直性肌營養不良骨骼肌病理特征的關系

尹 雪，劉 娜，馮俊強

(大慶龍南醫院神經內科，黑龍江 大慶 163000)

強直性肌營養不良(DM)是最常見的致死性單基因疾病之一，根據不同基因重復擴增所致分為DMⅠ型和DMⅡ型，二者都具有常染色體顯性遺傳和多系統特征，包括強直性肌病、白內障和心臟傳導疾病[1-3]。目前該病在臨床診斷中易出現誤診、漏診，因此探究該病的致病機制對于該病的早期精準確診、治療具有重要意義。

蛋白激酶C(PKC)是一種在所有類型的細胞中均可表達的相關絲氨酸/蘇氨酸激酶。PKC的功能包括基因表達、細胞遷移、增殖、分化和凋亡。此外，PKC還與心力衰竭、糖尿病和帕金森氏病以及炎癥和免疫等常見疾病的病理生理過程有關[4]。據報道[5-7]，DM是由CUG重復RNA轉錄引起，導致肌肉盲樣的螯合和CUG三聯體重復RNA結合蛋白(CUGBP1)的異常表達，并且PKC信號通路在DM中發生過度磷酸化，但是該信號通路的活性與DM骨骼肌纖維的病理特征及CUGBP1表達之間的關系尚未清楚。本研究旨在探究DM骨骼肌纖維病理特征與PKC/CUGBP1信號通路之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年2月在大慶龍南醫院確診的DM患者11例(DM組)，均為黑龍江省大慶市一個DM罹患家系成員，所有患者均簽署知情同意書，均行開放式骨骼肌活檢取材。診斷標準：1)中青年開始發病，病程緩慢；2)臨床癥狀為肌強直、無力、萎縮；3)肌電圖顯示強直電位；4)肌肉病理符合強直性肌營養不良。臨床癥狀：9例DMⅠ型患者最初表現為四肢無力、抓握、抬腿、張口咀嚼、閉眼困難，視力衰退；2例DMⅡ型患者進一步發展出現多系統受累，表現為心臟受累、糖尿病、智力低下、白內障、性功能障礙等。ELISA實驗室檢測11例患者血清肌酸激酶含量表現顯著升高，平均為(323.01±30.12)U·L-1。

選取同期在本院行骨折手術治療患者11例(正常組)，經檢查確認均無肌不良癥狀，骨折手術治療時行骨骼肌活檢取材。

1.2 檢測方法

1.2.1 病理學表現

截取肌纖維的橫切面，進行組織化學染色(HE、MGT、NSE、NADH-TR、ACP、ATP)，在顯微鏡下用200～400放大倍數觀察視野內肌纖維病理變化(包括肌纖維直徑及肌纖維萎縮、肌纖維肥大、肌纖維核內移、嗜堿性肌漿塊發生情況)。免疫組織化學法觀察組織中膜蛋白的變化。

1.2.2 PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1蛋白表達水平

運用蛋白免疫印跡法檢測肌肉組織中PKC信號通路的關鍵蛋白PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1的表達變化情況。選取病變程度中等適中的肱二頭肌肌腹(避免選擇過輕或過重萎縮病變的肌肉肌腹，因其所提供的信息可能因病變過輕導致病理進程變化不典型或病變過重導致信息大量喪失無法觀察到典型病理改變)→局部浸潤麻醉→切開皮膚，暴露深筋膜，切開深筋膜暴露肌膚→孤立、提取直徑約1.0 cm 的肌纖維束→置于生理鹽水濕紗布上修剪塑形→耦合劑包埋→液氮冷凍→切片機切片，厚度7 μm恒冷切片備用。將備好的各個組織塊在無菌條件下充分研磨，用2倍組織體積的無菌水混勻，離心，棄沉淀，取上清。再用RIPA蛋白裂解液(來自北京百奧萊博)處理組織使組織在低溫下充分裂解。提取組織中的總蛋白，并使用BCA蛋白定量試劑盒(來自上海生工生物)進行蛋白定量，100 ℃沸水浴變性處理10 min。取變性的蛋白上清液50 μg上樣，用SDS-PAGE蛋白電泳分離蛋白。將瓊脂膠上的蛋白在4 ℃冰箱中使用濕轉法轉移至PVDF膜，并用2.5%的脫脂奶粉37 ℃下封閉處理30 min。將1:1000倍稀釋的兔抗PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1抗體(來自上海艾博抗)浸泡PVDF膜，置于4 ℃冰箱中孵育12 h，結束后取出洗滌3～5次。再次轉移至1:500倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗(來自北京中西華大)溶液中，37 ℃孵育30 min。取出充分清洗，使用ECL顯色試劑盒進行顯色處理，最后使用Image J分析目的條帶的灰度值與GAPDH的灰度值之間的比值，表示目的蛋白的表達水平。

1.3 統計學方法

使用SPSS21.0統計軟件進行數據處理。對數據進行正態分布和方差分析檢驗，將符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示；病理變化的頻率用百分數(%)表示。正常組和DM組PKCδ、p-PKCδ的蛋白表達水平比較采用獨立樣本t檢驗；對11例DM組患者肌纖維萎縮、肌纖維肥大、肌纖維核內移、嗜堿性肌漿塊發生率與PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1表達水平的關系采用Pearson相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨骼肌病理學表現

1)HE染色結果顯示：正常組骨骼肌組織未見病理學改變(圖1A)。6例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌纖維結締組織大量增生，以致肌纖維松散排布，發生空泡樣變；3例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌纖維大小不一，有原形和多邊形，出現肌纖維異常(小的為發生萎縮，大的為發生肥大)，伴有不同程度的壞死或肌漿塊；4例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌纖維核聚集，形成核袋或核鏈(圖1B)。2)MGT染色結果顯示：7例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌組織出現紅色的纖維破碎片(圖1C)。3)NADH-TR染色結果顯示：4例DMⅠ型患者和1例DMⅡ型患者肌纖維出現蟲蝕樣變，發生萎縮變小的肌纖維深染成藍色肌漿塊(圖1D)。4)NSE染色結果顯示：11例DM患者萎縮變性的肌組織可見明顯深染(圖1E)。5)ACP染色結果顯示：8例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌組織酸性磷酸酶活性發生明顯升高(圖1F)。6)ATP染色結果顯示：9例DMⅠ型患者肌纖維出現選擇性Ⅰ型萎縮(圖1G)，2例DMⅡ患者肌纖維出現選擇性Ⅱ型萎縮(圖1H)。7)免疫組織化學結果顯示：9例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者患者的膜蛋白表達未出現異常(圖2)。

A：正常組HE染色(×400)；B：DM組HE染色(×400)；C：DM組MGT染色(×400)；D：DM組NADH-TR染色(×400)；E：DM組NSE染色(×200)；F：DM組ACP染色(×200)；G：DMⅠ型患者ATP染色(×200)；H：DMⅡ型患者ATP染色(×200)。

A：Dystrophin-C染色膜蛋白；B：Dysferlin染色膜蛋白。圖2 免疫組織化學表現(×200)

11例DM患者肌纖維萎縮發生率在5.25%～30.50%之間，肌纖維肥大發生率在0.00%～9.67%之間，肌纖維核內移發生率在16.50%～92.75%之間，嗜堿性肌漿塊發生率在0.00%～5.50%之間，見表1。

表1 11例DM患者骨骼肌病理變化

2.2 PKC/CUGBP1信號通路關鍵蛋白PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1的表達

與正常組比較，DM組肌肉組織中PKCδ蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，p-PKCδ、CUGBP1蛋白表達均顯著升高(均P<0.001)，見圖3、表2。

A：PKCδ、p-PKCδ蛋白表達；B：CUGBP1蛋白表達。圖3 PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1蛋白電泳圖

表2 2組PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1蛋白表達水平比較

2.3 DM患者PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1表達與病理特征的相關性分析

DM患者p-PKCδ、CUGBP1表達與肌纖維萎縮、肌纖維肥大、肌纖維核內移發生率均呈顯著正相關(均P<0.05)，與嗜堿性肌漿塊發生率、膜蛋白異常率均無明顯相關(均P>0.05)。DM患者PKCδ表達與肌纖維萎縮、肌纖維肥大、肌纖維核內移、嗜堿性肌漿塊發生率及膜蛋白異常率均無明顯相關(均P>0.05)。見表3。

表3 DM患者PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1表達與病理特征的相關性分析

3 討論

DM是成年人中最常見的肌營養不良癥，其原因是CTG或CCTG重復序列的基因組擴增不穩定，包含擴展重復序列的突變RNA轉錄物會干擾細胞核中的剪接因子，從而導致毒性功能獲得及替代性的前mRNA剪接失調。該病的表現具有高度的可變性，并且可通過發病年齡和癥狀的嚴重程度區分[8]。其發病率極低且具有顯性遺傳的特性，即只要具有患病基因就會表現癥狀。癥狀的輕重與患者攜帶顯性基因的數目相關[9-10]。雖然已有研究[5-7]證明PKC信號通路的活性會影響CUGBP1基因的表達水平，但是二者與患者的病理特征之間的關系尚未清楚。

PKC、CUGBP1參與DM的發生發展過程。唐迎龍[11]報道，CUGBP1不僅在DM中發揮重要作用，其還通過調控RyR1進而影響鈣的釋放，導致骨骼肌萎縮。據報道[12]，在DMⅠ骨骼肌中LIM域結合3(LDB3)外顯子11發生異常，其可以通過轉染CTG重復序列擴展的基因來復制；此外，LDB3外顯子11陽性與外顯子11陰性相比，其對PKC的親和力顯著降低；由于PKC在DMⅠ中表現出過度活化并通過磷酸化穩定CUGBP1，因此LDB3的異常剪接可能會通過改變其對PKC的親和力來促進CUGBP1的上調。也有研究[13]報道，PKC抑制劑可影響CUGBP1家族成員CELF1的過度磷酸化改善DMⅠ小鼠模型的心臟表型，其作用機制與PKC抑制劑消除了核病灶，降低了CELF1的蛋白表達水平有關，與PKC信號通路活性無關。近期，陳慧敏[14]在探究DM分子生物學發病機制中報道，核聚體結構為肌盲蛋白1與RNA發卡二級結構相結合，使游離MBNL1下降，異常擴增的核苷酸重復序列過度激活PKC信號通路的磷酸化過程，使DMⅠ型肌細胞中CUGBP1的表達水平異常升高。本研究通過組織化學染色、免疫組織化學染色觀察骨骼肌組織的病理特征，并檢測其PKCδ、p-PKCδ的蛋白表達水平，結果顯示，p-PKCδ的表達水平與肌纖維萎縮、肥大、核內移呈正相關。這說明PKC信號通路的活性在DM患者骨骼肌中異常降低，這種情況與患者的病理特征(肌纖維萎縮、肥大、核內移)之間呈正相關。這與陳慧敏[14]的研究結果一致，再次證實了該信號通路在DM中的調控功能。本研究檢測了患者骨骼肌組織中CUGBP1的蛋白表達水平，結果發現，CUGBP1在患者骨骼肌組織中的表達水平異常升高，說明CUGBP1與p-PKCδ之間可能存在正向相關關系，即PKC信號通路的磷酸化程度會影響下游基因CUGBP1的表達水平。此研究結果揭示了DM患者的病理特征與PKC/CUGBP1信號通路之間的聯系，暗示PKC/CUGBP1信號通路可作為診斷、治療DM的潛在生物靶標。值得注意的是，該研究還發現肌纖維萎縮、肥大、核內移與CUGBP1的表達水平也呈顯著的正相關，這說明CUGBP1基因的表達量與患者的病理特征嚴重程度之間呈正相關。

綜上所述，強直性肌營養不良骨骼肌的病理特征與PKC/CUGBP1信號通路的活性存在緊密聯系，為DM的治療提供理論依據。