巖藻黃質的提取及其穩定性初探

丁建姿，李長青 ，姬廣磊，姚艷艷，陳曉麗，常麗榮

1.威海長青海洋科技股份有限公司（榮成 264300）；2.威海青逸未來生物技術有限公司（榮成 264300）；3.尋山集團有限公司（榮成 264300）；4.威海市漁業技術推廣站（威海 264200）

巖藻黃質（Fucoxanthin）是胡蘿卜素的含氧衍生物，是一種脂溶性色素，在藻類中含量豐富，其含量占類胡蘿卜素總產量的10%以上[1]。研究證明巖藻黃質具有抗肥胖、抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥等生理活性[2-4]。Kei等研究發現巖藻黃質及代謝產物巖藻黃質醇在小鼠體內和體外試驗中均可抑制原發性滲出性淋巴瘤細胞的生長，而對正常細胞幾乎沒有任何不良影響[5]。Woo等研究者發現巖藻黃質可以抑制肝臟的脂肪生成，增加肝臟的脂肪分解。在飼料中添加0.05%巖藻黃質可以改善肥胖小鼠的肝臟脂質狀況，并具有降血脂和降血糖的作用[6]。Hayato等[7]研究表明巖藻黃質可以減輕脂肪組織的炎癥，從而具有抗糖尿病的作用。多種功能發現使巖藻黃質在保健食品、醫藥、美容等領域具有更廣闊的應用前景。

大型褐藻中巖藻黃質的含量一般在0.1~1 mg/g，提取率低[8]。大型藻生長周期比較長、養殖成本高，且本身多糖含量高，提取純化過程困難，并不是巖藻黃質提取的最佳原料。而在海洋微藻中，巖藻黃質質量分數2~26.6 mg/g，比大型褐藻巖藻黃質濃度高1~3個數量級[9]。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）中巖藻黃質含量尤其豐富，質量分數約15 mg/g，而且三角褐指藻可以利用天然海水進行人工培養，不會競爭淡水資源，也不會占用耕地面積，是極佳的原料來源[10]。

對于巖藻黃質研究主要集中于提取、純化、穩定性及生物功能的研究[11-14]。巖藻黃質的提取主要針對大型褐藻，如海帶、羊棲菜、裙帶菜、鼠尾藻和銅藻等[15-19]。利用三角褐指藻提取巖藻黃質的研究鮮有報道。

試驗以三角褐指藻為原料，采用超聲輔助有機溶劑浸提法從三角褐指藻中提取巖藻黃質，探究提取劑種類、超聲時間、超聲溫度、料液比對巖藻黃質提取率的影響。在單因素基礎上利用響應曲面法優化提取工藝，以提取率作為評價指標，得到最優提取工藝。初步對提取的巖藻黃質進行穩定性研究，探究溫度、光照、氧化劑、抗氧化劑等因素對巖藻黃質穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三角褐指藻（威海長青海洋科技股份有限公司）；巖藻黃質標準品（CAS號3351-86-8，美國sigma公司）；無水乙醇、抗壞血酸、雙氧水（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（均為色譜純，科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

天平（FA1004，上海精密科學儀器有限公司）；真空冷凍干燥器（SCIENTZ-10N，寧波新芝科技股份有限公司）；高效液相色譜儀（LC-20AT，島津）；超聲波清洗儀（SB25-12DTD，寧波新芝科技股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 三角褐指藻巖藻黃質提取工藝

取0.05 g三角褐指藻凍干粉加入95%乙醇，料液比1∶1 000（g/mL），在30 ℃條件下超聲60 min（頻率40 kHz、超聲功率500 W），全程避光操作，過濾得到巖藻黃質提取液。

1.3.2 巖藻黃質測定方法

參照付志明[20]的高效液相色譜法檢測。

1.3.3 超聲輔助提取單因素試驗

根據1.3.1的巖藻黃質提取工藝流程，探究提取溶劑（甲醇，無水乙醇（≥99.7%），95%乙醇，90%乙醇，丙酮，乙酸乙酯和三氯甲烷），超聲溫度（20，30，40，50和60 ℃），超聲時間（0，15，30，45，60，90，120和150 min），料液比（1∶200，1∶500，1∶1 000，1∶2 000和1∶4 000（g/mL））等因素對三角褐指藻巖藻黃質提取率的影響。

鹽藻黃質提取率=C×V/m×10-6×100% （1）式中：C為巖藻黃質提取液質量濃度，mg/L；V為提取液體積，mL；m為三角褐指藻凍干粉質量，g。

1.3.4 響應面分析法優化提取工藝

為綜合考慮試驗因素的影響，在單因素試驗的基礎上，選擇超聲溫度（A）、超聲時間（B）和料液比（C）3個因素作為自變量，巖藻黃質的提取率為響應值，進行三因素三水平Box-Behnken試驗設計。三因素三水平編碼見表1，基于Box-Behnken模型設計，三因素三水平共設計17組試驗，每組試驗重復3次，取平均值。

表1 Box-Behnken設計因素水平及編碼

1.3.5 巖藻黃質的穩定性研究

試驗探究光照（避光，室內自然光和室外強光），溫度（4 ℃冰箱，25 ℃室溫，40，50，60，70和80℃），氧化劑（3%和6%雙氧水）和抗氧化劑（0.5%和1.0%抗壞血酸）對巖藻黃質穩定性的影響。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助提取

2.1.1 巖藻黃質HPLC色譜圖

圖1為巖藻黃質標準品和樣品的色譜圖，巖藻黃質標準品出峰時間為7 min，而樣品在7 min也出現相同的峰。兩者光譜特征峰曲線相同，可以判定兩者為同一物質。結果表明樣品在7 min出現的特征峰應為巖藻黃質的特征峰。

圖1 巖藻黃質標準品（a）和樣品的色譜圖（b）

2.1.2 提取溶劑對巖藻黃質提取率的影響

取0.05 g凍干藻粉，加入不同的提取試劑，料液比1∶1 000（g/mL），30 ℃下超聲提取60 min。圖2為不同試劑做提取劑時巖藻黃質提取率的結果圖，巖藻黃質為脂溶性色素，因此提取溶劑選擇有機試劑。提取效果順序由大到小依次為95%乙醇＞90%乙醇＞甲醇＞無水乙醇（≥99.7%）＞乙酸乙酯＞丙酮＞三氯甲烷?？紤]到提取率及后期巖藻黃質實際生產中對試劑的要求，試驗采用95%乙醇作為最終提取試劑。

圖2 不同提取溶劑對巖藻黃質提取率的影響

2.1.3 超聲溫度對巖藻黃質提取率的影響

取0.05 g凍干藻粉，加入95%乙醇，料液比1∶1 000（g/mL），在30，40，50和60 ℃條件下超聲60 min，全程避光操作。從圖3中可以看出，隨著超聲溫度升高，巖藻黃質提取率呈現先上升后下降趨勢，40℃時巖藻黃質提取率最高，為1.97%。結果表明，隨著溫度升高，三角褐指藻細胞壁越容易破裂，內溶物易流出，增加巖藻黃質與提取溶劑的接觸面積，從而使提取率升高。由于巖藻黃質本身極不穩定，因此隨著溫度進一步提升，巖藻黃質易分解，導致提取率降低。

圖3 超聲溫度對巖藻黃質提取率的影響

2.1.4 超聲時間對巖藻黃質提取率的影響

取0.05 g凍干藻粉，加入95%乙醇，料液比1∶1 000（g/mL），在30 ℃條件下超聲0，15，30，45，60，90，120和150 min，全程避光操作。從圖4可以看出，隨著時間延長，巖藻黃質提取率增加，在45 min時巖藻黃質提取率最高，為2.04%。時間延長可以增加巖藻黃質與提取溶劑的接觸時間，提取更佳徹底。但是隨著提取時間進一步延長，巖藻黃質提取率下降。這是由于隨著提取時間延長，提取出的巖藻黃質長時間暴露在空氣中，加速巖藻黃質的降解，且提取過程是持續加熱狀態，高溫也進一步促進巖藻黃質的降解，因此提取率降低。

圖4 超聲時間對巖藻黃質提取率的影響

2.1.5 料液比對巖藻黃質提取率的影響

取0.05 g凍干藻粉，加入95%乙醇，料液比1∶200，1∶500，1∶1 000，1∶1 500和1∶2 000（g/mL），在30 ℃下超聲60 min，全程避光操作。圖5可以看出，隨著料液比增加，巖藻黃質提取率呈現先增加后下降趨勢。料液比1∶1 000（g/mL）時提取率最高，為2.15%。這是由于隨著料液比增大，巖藻黃質在有機溶劑體系中的擴散范圍增大，兩者充分接觸，提取率增加。料液比大于1∶1 000（g/mL）時，提取率開始下降，說明增加擴散范圍所帶來提取率的提升并非沒有限度，擴散趨于平穩后，巖藻黃質提取率不再增加[21]。有機溶劑使用量增多，會造成生產成本增加。

圖5 料液比對巖藻黃質提取率的影響

2.2 響應面結果分析

2.2.1 模型及方差分析

Box-Behnken試驗設計共17組試驗，試驗的實際值和預測值結果如表2所示。將表2得到的結果進行方差分析，結果如圖3所示。該模型的F值為85.51，模型p值＜0.000 1，結果表明該模型擬合顯著[22]。失擬項F值為1.51，p值為0.341 2（p＞0.05），說明失擬項不顯著，模型是合適的[23]。模型的相關系數R2為0.991 0，說明巖藻黃質提取率的試驗值和預測值相近，模型的調整相關系數R2為0.979 7，說明巖藻黃質提取率模型能在97.97%程度上解釋試驗結果，該二次多元方程擬合度較好。綜合各參數表明運用響應曲面法得到的二次方程模型準確、合適，可用于分析關于巖藻黃質提取率的3個因素水平，并且可以預測最佳巖藻黃質提取率。

從表3可以看出：因素A、因素B一次項，二次項A2、B2、C2及相互作用AB對響應值巖藻黃質提取率的影響極顯著（p＜0.01），因素C及相互作用AC對巖藻黃質提取率的影響顯著（p＜0.05）；BC相互作用對巖藻黃質影響效果不顯著；運用Design Expert 8.0.5軟件對表2的試驗數據二次多元回歸擬合，得到以巖藻黃質提取率為響應值（Y），因素A、B、C為自變量的二次多項式回歸方程。Y=2.21-0.088A-0.091B+0.042C-0.110AB+0.051AC-0.032BC-0.39A2-0.079B2-0.27C2。Y，巖藻黃質提取率（%）。

表2 Box-Behnken設計試驗結果

表3 方差分析

2.2.2 響應曲面分析及最佳提取工藝選擇

圖6為任意2個因素之間的相互作用對巖藻黃質提取率影響的三維圖，每個因素對巖藻黃質的提取率都有一定影響。圖6中的三維圖開口均朝下，隨著每個因素數值增大，巖藻黃質提取率先達到最高值后再下降。結果表明，3個因素取值達到最優條件時，可獲得巖藻黃質最佳提取率。3個因素中超聲時間對巖藻黃質提取率影響最大，超聲溫度次之，且超聲溫度與超聲時間之間的相互作用對巖藻黃質提取率影響較大。

圖6 響應曲面分析

根據Box-Behnken設計，優化選擇最佳提取條件，得到最大巖藻黃質提取率。優化結果為超聲溫度39.77 ℃、超聲時間42.48 min、料液比1∶1 054.1（g/mL），理論上提取率為2.24%?？紤]到實際操作的可行性、方便性及節省能耗等問題，對參數條件進行優化。最佳提取條件為超聲溫度39.8 ℃、超聲時間43 min、料液比1∶1 055（g/mL），對工藝優化后參數進行試驗驗證，試驗結果表明巖藻黃提取率為2.18%，證明相應曲面分析法優化結果提取工藝參數具有穩定性和可行性。

2.3 巖藻黃質的穩定性研究

2.3.1 光照對巖藻黃質穩定性的影響

取同等體積的巖藻黃質提取液于比色管中，封住管口，分別放置在避光、室內自然光（1 500~3 000 lx）和室外強光（25 000~35 000 lx）的環境中，測定8 h內巖藻黃質含量變化。結果如圖7所示，光照對巖藻黃質含量影響很大。隨著時間延長，3種光照條件下，巖藻黃質的損失都在增加。避光條件對巖藻黃質含量影響較小，室內自然光和室外條件下可明顯看出，巖藻黃質含量呈直線下降趨勢。放置8 h時后，自然光條件下巖藻黃質損失55%左右。室外強光條件下，巖藻黃質分解迅速，4 h時測定時巖藻黃質含量為0，巖藻黃質完全分解。這主要是由于巖藻黃質中有含氧多稀結構[24]，穩定性差，光照會促進其分解，導致巖藻黃質含量下降，因此在日常保存時應避免光照。

圖7 光照對巖藻黃質穩定性的影響

2.3.2 溫度對巖藻黃質穩定性的影響

取同等體積的巖藻黃質提取液于比色管中，封住管口，分別置于4 ℃冰箱，25 ℃室溫，40，50，60，70和80 ℃水浴中，全程避光，測定24 h內巖藻黃質的含量變化。結果如圖8所示，隨著溫度升高，巖藻黃質含量逐漸降低。50 ℃以下巖藻黃質損失相對較少，放置在4 ℃冰箱下，巖藻黃質損失最少，基本沒有損失。25 ℃室溫條件下巖藻黃質損失次之，損失近12%。溫度達到60 ℃后巖藻黃質損失速率加快。60 ℃時巖藻黃質損失近60%，80 ℃放置24 h后，巖藻黃質基本完全降解。試驗結果與劉麗平[25]的研究結果一致，說明高溫下，巖藻黃質極不穩定。結果表明，高溫會破壞巖藻黃質的化學結構，造成巖藻黃質的降解，因此在日常應選擇低溫保存，損失率會降低。

圖8 溫度對巖藻黃質穩定性的影響

2.3.3 氧化劑和抗氧化劑對巖藻黃質穩定性的影響

取同等體積的巖藻黃質提取液于比色管中，封住管口，在室溫條件下（25 ℃）分別加入氧化劑（3%和6%雙氧水）和抗氧化劑（0.5%和1.0%抗壞血酸），取1組不加氧化劑和抗氧化劑的提取液作為對照，全程避光操作，測定24 h內巖藻黃質的含量變化。從圖9（a）可以看出，與對照相比，加入H2O2的試驗組巖藻黃質損失量大，而且隨著H2O2濃度增加，巖藻黃質損失量也在增加。結果表明，巖藻黃質在氧化劑存在的條件下不穩定，也表明巖藻黃質有抗氧化的作用。圖9（b）為加入抗壞血酸后巖藻黃質剩余量隨著時間的變化曲線圖，加入抗氧化劑巖藻黃質的損失量減少，并且明顯小于對照，而且添加1.0%抗壞血酸的試驗組巖藻黃質基本沒有損失。結果表明，樣品中加入適量的抗氧化劑，可以減緩巖藻黃質氧化，樣品存儲更加穩定。

圖9 氧化劑（a）和抗氧化劑（b）對巖藻黃質穩定性的影響

3 結論

三角褐指藻是一種巖藻黃質含量豐富的硅藻，通過超聲輔助法從三角褐指藻凍干粉中提取巖藻黃質。探究單因素（溶劑種類、超聲溫度、超聲時間和料液比）對巖藻黃質提取的影響。根據單因素試驗進行響應面Box-Behnken試驗設計，得出巖藻黃質提取的最優工藝，并根據實際情況適當進行調整。巖藻黃質本身性質不穩定，因此初步探究光照、溫度、氧化劑和抗氧化劑對巖藻黃質穩定性的影響。結果表明，巖藻黃質最優提取工藝為：料液比1∶1 055（藻粉∶95%乙醇，g/mL），在39.8 ℃水浴下超聲提取43 min。在此條件下，巖藻黃質提取率為2.18%。巖藻黃質在強光、高溫氧化劑存在的條件下不穩定、易分解，容易造成巖藻黃質損失，因此平時儲存時應低溫避光保存，并與氧化劑分開；在抗氧化劑存在的條件下可以降低巖藻黃質的損失，因此在存儲時可以考慮加入抗氧化劑。