維生素K3對14日齡北京鴨凝血時間和維生素K依賴蛋白的影響

申仲健，郝永勝，吳永保，張 博，唐 靜，侯水生，謝 明

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 動物營養學國家重點實驗室，北京 100193)

維生素K是動物體生命活動不可缺少的一種脂溶性維生素[1-2]，畜牧業中常用維生素K3作為畜禽維生素K補充劑[3]。維生素K具有多種生理功能，如參與凝血過程[4]、維持骨代謝穩態[5]、抑制血管鈣化[6]等，其中，凝血作用是維生素K最經典也是最基本的生理作用。臨床研究上常用凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)和凝血酶時間(thrombin time，TT)的長短診斷是否存在凝血功能障礙[7]，當機體缺乏維生素K時，部分凝血酶原無法活化將導致PT延長[8]。維生素K主要通過參與羧化維生素K依賴蛋白發揮生理作用，此過程中維生素K作為γ-谷氨酸羧化酶的輔助因子將維生素K依賴蛋白的特定谷氨酸殘基轉化為羧基谷氨酸殘基[9]。目前，已發現多種維生素K依賴蛋白，如與凝血功能相關的凝血酶原前體蛋白(protein induced in the vitamin K absence or antagonism-factor II，PIVKA-II)[4]、與骨代謝中成骨細胞活性相關的骨鈣素(osteocalcin，OC)[10]、與血管鈣化及軟骨發育相關的基質Gla蛋白(matrix gamma-carboxyglutamate protein，MGP)[11]，三種維生素K依賴蛋白在血液循環中的羧化不全形式常被用來評價機體凝血功能[12]、預測骨折[13]和血管鈣化[14]風險，同樣也可以作為評價維生素K營養狀況的參照指標。美國NRC(1994)家禽營養需要標準和中國肉鴨飼養標準(2012)中推薦不同生長階段北京鴨維生素K營養需要量分別為0.5和2.0 mg·kg-1，但目前尚未發現肉鴨維生素K試驗研究作為理論支撐。同時，家禽飼糧中維生素K3實際添加量往往是美國NRC(1994)推薦量的數倍[15]。因此，本試驗通過研究不同添加水平維生素K3對14日齡北京鴨凝血時間和維生素K依賴蛋白的影響，探討血液中反映肉鴨維生素K營養狀況的敏感指標，并采用折線模型估算育雛期北京鴨飼糧維生素K3適宜添加量，為肉鴨飼料配制中維生素K的合理有效使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼糧

試驗采用玉米-大豆分離蛋白型飼糧為基礎飼糧，飼料原料常規營養成分參考中國飼料成分及營養價值表(2018)，基礎飼糧營養水平參考中國肉鴨飼養標準(2012)，飼糧組成及營養水平見表1。試驗采用單因子完全隨機試驗設計，通過在基礎飼糧中添加6個不同水平的亞硫酸氫鈉甲萘醌(0、0.98、1.96、3.92、5.88和7.84 mg·kg-1，甲萘醌含量為51%)配制成6種維生素K3添加水平(0、0.5、1、2、3和4 mg·kg-1)的試驗飼糧。將180只1日齡健康雄性北京鴨按照每處理每重復鴨只初始體重基本一致的原則隨機分為6個處理，每個處理5個重復，每重復6只鴨，試驗期為14 d。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.2 飼養管理

試驗鴨網上平養，自由飲水，自由采食相應的試驗飼糧，24 h光照，育雛期舍內溫度從1日齡32 ℃逐漸降低至14日齡26 ℃，每隔兩天通過調整供暖設備溫度和通風量的方式下調舍內溫度1 ℃左右。

1.3 生長性能測定

于14日齡，稱取各處理組各重復鴨只空腹體重和剩余飼料重，計算1～14日齡鴨平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F/G)。

1.4 凝血時間測定

于14日齡，從每處理每重復隨機挑選試驗鴨2只，使用無抗凝劑真空采血管頸靜脈采血5 mL，立即精確吸取全血2.7 mL置于裝有0.3 mL枸櫞酸鈉溶液的離心管中，3 500 r·min-1離心15 min，分離血漿，-80 ℃保存，并使用上海太陽UP1500全自動凝血分析儀測定PT、APTT和TT。

1.5 血清維生素K依賴蛋白測定

采血管中剩余血液制備血清，于-20 ℃保存，用于測定血清PIVKA-II、羧化不全骨鈣素(undercarboxylated osteocalcin，ucOC)和羧化不全基質Gla蛋白(undercarboxylated matrix Gla protein，ucMGP)含量，三種血清維生素K依賴蛋白含量均采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定，使用BiotekEpoch酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，并根據吸光度和標準曲線計算血清中維生素K依賴蛋白含量。分別采用上海酶聯公司生產的PIVKA-II、ucOC試劑盒和江蘇酶免公司生產的ucMGP試劑盒進行指標測定。

1.6 統計分析

試驗數據用“平均值±標準差”表示，使用SAS 9.4軟件進行統計分析，按照單因子完全隨機試驗設計應用GLM程序進行方差分析，運用Duncan氏法進行組間的多重比較，并且采用折線模型擬合曲線從而預測維生素K3需要量。

2 結 果

2.1 不同維生素K3添加水平對1～14日齡北京鴨生長性能的影響

如表2所示，各處理組之間ADG、ADFI和F/G均無顯著差異，因此飼糧中添加不同水平維生素K3對1～14日齡北京鴨ADG、ADFI和F/G均未產生顯著影響(P>0.05)。

表2 不同維生素K3添加水平對1～14日齡北京鴨生長性能的影響

2.2 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨凝血時間的影響

如表3所示，0和0.5 mg·kg-1維生素K3添加組PT顯著高于2、3、4 mg·kg-1維生素K3添加組(P<0.05)；不同維生素K3添加水平對APTT和TT均未產生顯著影響(P>0.05)。

表3 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨凝血時間的影響

2.3 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨血清維生素K依賴蛋白的影響

如表4所示，0 mg·kg-1維生素K3添加組血清PIVKA-II含量顯著高于其他組(P<0.05)；0 mg·kg-1維生素K3添加組血清ucOC含量顯著高于2、3、4 mg·kg-1維生素K3添加組(P<0.05)；不同維生素K3添加水平對血清ucMGP含量未產生顯著影響(P>0.05)。

表4 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨血清維生素K依賴蛋白的影響

2.4 1～14日齡北京鴨維生素K3需要量估算

如表5所示，采用折線模型估算1～14日齡北京鴨維生素K3需要量，以PT、血清PIVKA-II和ucOC含量為評價指標估算結果分別為2.00、0.56和1.27 mg·kg-1。

表5 折線模型估算1～14日齡北京鴨維生素K3需要量

3 討 論

3.1 不同維生素K3添加水平對1～14日齡北京鴨生長性能的影響

多項研究發現，飼糧中添加維生素K3對各類畜禽及魚類生長性能的影響較為有限，試驗結果基本一致。Marchetti等[3]在生長育肥豬飼糧中添加不同水平的維生素K3，與未添加維生素K3的對照組相比，添加維生素K3組生長豬ADG、ADFI、F/G均無顯著差異；Zhang等[16]研究發現，提高飼糧維生素K3添加水平對1～5周齡肉雞生長性能無顯著影響；Cheng等[17]在魚類上的研究也表明，飼糧中添加維生素K3無法顯著提高大黃魚的生長速率。目前尚無飼糧添加維生素K3對肉鴨生長性能的研究，本試驗結果顯示，在玉米-大豆分離蛋白型基礎飼糧中添加不同水平維生素K3對1～14日齡北京鴨ADG、ADFI和F/G均無顯著影響，這與上述維生素K3對不同動物生長性能無顯著影響的研究結果相符。因此，評價肉鴨維生素K營養狀況還需要從維生素K對動物生理生化方面的影響為切入點進一步深入探究。

3.2 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨凝血時間的影響

維持機體正常凝血功能是維生素K最早被發現的生理功能，維生素K因此也被稱為凝血性維生素[18]，在臨床研究上常用PT、APTT和TT作為評價凝血時間的檢測指標[7]，其中PT延長是由凝血酶原的缺乏導致的凝血時間延長，而維生素K與凝血酶原的活化有著直接的聯系，因此，PT相較于另外兩種凝血指標能夠更加準確地反映由維生素K缺乏導致的凝血時間延長的情況[8,19-20]。Ferland等[21]通過給雄性小鼠飼喂不同維生素K水平的飼糧，發現飼喂低維生素K水平飼糧組的小鼠PT較高維生素K水平組延長，但小鼠體重無顯著差異。本試驗結果顯示，隨著飼糧維生素K3添加水平的降低PT顯著延長，APTT和TT無顯著變化。這一結果表明，飼糧低維生素K3添加水平組中14日齡北京鴨由于維生素K缺乏導致PT延長，需要在基礎飼糧中添加維生素K3增強育雛期肉鴨的凝血功能。

3.3 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨血清維生素K依賴蛋白的影響

維生素K發揮其生理生化作用的方式主要是通過作為γ-谷氨酸羧化酶的輔助因子參與羧化反應使維生素K依賴蛋白活化，獲得生理活性[1]，目前已經發現的維生素K依賴蛋白主要包括PIVKA-II、骨鈣素和基質Gla蛋白[22]。PIVKA-II也被用于評價機體凝血功能和維生素K營養狀況[4, 20]，PIVKA-II經維生素K羧化為具有生物活性的凝血酶原，從而參與凝血過程。研究表明，維生素K攝入量與血清PIVKA-II水平呈高度負相關[23]，本試驗結果也顯示，飼糧添加維生素K3可顯著降低14日齡北京鴨血清PIVKA-II水平。

骨鈣素作為骨形成標志物，同時是維生素K依賴蛋白，在骨骼礦化的生理過程中發揮重要的作用[24]，骨鈣素由成骨細胞分泌后部分進入血液，當體內缺乏維生素K時，部分骨鈣素無法羧化，失去結合羥基磷灰石能力[25-26]。Vergnaud等[27]研究發現，ucOC水平伴隨著衰老會逐漸升高，并與骨折風險顯著正相關；也有研究表明，在飲食中補充維生素K，血清ucOC水平較未補充組顯著降低，增強骨形成，降低骨吸收能力[28]；ELISA法測定血清ucOC水平可預測中老年婦女髖骨骨折風險[13]。因此，血清ucOC水平也能夠方便和靈敏地評價維生素K營養狀況。本試驗結果表明，飼糧添加維生素K3可顯著降低血清ucOC含量，間接促進肉鴨骨骼發育并降低骨折風險。

基質Gla蛋白也是一種維生素K依賴蛋白，主要在軟骨細胞和血管平滑肌細胞中表達和產生[29]，羧化基質Gla蛋白通過與鈣晶體結合抑制異位礦化，在血管和軟骨中起到抑制鈣化的作用[30]，機體缺乏維生素K可能會導致患心血管疾病[11]。Cranenburg等[14]發現，患有心血管疾病或有血管鈣化傾向的患者，其循環ucMGP水平明顯較低。同樣地，Silaghi等[31]采用ELISA法測定血清ucMGP含量，發現膝關節炎患者血清ucMGP水平顯著低于非炎癥組。本試驗結果顯示，飼糧添加維生素K3對14日齡北京鴨血清ucMGP含量無顯著影響，這可能與機體維生素K缺乏程度未導致血管鈣化和軟骨異位鈣化有關，有待進一步研究。

3.4 1～14日齡北京鴨維生素K3需要量的確定

PT和PIVKA-II均能較好地反映機體的凝血功能[7]，血清ucOC水平常被用來評估骨折風險[13]。本試驗采用上述三個指標進行折線模型擬合需要量，結果顯示，以PT和血清PIVKA-II為評價指標擬合曲線的P值小于0.05，PT作為評價指標估算維生素K3需要量為2.00 mg·kg-1，在此維生素K3添加水平下肉鴨血清PIVKA-II和ucOC可維持較低水平。因此，以PT為評價指標，采用折線模型估測1～14日齡北京鴨維生素K3需要量為2.00 mg·kg-1。

4 結 論

提高飼糧維生素K3添加水平可顯著提高肉鴨凝血功能，降低PIVKA-II、ucOC等維生素K依賴蛋白水平，并且以PT為評價指標，采用折線模型估測1～14日齡北京鴨維生素K3需要量為2.00 mg·kg-1。