山羊地方性鼻內腫瘤病毒全基因組序列分析及其gag基因促腫瘤發生的機制研究

潘啟東，曾顯成，楊彬偲，劉慶華，徐泉明，陳吉龍

(福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)，福州 350002)

羊地方性鼻內腫瘤(enzootic nasal adenocarcinoma, ENA)是由綿羊地方性鼻內腫瘤病毒(enzootic nasal tumor virus 1, ENTV-1)和山羊地方性鼻內腫瘤病毒(enzootic nasal tumor virus 2, ENTV-2)導致鼻甲篩骨上皮細胞惡性轉化而引起的慢性、進行性、傳染性的腫瘤[1]。該病呈世界性分布，迄今為止，除了澳大利亞和新西蘭所在的大洋洲之外，其他大洲均有ENTV-2的報道[2]。1995年，林曦等[3]報道了14例發生在內蒙古山羊地方性鼻內腫瘤病例，這也是我國首次報道，之后在湖南[4]、四川[5]、陜西[6]等地相繼報道此病，但并未引起相關人員的注意和重視，由于引種和運輸檢疫把關不嚴，從2011年開始，福建有多個市相繼暴發該疾病[7]，且有流行的趨勢，目前沒有有效的藥物和疫苗可以使用，對我國的養羊業造成巨大的經濟損失。

本病呈地方性流行，主要臨床癥狀為病羊食欲減退，日漸消瘦，精神萎靡，鼻腔產生大量鼻涕滲出物，張口呼吸，剖檢可見鼻內單側或雙側出現腫瘤增生物[8]。腫瘤除了損害鼻甲骨之外，還會入侵鼻竇和額竇等部位，使局部骨骼變軟或萎縮，造成面部不對稱，后期增生物擴大占據鼻腔空間引起鼻腔堵塞，導致病羊呼吸困難或者窒息死亡[9-10]。從出現臨床癥狀到病羊死亡的時間從3周到1年不等[11]，本病發病率不高，但是死亡率可達到100%，其主要原因是后期腫瘤增生物堵塞鼻腔，病羊呼吸衰竭和繼發性感染[2，12]。截至目前，并未見有成功體外分離病毒的報道[13]，導致對該病毒致病性研究偏少。本研究從福建福州市郊某山羊場采集疑似山羊地方性鼻內腫瘤組織樣品，通過RT-PCR確診該羊場部分山羊患有該病，根據NCBI上傳的ENTV-2序列設計多對引物進行RT-PCR，經測序后利用生物信息學軟件拼接得到病毒全基因組，其GenBank登錄號為MT598195。進一步對全基因組繪制進化樹進行分析，同時構建了gag蛋白的原核表達和真核表達載體，制備多克隆抗體和獲得了過表達穩定細胞系，對gag蛋白的作用及其機制進行了研究，以期為該病的防控及深入研究其致病機制、研發疫苗和藥物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

293T細胞、K562細胞和OFTu細胞由本實驗室保存；山羊鼻內腫瘤組織采樣于福州市郊某羊場；BALB/c Nude裸鼠：4～5周齡，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司；原核表達載體pET-21a(+)和過表達載體pMIG-CMV-80 ℃凍存于本實驗室；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、克隆載體pLB、大腸桿菌DH5α、表達感受態BL21(DE3)均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑

限制性內切酶EcoRⅠ、NheⅠ、XhoⅠ、BgIⅡ、T4連接酶、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Oligod T(18)/Random Primer、25 mmol·L-1MgCl2、RTase、RiboLock Rnase Inhibitor、10 mmol·L-1dNTP Mixture均購自TaKaRa公司，5×Reaction buffer購自Promega公司，核酸 Marker、2×TaqPCR Master Mix購自Biomed公司，蛋白Marker購自賽默飛公司，DEPC水購自AMRESCO公司，NC膜購自Millipore公司，ECL化學發光液購自普利萊生物有限公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇購自北京化工，DMEM、RPMI1640購自Invitrogen公司，胎牛血清FBS、ploybrene購自Gibco公司，真核轉染試劑VigoFect購自威格拉斯生物技術有限公司，Anti-phospho-STAT5、Anti-phospho-JAK2、Anti-phospho-Akt、Anti-STAT5、Anti-JAK2、Anti-Akt購自Cell Signaling Technology；Anti-actin購自博奧瑞金有限公司，Anti-Flag，購自Sigma公司。

1.3 山羊地方性鼻內腫瘤病的鑒定

挑選出現流鼻涕、打噴嚏等典型臨床癥狀的山羊進行剖檢，采集鼻腔腫瘤組織，稱量30 mg腫瘤組織,利用Trizon法提取病毒總RNA，-80 ℃保存或立即反轉錄成cDNA。反轉錄體系為20 μL：總RNA 5 μg，OligodT(18)/Random Primer 1 μL，加DEPC水至10 μL，70 ℃水浴5 min；冰浴5 min，再向上述反應體系中加入以下試劑：5×Reaction buffer 4 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，10 mmol·L-1dNTP Mixture 1 μL，RTase 1 μL，RiboLock Rnase Inhibitor 0.4 μL，DEPC水1.6 μL。反應條件：25 ℃ 5 min；42 ℃ 1 h；70 ℃ 10 min；-20 ℃保存。根據NCBI收錄的ENTV-2序列設計1對特異性引物進行RT-PCR確診，上游引物ENTV-2-F：5′-CAGTCCATTCAAGCTGCTCATACTG-3′，下游引物ENTV-2-R：5′-CAATCACCGGATCCTTACTTAATCG-3′，擴增目的片段大小為828 bp。采用15 μL RT-PCR體系：2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，水5.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板1 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。RT-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。RT-PCR產物經測序分析來鑒定ENTV-2。

1.4 ENTV-2-FJ全基因組擴增及拼接

接下來分別設計6對引物進行全基因組擴增(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物信息

以“1.3”反轉錄好的cDNA為模板進行RT-PCR反應，反應體系一致，P1～P6退火溫度分別為56、60、55、56、57、56 ℃，延伸時間分別為30、90、45、90、30、90 s，其余反應條件一樣。1%瓊脂糖凝膠電泳，得到目的條帶后根據膠回收試劑盒說明書進行膠回收，將其克隆至pLB克隆載體后送北京擎科生物科技有限公司測序，應用生物信息學軟件DNAStar對序列進行拼接、基因注釋，并將得到的ENTV-2-FJ全基因組序列上傳至NCBI。

1.5 ENTV-2-FJ全基因組進化分析

下載GenBank先前報道的19株ENTV-2毒株全基因組，應用生物信息學軟件MEGA-X將它們和本研究毒株采用Kimura 2參數，Neighbour-joining鄰接法，1 000次的步長檢驗進行運算并繪制遺傳進化樹。

1.6 原核表達載體構建

由北京擎科生物有限公司合成gag基因引物，上游引物gag-F：5′-CTAGCTAGCATGGGACAAATGCATAGTCGCCAGT-3′，下劃線為NheⅠ酶切位點，下游引gag-R：5′-CCGGAATTCGTACTGTATAGGAGGCGGCAC-3′，下劃線為EcoRⅠ酶切位點。利用限制性內切酶對PCR產物片段和表達載體進行酶切，純化、回收后再用T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接，之后進行轉化試驗，挑取單克隆菌株搖菌，提質粒，用限制性內切酶對重組質粒進行電泳鑒定，并將重組質粒送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.7 多克隆抗體的制備及檢測

將構建好的重組質粒轉化至BL21(DE3)表達感受態細胞，對誘導劑IPTG濃度(0.25、0.5、0.75、1 mmol·L-1)和誘導時間(3～8 h)進行優化，收集全菌，NanoDrop 2000測其OD600 nm值，再根據OD600 nm值按比例添加1×loading buffer制備全菌蛋白樣品，進行SDS-PAGE檢測，選擇最適合條件(37 ℃、0.75 mmol·L-1IPTG、誘導8 h)進行融合蛋白可溶性檢測，然后將重組質粒誘導表達的融合蛋白利用SDS-PAGE電泳后切相應大小條帶的膠，送往北京百爾康納特實驗動物繁育生物技術開發有限公司制備兔抗gag蛋白多克隆抗體。稱量300 mg山羊腫瘤組織裂解制備成蛋白樣品，SDS-PAGE電泳后冰浴轉膜，在5%脫脂奶粉封閉2 h，制備好的血清作為一抗(1∶40 000)稀釋孵育2 h，TBST洗滌3次，HRP-IgG(羊抗兔)作為二抗(1∶2 000)，孵育2 h，TBST洗滌3次，化學發光液(AB液)反應3 min后進行曝光，記錄并分析條帶。

1.8 真核表達載體構建

由北京擎科生物有限公司合成gag基因引物，上游引物gag-F：5′-GGAAGATCTATGGGACAAATGCATAGTCGCCAGT-3′，下劃線為BgIⅡ酶切位點，下游引物gag-R：5′-CCGCTCGAGTCACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGTACTGTAT-AGGAGGCGGCAC-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點，斜體為Flag序列。如“1.5”原核表達載體方法構建pMIG-gag-Flag重組質粒載體。

1.9 穩定細胞系構建

通過制備逆轉錄病毒或慢病毒感染靶細胞的方法，將特定的序列整合到細胞的基因組中，得到可穩定遺傳的過表達細胞系。培養293T細胞至密度為80%～90%，棄掉完全培養基換成無血清無雙抗DMEM培養基，取1.5 mL EP管，分兩組，各加500 μL無血清無雙抗DMEM培養基，一組加待轉染包裝質粒(pMIG-VSVG、pMIG-pcleco)、空載質粒(Linker)、靶基因質粒(pMIG-gag)，一組加10 μL的VigoFect轉染試劑，輕輕混勻，室溫放置5 min，將質粒與轉染試劑混勻室溫放置20 min，逐滴加到293T細胞中，4～6 h后換成完全培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。48 h后收集上清液，經0.22 μm過濾器過濾后，加到離心后收集的K562細胞，避光1∶1 000 添加ploybrene，混勻后分裝至6孔板中經保鮮膜包裹封閉在32 ℃，2 200 r·min-1離心120 min。懸浮感染結束后補加1 mL完全培養基，24 h后可傳代。

1.10 裸鼠致瘤試驗

購買4～5周齡的雌性BALB/c裸鼠于SPF動物房飼養，收集K562細胞(細胞狀態良好，提前換液)，用1×PBS洗滌兩次，血球計數板計數，每管分裝1×107～2×107個細胞，用100 μL的1×PBS重懸，總體積約為200 μL。將細胞置于冰上，減少代謝，接種時再次將細胞混勻，用1 mL注射器抽取細胞，趕盡氣泡后注射小鼠。將小鼠放回籠內繼續飼養，定期觀察小鼠致瘤效果，1周后可觀察到腫瘤的出現，2～3周后，腫瘤長至一定大小后取出腫瘤塊拍照記錄。

1.11 免疫印跡試驗

收集細胞或稱量腫瘤組織并制備成蛋白樣品，制備5%濃縮膠和10%分離膠，先使用恒壓(80 V)將蛋白樣品壓縮至凝膠分界線，再使用恒壓(120 V)在分離膠中進行電泳，120 min，恒流(250 mA)，冰浴轉膜，轉膜結束后在5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗分別按以下比例稀釋：p-JAK2(1∶4 000)、p-STAT5(1∶5 000)、p-Akt(1∶5 000)、JAK2(1∶2 000)、STAT5(1∶2 000)、Akt(1∶4 000)、Flag(1∶2 000)、actin(1∶40 000)、gag(1∶40 000)孵育2 h，TBST洗滌3次，HRP-IgG(羊抗兔)、HRP-IgG(羊抗鼠)作為二抗(1∶4 000)，孵育2 h，TBST洗滌3次，化學發光液(AB液)反應3 min后進行曝光，記錄并分析條帶。

2 結 果

2.1 山羊地方性鼻內腫瘤病的鑒定

2018年7月，福州市郊某山羊場發生疑似地方性鼻內腫瘤疫病，部分病羊出現食欲減退，逐漸消瘦、流鼻涕、打噴嚏等癥狀。剖檢病羊發現鼻內單側出現增生物，顏色呈淡粉紅色，質地松軟，類似菜花樣(圖1A)。針對ENTV-2設計一對特異性引物，預期擴增片段大小為828 bp，經過RT-PCR擴增后得到預期目的條帶(圖1B)。將目的條帶切膠回收并連接到pLB克隆載體后送北京擎科生物科技有限公司測序，得到的序列在NCBI進行blast，與NCBI收錄的ENTV-2序列相似性最高達99%，在核酸水平上證實該羊場患鼻內腫瘤疾病是由ENTV-2引起的。同時還對病羊的心、肝、腎、肺、淋巴、腫瘤等組織進行RT-PCR檢測，結果顯示，只有在腫瘤組織中能檢測出病毒(圖1C)。設計6對特異性引物(圖1D)進行RT-PCR，分別擴增出相應片段(圖1E)，大小均與預期一致，切膠回收克隆至pLB載體上，測序后利用生物學軟件DNAStar將各個片段去除載體信息后進行拼接，獲得ENTV-2全基因組序列，長度為7 443 bp，命名為ENTV-2-FJ，上傳至NCBI獲得GenBank登錄號為MT598195。以上結果顯示，該羊場的鼻內腫瘤疾病是由ENTV-2引起的，作者成功克隆擴增出病毒全基因組。

A.地方性山羊鼻內腫瘤病主要臨床癥狀；B.核酸水平證實該病由ENTV-2引起(1.腫瘤組織；2.陰性對照; M.核酸marker)；C.RT-PCR檢測(1.山羊胚胎鼻甲細胞和病羊；2.心；3.肝；4.腎；5.肺；6.淋巴；7.腫瘤組織; M.核酸marker)；D.設計6對特異性引物示意圖；E.全基因組克隆擴增(P1～P6.擴增片段; M.核酸marker)

2.2 ENTV-2全基因序列分析

本研究毒株核酸序列與GenBank先前收錄的19株ENTV-2毒株全基因組相似，具有5′-U5-gag-pro-pol-env-U3-3′典型結構，包含4個開放閱讀框和側翼非編碼區以及末端重復序列，且核酸相似性在88.93%～98.71%。gag基因主要編碼核心蛋白，位于基因組的215～2 053 bp，全長為1 839 bp；pro基因位于gag和pol基因之間，編碼蛋白酶，全長870 bp，在基因組1 945～2 814區間；pol基因位于3 060～5 405 bp，全長2 346 bp，編碼逆轉錄酶和整合酶兩種蛋白；囊膜蛋白由env基因編碼，前體蛋白經水解后產生兩條肽鏈，較大的那條氨基端通過二硫鍵和氫鍵與較小的穿膜蛋白(TM)相連，暴露于囊膜之外，稱為表面蛋白(SU)，較小的那條羧基端鏈TM貫穿病毒的囊膜。env基因全長1 869 bp，位于5 281～7 149 bp。

為了進一步了解本研究的ENTV-2-FJ株與GenBank中公布的19個ENTV-2基因組序列之間的遺傳關系，用MEGA-X以Kimura 2-parameter 模型，建立NJ樹，并對拓撲圖進行了自展檢驗(bootstrap)，重復抽樣次數為1 000 次進行運算并繪制遺傳進化樹(圖2)。通過比較可知，本試驗獲得的毒株與福建省農業科學院江錦秀等[14]報道的毒株(MK559457.1)親源性較近。根據以上結果，推測該病毒可能是通過商品貿易或者人員攜帶傳入。通過解析ENTV-2全基因序列信息，對本病毒在福建省內發生的遺傳變異和之后的疫苗藥物等研發具有一定的指導意義。

該進化樹使用MEGA-X中的鄰接法構建，建樹的檢驗方法為1 000次的步長檢驗。ENTV-2-FJ毒株帶有三角形

2.3 gag蛋白的原核表達和多克隆抗體的制備

用限制性內切酶EcoRⅠ和NheⅠ對重組質粒pET-21a-gag在37 ℃條件下進行雙酶切，酶切結果正確，大小為1 839 bp左右(圖3A)。gag基因編碼613個氨基酸，軟件預測大小在70 ku左右，將酶切正確的重組質粒轉化至BL21(DE3)表達載體中，在37 ℃，0.5 mmol·L-1的IPTG條件下誘導6 h，收集全菌進行SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍染色，洗脫后結果在預期大小有目的條帶(圖3B)，說明融合蛋白His-gag誘導表達成功。保持誘導時間(6 h)和溫度(37 ℃)不變，以0.25、0.50、0.75、1.00 mmol·L-1不同濃度進行誘導以及保持誘導濃度(0.75 mmol·L-1)和溫度(37 ℃)不變，誘導3～8 h。結果表明，融合蛋白His-gag隨著IPTG濃度增加而逐漸增多，在濃度為0.75 mmol·L-1時表達量最高(圖3C)，而隨著誘導時間推移蛋白表達量并沒有明顯增高(圖3D)。在37 ℃濃度為0.75 mmol·L-1IPTG誘導8 h后，收集His-gag融合蛋白菌液，離心沉淀菌體，低溫超聲破碎，分別收集上清和沉淀并制備成蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳檢測其可溶性，結果如圖3E所示，His-gag融合蛋白主要存在沉淀中，在上清未見明顯條帶。His-gag融合蛋白進行SDS-PAGE電泳后，切膠作為抗原制備多抗血清，將制備好的血清作為一抗與地方性山羊鼻內腫瘤組織陽性樣品進行反應，出現70 ku 左右的條帶，與預期的大小相符(圖3F)。以上結果表明，作者成功制備了兔抗gag蛋白多克隆抗體。

A.pET-21a-gag重組質粒酶切鑒定(M.核酸marker; 1.重組質粒；2.酶切結果)；B.融合蛋白誘導表達結果(M.蛋白質marker; 1.空載未誘導；2.空載誘導；3.融合蛋白未誘導；4.融合蛋白誘導)；C.不同溶度誘導劑誘導表達結果(M.蛋白質marker; 1.融合蛋白未誘導；2～5.分別為終濃度0.25、0.50、0.75、1.00 mmol·L-1的IPTG誘導)；D.不同時間點誘導表達結果(M.蛋白質marker; 1.融合蛋白未誘導；2～8.分別為誘導3～8 h)；E.融 合蛋白可溶性檢測(M.蛋白質marker; 1.空載未誘導；2.空載誘導；3.融合蛋白未誘導；4.融合蛋白誘導；5.融合蛋白誘導超聲上清；6.融合 蛋白誘導超聲沉淀)；F.抗體檢測(1.山羊正常組織；2.腫瘤組織)

2.4 gag基因通過調節JAK2-STAT5通路促進腫瘤生長

為探究gag基因在腫瘤發生發展中所起的作用，首先將帶有Flag標簽的gag基因構建到pMIG-CMV載體上，利用雙酶切對重組質粒pMIG-gag-Flag進行鑒定，酶切結果正確(圖4A)。接著使用慢病毒感染方法使gag基因在K562細胞中高表達，證實轉染效率的綠色熒光蛋白(GFP)表達超過80%(圖4B)，表明轉染效率高，接著利用Flag和gag抗體作為一抗檢測gag蛋白的表達情況，如圖4C所示，與空載體轉染的細胞相比，gag蛋白能在K562細胞中大量表達。然后利用上述構建好的細胞系進行裸鼠皮下致瘤，檢測過表達gag基因是否影響K562細胞在裸鼠體內成瘤情況。將皮下的腫瘤剖解出來，發現與對照組相比過表達gag基因的K562細胞系所誘發的裸鼠皮下腫瘤體積明顯更大(圖4D)。隨后，將這些腫瘤裂解后以Flag和制備的兔抗gag抗體作為一抗進行Western blot檢測，再次檢測gag蛋白的表達量，結果表明，腫瘤裂解樣品gag蛋白仍顯著表達(圖4E)。信號轉導和轉錄激活因子5(signal transducers and activators of transcription 5，STAT5)在眾多癌癥中發揮著關鍵作用[15-16]，并由細胞因子受體下游的JAK激酶激活，STAT5蛋白的異常激活，極大地促進了腫瘤細胞的存活和疾病的惡性發展[17-18]。因此，本研究在過表達gag基因的細胞系中檢測JAK2和STAT5的磷酸化情況。研究發現，在過表達gag基因的細胞系中JAK2和STAT5磷酸化水平明顯升高(圖4F)。以上結果顯示，gag基因能夠通過調節JAK2-STAT5通路促進腫瘤生長。

A.重組質粒pMIG-gag-Flag酶切鑒定(M.核酸marker；1.重組質粒；2.酶切結果)；B.K562細胞熒光圖；C.過表達細胞系鑒定結果；D.裸鼠致瘤情況；E.腫瘤組織gag蛋白檢測結果; F.Western blot檢測結果

3 討 論

ENA病程長，前期不易發現，后期病死率可達100%，對養羊業造成巨大的經濟損失。世界上除大洋洲外，其他大洲均有ENA發生的報道，在我國也有蔓延的趨勢，目前沒有特效藥和有效的疫苗進行防控，只能通過嚴格的檢疫和隔離撲殺來降低發病率。國內對ENTV-2的研究較少，主要礙于未能找到合適的體外培養細胞系和研究體系。本研究獲得了ENTV-2-FJ全基因組序列并對其進化進行了分析，豐富了ENTV-2全基因組信息，對病毒在福建省內發生的遺傳變異和之后的疫苗藥物等研發具有重要的指導意義。有報道稱，gag蛋白是做ELISA檢測的首選蛋白[19]，作者成功制備了兔抗gag蛋白的多克隆抗體，可以為后續開發檢測試劑奠定基礎。JAK-STAT信號通路在腫瘤發生發展中扮演著重要角色，包括參與腫瘤細胞的識別和免疫逃逸等過程[20-21]，在某些癌癥中，JAK-STAT信號傳導功能的異常，有可能啟動并促進腫瘤的發生[22]。STAT5的異常表達主要與腫瘤的發生和擴散有關[23]，特別是在一些實體瘤的發生過程，由于在腫瘤微環境中炎癥因子的大量增加而造成JAK2-STAT5的過度激活[24-25]。目前，世界上仍未能成功分離ENTV-2，使得對病毒致病性研究甚少，其中又主要聚焦研究env基因，缺乏對gag基因的深入探究。本試驗研究發現gag基因能夠通過調節JAK2-STAT5信號通路促進腫瘤的生長，為今后系統研究ENTV-2感染如何激活腫瘤信號通路，從而誘導細胞癌變過程，揭示信號調控網絡的多種關鍵節點分子的功能與作用機制提供了科學依據，并為細胞癌變的干預提供潛在有價值的靶標。所以，本研究對ENTV-2的防控具有參考價值。

4 結 論

獲得了ENTV-2-FJ全基因組序列并對其進行分析，制備并驗證了gag蛋白的多克隆抗體，探討了gag蛋白的作用機制，gag基因能夠通過調節JAK2-STAT5信號通路促進腫瘤的生長。