腸道免疫相關的豬富含半胱氨酸腸蛋白2三維建模、分子特征及mRNA表達的組織分布

李美娣，趙锃玨，劉漢清，傅嘉莉，張玲華*，武 力*

(1.廣東華農高科生物藥業有限公司，廣州 510642；2.華南農業大學生命科學學院 廣東省農業生物蛋白質功能與調控重點實驗室，廣州 510642；3.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642)

富含半胱氨酸的腸蛋白(cysteine-rich intestinal protein，CRIP)是LIM(Lin-1、Isl1、Mec3)蛋白家族的一個亞家族，包含一個保守的LIM結構域以及一個富含半胱氨酸和組氨酸的基序[1]。迄今為止，CRIP2的研究主要集中在腫瘤和細胞凋亡方面[2-4]。CRIP2是CRIP家族的成員，與其他成員序列具有一定的相似性，CRIP2基因已在許多哺乳動物中被克隆，但在豬中尚缺少相關研究。與其他成員相比，它缺乏DNA結合能力，但在蛋白質的每個末端包含兩個LIM結構域[5]。在組織表達分布上也與其他成員相似，廣泛分布于心、卵巢、腦、骨骼肌、脾、前列腺、小腸、胰腺、睪丸和神經元神經節[5]。研究指出，CRIP2與腸道免疫系統重要調節劑NF-κB緊密相關，并在腫瘤發展中起著抑制劑的作用[6-7]，但CRIP2在免疫系統中的作用到目前為止尚無相關報道。

由于豬胃腸炎臨床表現和致病易感性與人相似，豬模型被廣泛應用于人類胃腸道的臨床相關模型[8]。腸道炎癥的暴發與病原菌刺激產生的有害信號通路和胃腸上皮的破壞有關[9]，腸道感染主要病原菌包括銅綠假單胞菌[10]、腸致病大腸桿菌[11]、腸毒性大腸桿菌[12]、金黃色葡萄球菌[13]、腸沙門菌[14]、衣原體[15]和糞腸球菌[16]。

盡管許多哺乳動物的CRIP2序列已被克隆，其在豬中的基因序列至今仍未被報道，poCRIP2在免疫系統特別是腸道黏膜免疫方面的功能尚不明確。本研究利用廣泛用于腸道感染機制研究的IPEC-J2細胞系探究poCRIP2在豬胃腸道炎癥中的作用[17]，識別poCRIP2基因的全長序列，并在此基礎上研究poCRIP2的有關特征，同時，對其組織表達模式進行分析，并建立有效的poCRIP2三維結構模型來解釋其功能，以了解poCRIP2在細菌感染過程中的免疫作用及其與NF-κB通路的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RNAiso plus購于TaKaRa公司；ReverTra Ace?qPCR RT Kit(Toyobo，Japan)；pMDTM18-T載體克隆試劑盒(TaKaRa,大連,中國)；IPEC-J2，大腸桿菌MG1655、產腸毒素大腸桿菌196(ETEC196)、金黃色葡萄球菌29213(S.aureus29213)和銅綠假單胞菌PAO1(P.aeruginosaPAO1)，本實驗室鑒定保存。

1.2 樣品采集

對3頭4日齡長白豬仔豬進行屠宰取樣，將心、腦、肝、脾、肺、腎、氣管、小腸、胃、背最長肌、腦、附睪共12個組織樣品快速液氮冷凍提取RNA。按照華南農業大學動物倫理委員會(IAEC)批準的方案(SCAU-AEC-2010-0416)，在受控環境中飼養仔豬。所有研究均經廣東省科技廳批準。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

根據RNAiso plus說明書，用TRIzol法提取總RNA(Li and Trick，2005)，測量OD260 nm和OD280 nm吸光度，確定提取RNA的濃度和純度。使用ReverTra Ace?qPCR RT Kit(Toyobo，Japan)制備豬組織的cDNA第一鏈：將總RNA在65 ℃下預熱5 min，然后在冰上加入2 μL 5×RT緩沖液、0.5 μL RT酶混合液、0.5 μL Primer混合液和無核酸酶水，總體積為10 μL。反應體系在37 ℃下孵育30 min，在98 ℃下加熱5 min，-80 ℃保存備用。

1.4 poCRIP2基因的RT-PCR擴增

本研究采用電子克隆方法獲得poCRIP2的全長序列。首先，在GenBank中搜索豬表達序列標簽(EST)序列數據庫，得到3個與人或家鼠CRIP2基因高度同源的EST片段(GenBank注冊號：DT324610.1、BP144826.1和CN156214.1)。然后在CExpress程序中，將所有EST序列拼接，得到推定的全長poCRIP2。然后利用Primer Premier6軟件設計了一對引物，用于克隆poCRIP2的全長序列。利用引物進行RT-PCR克隆，從豬心cDNA文庫中分離出poCRIP2全長序列。反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法采用KOD FX DNA聚合酶(TOYOBO, Osaka, Japan)。反應體系包含：2.5 μL cDNA、10 μL 2x PCR緩沖液的KOD FX、0.4 mmol·L-1dNTP、0.3 μmol·L-1的各引物和0.5 U KOD FX。PCR程序如下：94 ℃下初始變性2 min，隨后98 ℃下10 s、65 ℃下30 s、68 ℃下1 min 20 s進行40個循環，最后68 ℃下延伸10 min。隨后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用TaqDNA聚合酶為PCR產物添加dATP尾，將DNA片段克隆到pMD-18T載體上，由Invitrogen公司測序。

1.5 poCRIP2組織表達分析

本研究檢測CRIP2基因在豬體內的組織分布，利用Primer Premier5.0和NCBI Primer BLAST程序設計了特異性引物對，參考現有計算方法[18]，采用管家基因β-肌動蛋白(β-actin)對結果進行歸一化處理，其引物見表1。用商業試劑盒(Toyobo，Japan)進行基因表達分析，其程序為為：95 ℃初始變性3 min，95 ℃變性、退火、延伸45個循環15 s，60 ℃ 延伸1 min，在Bio-Rad CFX96系統(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)中進行反應，poCRIP2在不同組織中的表示為2-ΔΔCt。將poCRIP2的Ct值歸一化為β-肌動蛋白(β-actin)，得到ΔCt值，并將肝的ΔCt設為對照組。所有試驗均設置了3個重復。

表1 本研究中使用到的引物

1.6 生物信息學分析與系統樹構建

采用表2所列的各種生物信息學方法對poCRIP2的特性進行分析。用于多序列比對和系統發育樹構建的poCRIP2蛋白如表3所示。

表2 生物信息學分析軟件

表3 本研究使用的其他物種的CRIP2氨基酸序列

1.7 poCRIP2的結構建模

利用ROBETTA服務器(Protein Homology/Analogy Recognition Engine)(http://www.robetta.org)，以與推導poCRIP2序列高度同源的小鼠LIM-homeodomain protein islet 1(Isl1)(PDB：4 JCJ)為模板，進行poCRIP2的三維結構模擬。用PROCHECK(http://services.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)和ProSA(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)對模型進行了分析。應用Procheck對蛋白質折疊進行立體化學和拓撲分析，并應用ProSA對蛋白質折疊進行評價。并使用PyMOL程序(www.pymol.org)對建模結果進行評估，該程序也同時用于分析poCRIP2的保守結構域。

1.8 微生物與IPEC-J2培養

用多種細菌(表4)體外感染IPEC-J2，包括大腸桿菌MG1655、產腸毒素大腸桿菌196(ETEC196)、金黃色葡萄球菌29213(S.aureus29213)和銅綠假單胞菌PAO1(P.aeruginosaPAO1)，以上主要生長在Luria-Bertani(LB)培養基中，而糞腸球菌FA2-2(E.faecalisFA2-2)主要生長在AC培養基中。感染前，所有細菌使用新鮮磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)沖洗3次以去除培養基，并在DMEM/F12中調節密度至1×108CFU·mL-1。

表4 本試驗使用到的菌株

本實驗室培養的IPEC-J2細胞為豬腸道上皮細胞系，對其進行感染實驗，細胞生長在Dulbecco’s MEM營養液混合液F12(DMEM-F12)(1∶1)和10%(v/v)FCS中，37 ℃，5% CO2條件下進行培養。在感染前，先用0.25%胰蛋白酶-EDTA的胰蛋白酶消化重懸所有細胞，然后接種到 24孔板，每孔2×105個細胞，無抗生素。

1.9 IPEC-J2感染

在感染試驗中，使用各類菌株或新鮮PBS(對照)按固定的感染倍數(MOI，multiplicity of infection，細菌與細胞的比例)處理24孔板培養的IPEC-J2。所有用于感染試驗的菌株在攻毒時均設定為20 MOI。24孔板中的IPEC-J2均用相同體積的細菌或PBS處理6 h。最后，按前述方法提取各組總RNA。用公式2-ΔΔCt測定目的基因(poCRIP2、NF-κB、IL-6)和β-肌動蛋白(β-actin)的表達，ΔCt代表試驗組與PBS組的差異。每個試驗均包含3個重復組。

1.10 統計分析

RT-qPCR的所有數據均展示為3個獨立試驗的平均值，并使用Origin 8軟件進行數據統計分析。通過單向方差分析(ANOVA)或t檢驗確定試驗組與對照組之間的差異。當P<0.05時，差異被認為具有統計學顯著性；此外，P<0.01則被認為具有高度顯著性。

2 結 果

2.1 poCRIP2基因的克隆與特征分析

為了獲得poCRIP2基因全長cDNA序列，利用人(NM_001270837.1)、家鼠(NM_024223.2)和挪威大鼠(NM_022501.1)等其他物種的cDNA序列對NCBI網站EST數據庫進行了匹配。獲得了3個豬 EST序列(DT324610.1、BP144826.1和CN156214.1)。根據EST序列，克隆了poCRIP2的全長DNA片段，并進行了1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。利用KOD FX DNA聚合酶和商用試劑盒將該DNA片段與pMD-18T載體連接。然后對重組質粒pMD-18T-CRIP2進行測序，得到了 poCRIP2的cDNA序列，長度為1 118 bp，已提交至GenBank，注冊號為KU933587。通過ORF Finder軟件分析，poCRIP2的開放閱讀框長627 bp，A+T=36.20%，C+G=63.80%。翻譯起始位點(ATG)位于36 bp處，TAG停止密碼子位于639 bp處。

1.DNA相對分子質量標準DL2000；2.poCRIP2基因擴增產物

通過Bio Edit軟件預測poCRIP2的蛋白序列，可見與其他物種的CRIP2蛋白具有相同的長度，均為208個氨基酸。預測結果顯示(圖2)，poCRIP2由31個強堿性(+)氨基酸、20個強酸性(-)氨基酸、47個疏水氨基酸和53個極性氨基酸組成。利用ProtParam服務器對poCRIP2的等電點和分子量進行了計算，計算結果分別為9.02和22 629.88 u。由Lasergene 9.0軟件分析得，在pH為7.0時，poCRIP2的電荷量為11.986。ProtParam software服務器預測結果顯示，以水為參比，poCRIP2在280 nm處的消光系數約為25 285 M-1·cm-1。在消除所有Cys殘基后，消光系數約減少到24 105 M-1·cm-1。根據Prot Param服務器提供的結果，可以預測poCRIP2為穩定蛋白，脂肪族氨基酸指數為47.36，親水性均值(GRAVY)為-0.670，表明POCRIP2可能是一種親水蛋白。

A.poCRIP2肽鏈上的氨基酸組成和磷酸化位點。黃色字母代表強堿性(+)氨基酸，綠色字母代表強酸性(-)氨基酸，藍色字母代表疏水性氨基酸，粉色字母代表極性氨基酸，帶星號的字母代表可能的磷酸化位點。B.poCRIP2中包含的保守域。兩個保守域，LIM-TLP和LIM-CRP，在序列中用黃色標出。而保守域中的Zn結合位點也在序列中以紅色字母標出

2.2 poCRIP2基因的序列同源性及系統發育關系

利用poCRIP2的氨基酸序列與NCBI蛋白數據進行匹配，并在其他物種中找到幾個類似的序列。通過ClustalW軟件分析和DNAMAN7[21]軟件進行可視化，可見poCRIP2與人、小鼠、大鼠、牛、斑馬魚等其他物種的氨基酸序列基本一致。由圖3A可知，poCRIP2與以下物種的特征相似性較高：斑馬魚73.79%，大鼠98.08%，人94.23%，小鼠93.75%。由于poCRIP2與其它物種之間的氨基酸序列差異有限，poCRIP2在豬中也具有類似的生理生化功能。

為了弄清poCRIP2蛋白與其他物種CRIP2蛋白之間的進化關系，利用MEGA 7.0軟件，基于NJ法，以1 000個引導重復的方式建立系統發育樹。和斑馬魚相比，豬、人和小鼠隸屬于同一祖先(圖3B)。而豬和牛的CRIP2具有高度的相似性，并從一個分支上分離出來。幾乎在同一階段，人和類人猿也發生了分支并且也具有高度相似性。因此，本研究建立的進化樹可以代表真實的生物進化。

A.黑色字母代表100%的相似度，粉色字母代表75%以上的相似度，藍色字母代表50%以上的相似度，黃色字母代表33%以上的相似度；B.系統發育樹

2.3 poCRIP2的結構與功能注釋

分別用TMHMM[22]和Signal4.0服務器[23]對poCRIP2的跨膜域和信號肽進行預測。結果表明，poCRIP2可能不含跨膜區和信號肽，提示poCRIP2可能是一種胞內蛋白。iLoc-Animal服務器[24]的亞細胞定位預測結果表明，poCRIP2可能位于胞漿。因此，poCRIP2可能主要控制細胞漿內的信號通路，這與Wei等[25]報道的小鼠CRIP2的結果相似。

利用NCBI網站上的保守域服務器對poCRIP2的保守域進行掃描，結果如圖2B所示。poCRIP2有兩個LIM鋅結合域，即LIM-TLP域和LIM-CRP域，這兩個域與鋅原子配位結合。這兩個結構域具有高度相似的結構，因為它們包含保守的鋅結合殘基C-X2-C-X17-H-X2-C-X2-C-X2-C-X17-C-X3-C，該結構域同樣存在于如牛、人、大鼠、小鼠、斑馬魚等物種的CRIP2蛋白中(如圖3A)。LIM結構域在器官或腫瘤發育中被廣泛研究的同時，其在免疫調節中的作用也逐漸受到關注。

2.4 三維結構建模

將poCRIP2的氨基酸序列上傳到ROBETTA[26]服務器，預測其三維結構模型。采用多個度量對模型進行分析(圖4A、B)，驗證poCRIP2模型的可靠性。Ramachandran圖(圖5A)由PROCHECK服務器繪制。結果表明,100 %的殘基位于允許的區域內，而在較大的允許區域內僅包含0.4 %的殘基。隨后通過ProSA-web檢查了模型結果(圖5B)，在Z-score圖中顯示了一個完美有序的結構，Z-score為-4.37，在常見類似大小蛋白的有效范圍內。此外，還在ProSA-web中繪制了殘基分數圖，結果表明(圖5B)，模型中的殘基對于poCRIP2的天然結構可能在很大程度上是陰性的，不影響 poCRIP2的活性分析。因此，本研究預測的poCRIP2三維結構是可靠的。

poCRIP2的二級結構(圖6)由SOPMA服務器完成[27]，結果顯示，poCRIP2包含5.77 %的α螺旋，主要位于N末端，有23.08%的延伸鏈(β折疊)，幾乎遍布所有骨架。同時還分布有12.02 % β轉角和59.13 %的無規卷曲，結果與圖4A和4B所示的三維結構相似，紅色表示的β折疊和無規卷曲是poCRIP2的主要成分，α螺旋主要存在于N末端。利用保守結構域的三維結構模型，不難發現β折疊是蛋白結構的重要部分，分布在該結構域兩側的α螺旋也可能在蛋白功能中發揮重要作用。在圖4C和4D中顯示了LIM-TLP和LIM-CRP中的鋅離子結合位點，每4個鋅離子結合位點可以捕獲1個 鋅離子，兩種結構域分別可以得到兩個鋅離子。盡管結合位點主要位于無規卷曲中，但也需要由β折疊和α螺旋構建的構象。因此，poCRIP2中包含的功能性結構域大部分通過β折疊和α-螺旋結構實現。

在模型中，鋅離子用白色小球表示，鋅離子的結合位點在模型中也用黃色或綠色標識。A.poCRIP2的骨架結構；B.poCRIP2的表面結構展示，藍色區域代表LIM-TLP域，紅色區域代表LIM-CRP域；C.poCRIP2蛋白中LIM-TLP保守域的三維結構模型；D.poCRIP2蛋白中LIM-CRP保守域的三維結構模型

A.Ramachandran圖由PROCHECK軟件繪制。在左側，它顯示了該圖的概要。在預測模型中，幾乎所有殘基都在允許的區域內，并且該模型只有0.14%的殘基具有一般評分。B.ProSA-Web模型結果評估。在左圖中，通過ProSA-Web進行poCRIP2的Z評分，結果表明預測的模型可以識別為天然蛋白質結構。右圖殘基得分圖也在ProSA-Web中完成，結果顯示，在模型中可以找到合適的結構

圖6 使用SOPM服務器自優化預測方法預測的poCRIP2的二級結構

2.5 poCRIP2 mRNA表達的組織分布

以往對人或小鼠的研究表明，CRIP2在附睪、卵巢、腦、脾、小腸、心、睪丸等組織中表達較高。本研究以豬為研究對象，采用RT-qPCR法分析了豬CRIP2的組織分布，使用管家基因β-actin對RNA樣品進行歸一分析，以肝的Ct為對照，結果如圖7，可見poCRIP2在所有組織樣本中均有表達，其中在附睪、肝、腎、皮膚、心和氣管中有較高的表達，其在氣管中的表達水平是肝、腎、腦和附睪的10倍。但在小腸、胃、肺、肌肉和脾中表達較低。這說明，除脾外，poCRIP2的組織分布與人相似。

2.6 poCRIP2蛋白在腸道感染中的作用

本研究以IPEC-J2作為腸道免疫模型，研究poCRIP2與細菌感染的關系(圖8)。由圖7可知，poCRIP2在腸道中表達水平較低。用革蘭陰性菌(MG1655，ETEC 196和PAO1)處理時，poCRIP2表達水平是PBS對照組的1～2倍，差異顯著(P<0.05，圖8A)，結果無法揭示共生細菌和致病細菌之間的差異。當用革蘭陽性細菌處理細胞時，與金黃色葡萄球菌29213和糞腸球菌FA 2-2共孵育的組中的表達水平與PBS對照組相比沒有顯著差異，這說明在革蘭陽性細菌組中，共生細菌或致病細菌之間也沒有差異，但表明poCRIP2可能參與了腸道中的革蘭陰性細菌感染。

圖7 poCRIP2基因的組織表達

由于NF-κB/p65亞基主要參與腸道炎癥，故本研究也對NF-κB的表達水平進行了研究。如圖8B，在革蘭陰性菌(MG1655、ETEC196和PAO1)刺激的細胞中NF-κB的表達水平比對照組高約3～4倍，差異顯著(P<0.01)。使用革蘭陽性細菌糞腸桿菌FA2-2處理后，細胞NF-κB的表達水平也顯著升高。IL-6表達水平檢測結果表明，無論革蘭陰性菌還是革蘭陽性菌，用致病菌(ETEC、FA2-2和PAO1)處理的細胞中IL-6的表達水平全部一定程度地升高，進一步驗證了NF-κB通路在細菌感染過程中被激活。NF-κB結果表明，在革蘭陰性菌組中，poCRIP2表達較高，同時存在NF-κB的激活；然而對于革蘭陽性菌組，NF-κB激活的同時poCRIP2并無顯著變化。推測，poCRIP2可能與NF-κB通路無關，在腸道感染中起著新的作用。

*、**表示組間的顯著性差異，* P<0.05，** P<0.01；A.在攻毒試驗中poCRIP2的表達水平；B.在攻毒試驗中NF-κB和IL-6的表達水平

3 討 論

腸道環境中存在著數千種細菌、共生細菌或致病菌，腸道免疫功能復雜。胃腸炎是人和豬的一種常見疾病。它多數由致病菌刺激的損傷性信號通路引起。由于細菌種類的多樣性，很難找到解釋腸道感染或腸道炎癥的共同機制。由于豬模型最近被廣泛用作人類臨床相關模型，研究豬腸道的感染機制對人類具有重大參考價值。

富含半胱氨酸蛋白2(CRIP2)是LIM結構域蛋白家族的CRIP型亞家族。幾乎所有的CRIPs蛋白在生物體的生理功能和疾病發展中都具有多種功能。但迄今為止，CRIPs家族在豬、馬、羊等家畜中仍未被克隆。養豬業是重要的經濟產業，同時，豬也是重要的人類臨床模型。因此，本研究以獲得poCRIP2的編碼序列為目的，采用電子克隆方法，得到poCRIP2的全長序列。通過結構分析，poCRIP2編碼了208個氨基酸，同時分析了等電點、分子量、氨基酸組成、保守區和信號肽等理化性質。poCRIP2的理化性質與人類相似。在此基礎上，本試驗還研究了poCRIP2的組織分布，其在皮膚、心、肝和氣管中高度表達，而在其他組織，如肌肉、肺、小腸和脾中表達程度較低，結果與人和小鼠的趨勢相似，因此，豬的poCRIP2可以很好地代表人CRIP2的作用。

本研究首次對poCRIP2的三維結構進行了分析。利用ROBETTA服務器，構建了poCRIP2的三維結構，并通過PROCHECH和Pro SA驗證了該結構的有效性。在SOPMA服務器上，poCRIP2的三維結構也與poCRIP2的第二級結構接近。通過Phymol程序處理，分析了poCRIP2的保守區：LIM-TLP和LIM-CRP。LIM-TLP結構域和LIM-CRP結構域具有相似的氨基酸序列。令人驚訝的是，LIM-TLP結構域和LIM-CRP結構域的三維結構也非常相似，并且主要位于α-螺旋周圍。而保守域中的重要位點，即鋅離子結合位點，也建立在β折疊和α螺旋上。因此，poCRIP2中的功能結構主要由β折疊和α-螺旋結構實現。

本研究是首份關于CRIP2免疫功能的報導，到目前為止，關于CRIP2的研究主要針對腫瘤[28]，尚未有關于免疫的報道。已證明CRIP1在免疫中起重要作用，但該報道主要在魚類而不是哺乳動物中進行。同時，CIRP2與NF-κB密切相關[3]。因此，本研究在克隆了poCRIP2的序列后，對poCRIP2在腸道免疫中的作用進行了深入研究，使用了腸道免疫的通用模型——IPEC-J2細胞系作為研究材料[29]。本研究發現，首先，當IPEC-J2細胞被正常細菌(大腸桿菌MG1655)感染時，poCRIP2高度表達，但其表達水平與其他細菌組沒有顯著差異，例如金黃色葡萄球菌ATCC29213。其次，poCRIP2在IPEC-J2中能被革蘭陰性菌顯著上調，但不能被革蘭陽性菌上調，這是迄今為止的一個重要發現，由于poCRIP2在腸道中的表達水平很低，但能被革蘭陰性菌顯著上調，且與魚類CRIP1相似，也能被革蘭陽性菌調控，推測poCRIP2是以一種新的機制參與腸道免疫。

由于NF-κB/p65亞基主要參與炎癥反應，通常由LPS或LTA誘導，因此，腸感染期間NF-κB途徑的激活也是可預期的[30]。人CRIP2是NF-κB通路的阻遏劑[5]，本研究發現，poCRIP2高度表達時，NF-κB通路也是在同一組中被激活(被革蘭陰性細菌攻擊)，這表明，poCRIP2通過非NF-κB依賴的其他途徑參與了腸道的免疫。

綜上所述，本研究成功獲得了豬CRIP2基因的全長序列，poCRIP2的組織表達模式表明，poCRIP2與人CRIP2相似。同時，本研究建立了可靠的三維結構模型，并且基于該模型，推測poCRIP2中包含的功能主要由β折疊和α-螺旋結構實現。本研究首次報道了CRIP2在免疫方面的功能，更為重要的是，研究發現革蘭陰性菌感染腸道后，poCRIP2能被顯著上調。因此，poCRIP2應不依賴于NF-κB通路，在腸道免疫中起其他作用。到目前為止，關于CRIP在腸道免疫中的作用的信息還很少，因此，本研究不僅將揭開poCRIP2免疫調節功能的面紗，而且還將為增強人類腸道免疫健康提供新的切入點。

4 結 論

本研究識別了從豬心獲得的poCRIP2 cDNA基因的全長序列為1 118 bp，poCRIP2蛋白與人和小鼠的同源性分別為94.23%和93.75%，它還含有兩個保守區(LIM-TLP和LIM-CRP)。組織表達模式研究表明，poCRIP2與人CRIP2相似，在所有組織中均有表達，但在小腸、肺、肌肉等組織中表達較低；根據建立的三維結構模型，推測poCRIP2中包含的功能主要由β折疊和α-螺旋結構實現，且革蘭陰性菌感染腸道后poCRIP2能被顯著上調，poCRIP2應不依賴于NF-κB通路，在腸道免疫中起其他作用。