菌斑微生物群落構成變化與兒童齲病相關研究進展

周慶楠， 尚佳健

首都醫科大學附屬北京口腔醫院兒童口腔科，北京（100050）

齲病是常見的兒童口腔疾病，我國兒童齲病高發，根據第四次全國口腔健康流行病學調查報告［1］，3 歲、4 歲、5 歲兒童的患齲率分別為50.8%、63.6%、71.9%，相較于第三次流調結果呈上升趨勢，患齲狀況不容樂觀。兒童齲病存在患病率高、進展快的特點，容易發展為多發齲，治療后仍有較高的復發率。細菌是齲病發生的始動因素，以變異鏈球菌為代表的產酸菌以及個別致齲菌落一直被認為是齲病的主要病因，生態菌斑學說的提出，強調了口腔微生物群落整體平衡的維系，微生物區系平衡的改變才會導致齲病發生。第二代測序技術、宏基因組學等現代分子生物學手段的應用，使得口腔微生物群落在兒童齲病發生發展過程中的具體作用機制得以探究，為齲病病因學研究和齲病的微生態防治提供了新的思路。學者們發現患齲和無齲兒童菌斑微生物群落結構存在差異，在不同患齲程度兒童的菌斑中優勢菌種類也不同，菌斑微生物群落變化與兒童齲病密切相關，本文將針對相關研究進行綜述。

1 生態菌斑學說

菌斑生物膜在齲病發生過程中起到至關重要的作用。Marsh［2］經過大量研究，提出生態菌斑學說，認為菌斑微生物區系平衡的改變導致齲病發生。微生物間、宿主與牙菌斑間的相互作用共同維持微生態的動態平衡，但當局部環境因素的改變超過了微生態的調節能力，動態平衡被打破，致齲菌的數量增多致使齲病發生。這一學說得到了眾多學者的研究支持，在正常部位通?？梢詸z測到少量的假定病原體，患齲牙面菌斑生物膜的微生物區系不同于健康牙面菌斑生物膜。Takahashi等［3］同樣認為，不同階段和部位齲損的主要齲病相關微生物群落的變化是由環境生態因素決定的。齲齒可能是由微生物群落構成變化引起的，牙菌斑微生態失衡，使得致齲菌成為優勢菌群，從而導致齲病發生。微生態學和生態菌斑學說從微生物角度探索齲病發生發展過程中的口腔微生物區系構成變化，為齲病病因學研究和齲病預防提供了新的切入點。

2 與兒童齲病相關的菌斑微生物群落變化

齲病的發生發展是動態變化過程，對不同程度齲病菌群構成差異、齲病發生過程中口腔微生物區系構成的縱向研究可以為齲病病因學提供更有價值的信息。

2.1 口腔核心微生物群

對菌斑和唾液微生物組成的高通量研究顯示，正常的人類口腔微生物區系一旦建立，可在幾個月甚至幾年內保持穩定［4］，口腔微生物區系在8～32 個月齡時具有較高的個體內相似性［5］，提示口腔微生物可能存在核心微生物群維持結構的穩定性。肖小芬等［6］通過主成分分析發現學齡前無齲、低齡兒童齲（early childhood caries，ECC）、重度低齡兒童齲（serious early childhood caries，SECC）組牙菌斑的微生物組成在系統發育上相同，總體微生物構成相似，共有的9 個優勢菌屬包括纖毛菌屬、鏈球菌屬、二氧化碳噬纖維菌屬、奈瑟菌屬、放線菌屬、韋榮菌屬等；阮文華等［7］發現變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門以及肺炎鏈球菌、乳糖奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌等在無齲和重度齲病兒童唾液微生物中均為高豐度生物類群。核心微生物群的存在為生態菌斑學說提供了證據支持，在平衡狀態下口腔微生物共同維持口腔健康，環境的改變使微生物組成變化，無齲菌斑轉化成致齲菌斑，導致齲病發生，致病菌群為機會致病菌或條件致病菌。

口腔核心微生物群的構成由于采集位置不同、樣本人群生活飲食差異、分析方式的不同等，眾多研究得到的結果不盡相同，核心微生物群的構成也會隨著齲病的發展而變化［8］。在大樣本人群中進一步驗證口腔核心微生物群的存在，探究無齲狀態下菌斑微生物組成，是齲病病因學研究和生態防治的重點。

2.2 齲病的發生伴隨著菌斑微生物群落多樣性的下降

目前國內外眾多學者應用現代分子生物學手段，對有齲和無齲兒童口腔菌斑微生物群落的差異進一步研究。黃春雅［9］等應用基因芯片雜交技術檢測牙菌斑菌屬，發現齲病組細菌的種系型少于無齲組，經過進一步的種屬差異分析，相比有齲組在進化分支圖中分屬有限的門、屬，無齲組的細菌分布更為廣泛，具有更明顯的微生物多樣性。Hurley 等［10］發現齲壞牙本質部位菌斑內微生物群落多樣性顯著低于齲病和無齲兒童唾液內微生物群落多樣性水平，在年輕恒牙中也發現隨著牙齒從健康到脫礦為白堊斑、成洞化改變和牙本質深層病變的發展，微生物群落多樣性水平顯著降低［11］。

Tian 等［12］觀察到在接受治療后的兒童齲病無復發組菌斑微生物的豐富度和多樣性高于齲病復發組，齲病復發時兩組的菌斑微生物群落結構有顯著不同。在唾液微生物區系中也觀察到ECC 在有無復發時微生物群落結構有顯著不同，微生物多樣性在ECC 復發和進展過程中呈下降趨勢［8］。

Tao 等［5］監測SECC 發生過程中口腔微生物群落動態變化，發現齲病的發生伴隨著微生物多樣性的下降，與無齲兒童相比，SECC 兒童的菌斑微生物多樣性有所下降，在齲病發生前至少6 個月檢測到微生物豐富度下降。另一研究也表明菌斑中的微生物豐富度在齲齒發生前6 個月時就已經下降，DGGE 圖譜在從無齲狀態到齲齒狀態的發展過程中觀察到了顯著的變化，初步證實了微生物豐富度的降低與齲病的發生有關［13］。

Teng 等［14］認為微生物區系的改變早于齲病癥狀的發生，最深刻的變化發生在ECC 開始時，而不是ECC 進展期間。他認為，在ECC 開始時（宿主癥狀尚未檢測到時），微生物多樣性隨著ECC 嚴重程度變化而顯著增加；但在齲病進展階段（宿主癥狀可檢測到時），微生物多樣性趨于穩定。微生物區系空間和時間上的變化可以用于菌斑相關疾病的預測建模，并成功預測了齲病的發生。

根據生態菌斑學說，長期高糖飲食致微生物大量產酸且超過唾液緩沖能力時，菌斑中對酸性環境敏感的細菌（如血鏈菌、口腔鏈球菌等）生長被抑制，而產酸耐酸菌的革蘭氏陽性菌（如變異鏈球菌和乳酸桿菌等）因競爭優勢則大量繁殖，成為牙菌斑微生物區系中的優勢菌群，維持牙菌斑的致齲性，各細菌間比例改變，菌群成分由平衡狀態向脫礦能力強傾斜，當pH 低于脫礦臨界值時，牙體硬組織脫礦，能夠在惡劣條件下生存的微生物數量不斷減少，菌斑微生物群落多樣性減少，不斷惡性循環，齲壞發生。這些研究證實了齲病微生物學的生態破壞模型，為齲病監測、針對性設計更有效的干預措施提供新的研究方向。

2.3 齲病特異性生物標記物

根據以往的報道，行為因素和微生物因素均與齲病的發展有關，從微生物角度來看，齲病是由多菌種構成的致病群落引起的，對微生物多樣性進一步分析發現，盡管有齲組、無齲組有許多共同的類群，患齲和無齲兒童的微生物群落結構、組間菌群存在統計學意義上的顯著分離，代表了不同的菌斑微生物群落。厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、梭桿菌門5 個主要優勢菌門在不同程度齲病組菌斑中都占有97%以上的序列數，且隨著年齡的改變這些種群的轉換在ECC、SECC 患者中基本上未發生有差異的改變［15］，表明包含這些菌群在內的菌斑與齲病的進展高度相關；Xu等［8］發現以普氏菌屬、奈瑟氏菌屬、威氏菌屬、鏈球菌屬等為主的11 個菌屬在有齲無齲組間顯示出不同的相對豐度；相反，細毛菌屬、羅氏菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、血液鏈球菌屬、心臟桿菌屬和TM7 屬常在無齲人群菌斑中被發現，通常含量較高，證實與無齲狀態相關［16-18］。

因此有學者認為致齲微生物組和正常微生物組在群落結構和基因功能上有顯著的鑒別特征，差異菌屬及其在內的牙菌斑微生物群落可能與兒童齲病的發生有關，可能潛在地存在一個不同的致齲群落，可以作為齲病防治的生物標記，最終可以被識別并用于齲病診斷、監測和預后。

2.3.1 鏈球菌、乳桿菌、放線菌（Streptococcus、Lactobacillus、Actinomyces） 齲齒是由菌斑生物膜群落內菌群的改變造成的，產酸菌一直被認為是齲病的病原菌，了解多種產酸菌屬在菌斑微生物群落中的分布、構成改變與齲病發生間的關系對于制定生物干預措施非常重要。

研究發現鏈球菌屬在有齲、無齲兒童牙菌斑中含量差異明顯，為齲病優勢菌屬；在白堊斑病變、開放性牙本質齲或牙釉質-牙本質齲（隱性齲）中均表現出較高的豐度，表現出與齲病的相關性［6，19］。變異鏈球菌是鏈球菌屬中的一種，被公認為是主要致齲菌之一，Agnello 等［20］發現患有SECC的原住民兒童與無齲兒童相比，菌斑微生物群落明顯不同，SECC 組菌斑中可以檢測到極高豐度的變異鏈球菌。但因人群特征以及分析手段的不同，也有學者發現齲病發生時，菌斑中的鏈球菌相對豐度下降［21］；在許多健康受試者中，變異鏈球菌的含量高于在白堊斑病變、牙本質齲壞病損中檢測到的水平［11，17］。不同程度齲病患者的菌斑中高豐度的變異鏈球菌并不總是存在［22］，其在群落中的百分比與齲病從健康到深齲的進展程度不是呈線性相關的［11］，因此有學者認為變異鏈球菌的含量水平與齲病嚴重程度并無顯著的相關性，流行病學及齲風險評估資料也顯示近幾十年以變異鏈球菌為主要對象的控齲手段收效甚微［23］。

變異鏈球菌是許多（但不是全部）齲病患者的優勢菌種，它與其他生物體相互作用，形成一種動態的、協調一致的多微生物群落，在特定狀況下形成致齲生物膜［21］，這與生態菌斑學說一致，導致齲病發生的酸可能來自幾種產酸菌中的任何一種或全部，變異鏈球菌只是作為復雜的致齲微生物群落中的一部分出現。不同類型、不同基因型的鏈球菌可能在兒童早期齲病中起重要作用，在未檢出或僅檢測到低水平變異鏈球菌的受試者中，唾液鏈球菌、戈登鏈球菌水平的升高被證實與齲病有關［9］。在以遠緣鏈球菌為主的大多數樣本中，也存在低水平的變異鏈球菌，在一名患有活動性齲齒的受試者中，隨著時間的推移，觀察到變異鏈球菌被遠緣鏈球菌所取代［24］。這些菌種與齲病的關系還有待于進一步的研究，可能這些菌種是變異鏈球菌的替代病原菌，推測其致齲機制并不是通過單純的變異鏈球菌含量升高而導致齲病，可能是與整個微生物群落結構變化相關，但目前的研究尚不足以證明。

乳桿菌是齲活躍兒童齦上菌斑中的主要微生物組成之一，與齲病進展有關［25-26］。Gross 等［11］發現菌斑中的乳桿菌和丙酸桿菌水平隨著齲病嚴重程度的增加而顯著升高，與無齲狀態相比，在齲壞牙本質部位的菌斑中，變異鏈球菌水平下降，乳桿菌水平急劇上升，乳桿菌在齲病過程的后期成為優勢菌群。乳桿菌在群落中的比例隨著齲病從牙釉質病變進展為牙本質病變而顯著升高［27］，在齲病患者健康牙面的菌斑中很少發現，齲壞早期白堊斑病變中，也幾乎沒有乳桿菌存在，證明依賴于乳桿菌的微生物篩查試驗對已發生齲病的診斷具有較高特異性［11］。Sidhu 等［27］研究發現，兒童長期攝入一定量的益生菌如雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌等，可明顯降低口內變異鏈球菌的水平，抑制口腔內致病菌的生長，從而抑制齲病的發展。變異鏈球菌與乳桿菌之間的相互作用具體機制不詳，有乳桿菌是弱粘附的，因而需要依賴變異鏈球菌和其他產酸菌來啟動齲損的觀點，也有乳桿菌具有抗菌特性，并能抑制變異鏈球菌的生長的觀點。這也在一定程度上佐證了生態菌斑學說，菌群間相互作用致使微生物群落構成發生改變，從而導致了齲病的發生發展過程。

放線菌屬作為早期定植于齦上菌斑的菌屬之一，多在無齲患者中豐度較高，往往被認為與兒童齲病呈負相關，被證實與健康有關［16-17］，在幼兒中進行的一項縱向研究也表明隨著齲病程度加重，放線菌屬豐度減少［24］。但同時也有學者發現SECC 和ECC 兒童菌斑和唾液中放線菌的豐度水平高于健康兒童［28］，人群特征以及所應用的檢測手段等因素不同可能導致不同實驗結果，現有證據只能表明放線菌屬作為兒童齲病的生物標記物敏感性有限。

2.3.2 韋榮球菌（Veillonella） 有研究顯示韋榮球菌屬在齲活躍者口腔中的相對豐度較無齲者高［29］，在無患齲史的兒童口腔中，韋榮球菌豐度較高者后來患齲率更高［30］，進一步說明韋榮球菌與兒童齲病相關。韋榮球菌被認為是口腔生物膜中的橋梁生物，可利用乳酸作為能量來源，這一特性曾被認為可抑制齲病發展進程，但并未得到充分證實［31］。它依賴于產生大量乳酸的鏈球菌，其分布水平與乳桿菌、變異鏈球菌和放線菌等產酸菌的分布存在高度相關性［32］，證據表明，韋榮球菌水平與齲損高度相關［28］，為致齲條件下菌群的優勢成員之一，可以在低pH 值環境下，誘導變異鏈球菌等優勢產酸菌代謝產酸［29］，促進變異鏈球菌的生長［31］，可作為齲病早期的預警生物標記物，預測齲病發生［29-30］。在致齲環境中，該菌屬中只有部分菌種具有競爭優勢而得以長期存活，這部分菌種對齲病的意義值得研究。目前韋榮球菌在齲病發生中的作用及相關機制尚不明確，但其高耐酸能力、在牙菌斑形成中的作用、在齲患口腔及齲壞位點的高豐度水平等特點提示其在齲病發生機制的探討中不可忽略。

2.3.3 普雷沃菌屬（Prevoella） 普雷沃菌屬是革蘭氏陰性厭氧菌，主要發酵產物包括乙酸和少量的乳酸，常被認為是牙周疾病的優勢菌屬，但有研究表明其也可能是齲病優勢菌屬［26］，在齲病活躍期牙本質微生物群落中，可以檢測到高豐度的普雷沃菌屬，提示其可能與齲病發生有關［10］。Teng等［14］發現在6～12 個月觀察期內出現齲齒的人群中，普雷沃菌屬的豐度水平顯著高于6～12 個月持續保持健康的人群，認為其具有ECC 生物標記物的潛力，可起到齲病預測模型中的關鍵標記作用；Zhu 等［33］研究表明唾液中普雷沃菌屬的相對豐度及其與梭桿菌、細毛菌等的組合對ECC 復發的預測準確性較好，具有預測潛力。作為與菌斑微生物群落相關的兩種疾病，目前齲病和牙周疾病相互影響機制尚不清楚，普雷沃菌屬在兩種疾病中的高豐度表達值得進行深入研究，以探究其作為生物標記物的優勢和潛力。

3 小 結

隨著分子生物學技術和微生物功能基因組學的發展進步，學者們得以對菌斑微生物群落中細菌的種群分布、微生物多樣性、可能的齲病生物標記物及致齲機制進行了更深入的探討，但目前口腔微生物群落在齲病發生中的作用和機制尚未闡明，仍有很大的研究空間。深入了解齲病發生過程中口腔微生態和菌斑微生物群落結構變化，將從微生物角度進一步揭示齲病病因；關注齲病發生乃至發生前微生物多樣性的變化，構建正常和齲病兒童菌斑微生物圖譜，篩選特異性的齲病生物標記物，將有助于控制與管理兒童口腔微生態，為兒童齲病監測、生態防齲和患齲風險評估，提供新的方向及治療構想。

【Author contributions】Zhou QN collected the references, and wrote the article, Shang JJ revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.