一起境外輸入性牛結節性皮膚病疫情

劉 存，呂桂霞，徐 鴻，黨安坤，梁 琳，陳 靜，孫圣福*，蘭鄒然*

(1.山東省動物疫病預防與控制中心，濟南 250100；2.東營市現代畜牧業發展服務中心，東營 257091；3.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

牛結節性皮膚病(lumpy skin disease, LSD)，又稱牛疙瘩皮膚病，是OIE須通報動物疫病名錄中一種牛的重要傳染病[1-2]。該病以皮膚結節病變為典型特征，發病率為3%～85%，通常死亡率為1%～5%，是嚴重威脅養牛業健康可持續發展的疾病之一[2-4]。2015年以后，我國周邊哈薩克斯坦、俄羅斯等國家LSD疫情頻繁發生，這使LSD輸入我國的風險增大[5]。2019年，我國首次確診LSD疫情，在福建、江西、廣東、安徽、浙江等省也相繼發現了LSD疫情，但我國快速、及時采取綜合防控措施，及時阻斷了LSD繼續蔓延[2, 6-7]。

2020年11月初，山東濱州及東營報告可疑LSD疫情，后經山東省動物疫病預防與控制中心、中國動物衛生與流行病學中心進行病原學診斷，最終確診該起疫情為LSD疫情。此次LSD疫情是山東省首次確診境外輸入LSD疫情。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit為Roche 產品；LSDV熒光PCR檢測試劑盒Biovet產品；核酸提取儀、熒光定量PCR儀均為Roche產品。

1.2 引物設計

參照LSDV GCPR基因序列(MN598006)，以Primer Premier5.0軟件設計引物，GCPR-F：5′-ATGAATTATACTCTTAGACAGTT-3′，GCPR-R：5′-AACAATGACATAGAGACACAATTTC-3′。

1.3 樣品采集

濱州共采集71份樣本，包括54份?？鼓?7份皮痂組織。東營共采集273份樣本，包括144份?？鼓?29份皮痂。

1.4 DNA提取

皮痂樣本使用組織勻漿機對進行勻漿。分別取 200 μL 皮痂組織勻漿液、?？鼓?，利用Roche核酸提取儀提取DNA。

1.5 熒光定量PCR方法檢測

以“1.4”所提取DNA為模板，參照牛結節性皮膚病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)熒光定量PCR檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.6 GCPR基因擴增

以“1.4”提取的DNA為模板，利用GCPR-F/R引物進行PCR擴增。將PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的DNA片段并送測序。

1.7 GCPR基因比對分析及遺傳演化分析

將測序獲得的GCPR基因序列與GenBank中下載的LSDVGCPR基因序列，利用MegAlign軟件進行核苷酸序列比對分析，并利用MEGA 6.0軟件以最大似然法構建系統發育樹，對GCPR基因的遺傳演化關系進行分析。

2 結 果

2.1 發病牛臨床癥狀

流行病學調查顯示，濱州、東營兩市購買的牛均為由智利引進的種用牛。該批牛2020年8月底由連云港入境，按要求隔離45 d后進行入境檢疫，檢疫合格牛取得合格證明。濱州市業主共購入奶牛、肉牛75頭，于2020年10月21日運抵養殖場隔離場。在飼養約5 d后，隔離牛發病，出現精神不振、皮膚結節等臨床癥狀，之后出現死亡病例1例。11月4日，80%的牛表現出皮膚圓形結節、破傷以及皮痂(圖1)，符合皮膚性結節病的臨床癥狀，初步判定為可疑牛皮膚性結節病。2020年10月24日，東營市業主由連云港購入273頭，運輸前即發現約40頭牛出現皮膚破傷。11月4日，專家現場診斷發現該批牛整群精神萎靡、消瘦，皮膚有圓形結節、破傷以及傷口愈合形成的結痂等臨床癥狀(圖1)，無死亡病例。濱州市及東營市業主購入牛運抵隔離場后未與其他牛群混養。

黃色箭頭.局限性皮膚結節；紅色箭頭.皮膚破傷；藍色箭頭.傷口愈合后形成的結痂

2.2 實驗室診斷

檢測結果顯示，濱州采集的樣品中，15份全血及17份組織樣品呈LSDV陽性，共確診25頭牛。濱州采集的樣品中，3份全血及128份組織樣品呈LSDV陽性。

2.3 GCPR擴增

利用PCR方法成功擴增出約1 045 bp的DNA片段，符合預期大小(圖2)。測序結果顯示，所獲序列為GCPR基因序列并暫標記為CH/SDBinzhou/2020、CH/SDDongying/2020。

M.DNA 相對分子質量標準；1.CH/SDBinzhou/2020；2.CH/SDDongying/2020

2.4 GCPR基因比對分析及遺傳演化分析

GCPR基因比對分析結果顯示，CH/SDBinzhou/2020和CH/SDDongying/2020GCPR基因與2019年我國新疆地區發現的LSDVGCPR基因相似性最高。同時，發現CH/SDBinzhou/2020和CH/SDDongying/2020GCPR基因存在12個核苷酸的插入(圖3)，這一插入序列與疫苗毒株Neethling vaccine LW 1959株、Neethling-LSD vaccine-OBP株以及俄羅斯發現的疫苗樣毒株Saratov株在GCPR基因的核苷酸插入序列相同，這表明CH/SDBinzhou/2020株和CH/SDDongying/2020株GCPR基因具備疫苗樣毒株的特征。

圖3 LSDV GCPR基因核苷酸序列比對分析

系統發育分析結果顯示，CH/SDBinzhou/2020、CH/SDDongying/2020GCPR基因與我國新疆發現的LSDV毒株處同一小分支中，親緣關系較近。同時，我國LSDV毒株與Neethling vaccine LW 1959株、Neethling-LSD vaccine-OBP株以及Saratov株等共處于同一大分支中(圖4)。

三角形標記為本研究中涉及的LSDV毒株

3 討 論

牛結節性皮膚病(LSD)是牛的一種重要的經濟性傳染病，具有潛在的快速傳播特性，可造成重大經濟損失[8]。2019年，歐亞大陸LSD疫情頻發發生，疫情形勢嚴峻，俄羅斯發生26起、土耳其131起，以色列、敘利亞等國也均有LSD疫情報道[9]，而中國、印度、孟加拉國也首次發現了LSD疫情[10-12]。我國所面臨的LSD疫情形勢更加復雜，并且防控LSD疫情輸入壓力增大。

2020年11月初，山東濱州及東營報告可疑LSD疫情，經熒光定量PCR檢測最終此次疫情確診為LSD疫情。發病牛呈現典型的臨床癥狀，全身皮膚出現圓形結節、結節脫落后形成破傷及結痂等。山東本次確診的LSD疫情與種牛引進有關，是輸入型LSD疫情。該起LSD疫情已被快速處置，消除傳染源，對環境進行全面消毒，降低了此次疫情繼續傳播的風險。

LSD是由痘病毒科(Poxviridae)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)LSDV引起[13]。LSDV基因組為雙股線性DNA，變異率低，具有遺傳穩定性，而這一特性也被應用于弱毒活疫苗與也毒株的鑒定[14-17]。2017年，俄羅斯發現流行的LSDV野毒株中存在疫苗樣毒株的特征，如GCPR基因中12個核苷酸序列的插入、EEV糖蛋白基因中27個核苷酸序列的缺失[18]。將這種現象歸結于疫苗毒株和野毒株共同存在于易感動物體內時發生的重組事件[19-20]。作者成功擴增出此次疫情LSDVGCPR基因，發現其中存在12個核苷酸序列的插入，具有疫苗毒株GCPR基因的特征。此外，研究也顯示，此類重組變異LSDV毒株在體內和體外相較于經典LSDV毒株引發更嚴重的病情。此次疫情中LSDVGCPR基因的疫苗毒株樣特征，提示山東輸入LSD疫情可能與LSDV重組變異毒株有關，但需要測定病毒全基因組序列進行研究。

迄今為止，我國多個省份報導了LSD疫情，主要與邊境地區帶毒嗜血蟲媒傳播、境外輸入帶毒種畜、由蟲媒或進出人員、交通工具等引入病毒[2, 6-7]。當前，我國LSD疫情呈多點散發，而我國周邊LSD疫情形勢嚴峻，LSD輸入我國風險持續增加。依托《牛結節性皮膚病防治技術規范》，落實“早發現、早報告、早確診、早處置”動物疫情防控工作，防止LSD疫情輸入我國，阻止LSD疫情的蔓延與擴散，為我國養牛業高效綠色健康可持續發展保駕護航。

4 結 論

確診濱州市、東營市兩地疫情為牛結節性皮膚病疫情，這是山東省首次確診輸入性牛結節性皮膚病疫情。對引起疫情的牛結節性皮膚病病毒(LSDV)毒株的GCPR基因開展了比對分析和遺傳演化分析，發現其具有與疫苗毒株及疫苗樣毒株相同的插入序列，具備疫苗樣毒株的特征，同時發現引起疫情的LSDV的GCPR基因與疫苗毒株Neethling vaccine LW 1959株、Neethling-LSD vaccine-OBP株以及俄羅斯發現的疫苗樣毒株Saratov株位于同一進化分支中。