馬齒莧總黃酮改善小鼠非酒精性脂肪肝的作用

姚瑞強，宋維芳，胡鑫麗，張文慧

(山西醫科大學汾陽學院，汾陽 032200)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由除酒精以外的其他明確的損傷肝臟因素導致的，以彌漫性肝細胞脂肪變性和肝細胞內三酰甘油(triglyceride，TG)蓄積過多為顯著特征的臨床病理綜合征[1]?；瘜W藥物對NAFLD的治療作用有限，大多數降脂藥可導致肝細胞損傷[2]。因此，尋找有效治療NAFLD的藥物并研究其機制非常必要。馬齒莧是一年生肉質草本藥食同源植物[3]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、增強免疫力等多種作用[4-7]。馬齒莧含有黃酮類、生物堿類和萜類等多種化學成分[8-9]，其中黃酮類化合物具有豐富的藥理作用，在抑菌和抗腫瘤方面的研究報道較多[10]。本研究的考察重點是馬齒莧總黃酮(portulaca oleracea total flavones，POTF)對NAFLD小鼠脂質代謝、氧化應激及炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠NAFLD模型的構建及分組4～6周齡SPF級雄性昆明小鼠40只，購買并喂養于山西醫科大學動物實驗中心，體質量17～22 g，適應性喂養1周后隨機分為5組(每組8只)：對照組、NAFLD組、POTF 2.5 mg/kg組、POTF 5 mg/kg組、POTF 10 mg/kg組。對照組給予標準飼料喂養，其他4組每天給予高脂飼料喂養，同時POTF 2.5 mg/kg組、5 mg/kg組、10 mg/kg組小鼠分別以溶解于0.5 mL的2.5、5、10 mg/kg POTF灌服，對照組和NAFLD組小鼠灌服等容量0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續4周。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 在給藥第4周末使小鼠禁食水10 h，次日麻醉，剖腹分離并暴露腹主動脈，取血0.5 mL，4 ℃靜置24 h，以1 000 ×g離心10 min分離上層血清，分裝，待測或-20 ℃保存。采用脫頸椎處死法處死小鼠，立即摘取其肝臟，用濾紙吸干血液。取肝左外側葉置4%多聚甲醛中固定，待H-E染色。另取肝右外側葉1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小立即冰凍切片，自然晾干后待紅油O染色。然后，取肝臟組織約200 mg放入凍存管，置冰盒中-80 ℃保存。

1.3.2 血清生化指標和空腹血糖的測定 取上述“1.3.1”項采集的血清進行檢測。使用HITACHI 7600型全自動生化分析儀，采用連續檢測法測定丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)，采用酶法測定TG，采用己糖激酶法測定空腹血糖。

1.3.3肝損傷的H-E染色觀察 用二甲苯脫蠟組織切片，進行2次，每次10 min。依次在100%、90%、80%、70%乙醇中各浸泡3 min。用蘇木精染色2 min，1%鹽酸乙醇分化10 s，稀氨水返藍20 s，伊紅染色3 min。以上每個步驟處理后均用去離子水沖洗3次，每次各1 min。再依次經過70%、80%、90%、100%乙醇脫水，每個梯度各5 min。二甲苯透明2次，每次10 min，之后用中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

1.3.4 脂質堆積的油紅O染色觀察 用PBS洗滌切片3次，4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS洗滌3次，60%異丙醇潤洗10 s，加入0.3%油紅O染色液染色1 min，再經60%異丙醇漂洗及PBS漂洗3次，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 脂代謝標志物的Western blotting檢測 取上述“1.3.1”項儲存的組織約100 mg，采用全蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離組織中的蛋白，并轉移到PVDF膜上。用5%BSA封閉后，用一抗(CPT-1、ACC)在4 ℃孵育過夜。然后將膜與二抗在室溫下孵育45 min。最后，用ECL檢測試劑盒檢測條帶。信號通過Image Lab v 3.0軟件進行分析。

1.3.6 氧化應激相關分子的試劑盒檢測 取上述“1.3.1”項保存的血清進行檢測。采用可見分光光度法檢測SOD活性及MDA、GSH水平，根據試劑盒使用說明進行操作。

1.3.7 肝組織中IL-6和IL-10水平的ELISA檢測 采用ELISA試劑盒檢測IL-6和IL-10的水平，根據試劑盒說明書進行操作。按照組織質量(g)∶提取液體積(mL)為1∶5～1∶10的比例(建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液)進行冰浴勻漿；以8 000 ×g4 ℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。向包被微孔中依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。在所有孔中加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，最后加入終止液50 μL。使用多功能酶標儀(Multiskan Sky，Thermo Fisher公司)檢測光密度[D(450 nm)]值。

2 結果

2.1 POTF對NAFLD小鼠血清生化指標和空腹血糖的影響與對照組比較，NAFLD組的ALT、AST、TG和空腹血糖水平顯著升高(P<0.05)。與NAFLD組比較，POTF 2.5 mg/kg組、5 mg/kg組和10 mg/kg組的ALT、AST、TG和空腹血糖水平呈現劑量依賴性降低，且POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組的ALT、AST、TG和空腹血糖水平降低更顯著(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組血清生化指標和空腹血糖水平的比較

2.2 POTF對NAFLD小鼠肝損傷的影響大體上，對照組小鼠肝臟未見異常；NAFLD組肝臟體積增大，質地變硬，局部有一定的變黃和質地油膩；POTF組較NAFLD組的異常有不同程度的減輕。對照組小鼠肝組織細胞結構正常，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀分布；NAFLD組小鼠肝組織細胞中央靜脈不規則，細胞排列不均勻，結構被破壞，出現明顯的細胞壞死。與NAFLD組比較，POTF組小鼠肝組織細胞的壞死情況均得到減輕，且隨著POTF劑量的增加，減輕效果更加顯著，POTF 10 mg/kg組接近對照組。由此可見，POTF可以改善NAFLD小鼠的肝損傷。詳見圖1。

圖1 小鼠肝損傷的H-E染色(×200)

2.3 POTF對NAFLD小鼠脂質堆積的影響油紅O染色結果顯示，與對照組比較，NAFLD組小鼠肝組織細胞中有大量的紅色脂滴聚集；與NAFLD組比較，POTF組的脂滴聚集逐漸減少，且隨著POTF劑量增加效果更明顯，POTF 10 mg/kg組接近對照組。由此可見，POTF可以減緩NAFLD小鼠的脂質堆積。詳見圖2。

圖2 小鼠脂肪堆積的油紅O染色(×200)

2.4 POTF對NAFLD小鼠脂肪代謝的影響Western blotting檢測脂肪合成代謝相關指標ACC和脂肪分解代謝相關指標CPT-1的表達。結果顯示，與對照組(CPT-1 0.140±0.020，ACC 0.010±0.006)比較，NAFLD組的CPT-1的表達量(0.010±0.005)顯著下調(P<0.05)，而ACC的表達量(0.720±0.050)顯著上調(P<0.05)。與NAFLD組比較，POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組CPT-1表達量(0.090±0.030，0.180±0.035)顯著上調(P<0.05)，而ACC表達量(0.080±0.045，0.020±0.010)顯著下調(P<0.05)。這提示，POTF可以促進NAFLD小鼠的脂肪分解代謝，并抑制NAFLD小鼠的脂肪合成代謝。詳見圖3。

注：A. Western blotting檢測CPT-1和ACC蛋白的表達；B. 各組CPT-1和ACC表達量的比較。與對照組比較，*P<0.05；與NAFLD組比較，#P<0.05。圖3 Western blotting檢測ACC和CPT-1的蛋白表達水平

2.5 POTF對NAFLD小鼠SOD活性及MDA、GSH水平的影響與對照組比較，NAFLD組的SOD活性和GSH水平顯著降低(P<0.05)，而MDA水平顯著升高(P<0.05)。與NAFLD組比較，POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組SOD活性和GSH水平顯著升高(P<0.05)，而MDA水平顯著降低(P<0.05)。由此可見，POTF可以改善NAFLD小鼠的氧化應激。詳見表2。

表2 各組SOD活性及MDA、GSH水平的比較

2.6 POTF對NAFLD小鼠肝組織中IL-6和IL-10水平的影響ELISA檢測肝組織中促炎因子IL-6和抗炎因子IL-10水平。結果顯示，與對照組[IL-6(16±9)pg/mL，IL-10(29±4)pg/mL]比較，NAFLD組IL-6水平[(114±15)pg/mL]顯著升高(P<0.05)，而IL-10水平[(4±2)pg/mL]顯著降低(P<0.05)。與NAFLD組比較， POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組IL-6水平[(64±15)pg/mL，(37±11)pg/mL]顯著降低(P<0.05)，而IL-10水平[(13±6)pg/mL，(27±5)pg/mL]顯著升高(P<0.05)。由此可見，POTF可以改善NAFLD小鼠的炎癥反應。詳見圖4。

注：A. 各組IL-6水平的比較；B. 各組IL-10水平的比較。與對照組比較，*P<0.05；與NAFLD組比較，#P<0.05。圖4 ELISA測定IL-6和IL-10的水平

2.7 POTF對NAFLD小鼠肝組織中NF-κB p65表達的影響IHC檢測了與炎癥相關的NF-κB p65在肝組織中的表達情況。與對照組[(2±2)%]比較，NAFLD組NF-κB p65相對表達量[(46±4)%]顯著增加(P<0.05)；與NAFLD組比較， POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組NF-κB p65 相對表達量[(23±6)%，(14±5)%]顯著降低(P<0.05)。由此進一步證實，POTF可以通過抑制NF-κB p65的表達緩解炎癥反應。詳見圖5。

注：A. 在顯微鏡下觀察小鼠肝組織中NF-κB p65相對表達(×200)；B. 各組NF-κB p65相對表達量的比較。與對照組比較，*P<0.05；與NAFLD組比較，#P<0.05。圖5 IHC檢測小鼠肝組織中NF-κB p65的表達

3 討論

馬齒莧是藥食同源的中藥材，在不同體系中均表現出對肝損傷的治療作用[12]，其作用機制包括減輕炎癥、氧化應激、凋亡和改善脂質代謝等[13]。本研究發現，POTF可明顯改善NAFLD小鼠肝組織損傷和脂質堆積情況，POTF組ALT、AST、TG、空腹血糖、ACC、IL-6、MDA及NF-κB p65水平相較于NAFLD組顯著降低，而CPT-1水平、GSH水平、SOD活性及IL-10水平顯著升高。這提示，POTF可能通過減輕脂質代謝異常、氧化應激和炎癥反應改善高脂飲食昆明小鼠的NAFLD。

NAFLD的主要病理特征之一是以肝細胞內TG積蓄為主的代謝紊亂，且肝細胞受損。胰島素抵抗是NAFLD的重要危險因素。有研究發現，如果存在肝細胞脂肪的大量積累與系統性肝胰島素抵抗，就會致使肝臟抗脂質毒性保護和脂肪組織產生自由基之間的不平衡，進而導致炎癥反應、內質網應激、氧化應激和肝細胞凋亡等[14-16]。有研究發現，肝受損后，生化指標ALT、AST、TG水平出現異常[17]。馬齒莧可提高四氧嘧啶糖尿病小鼠血清胰島素水平，降低小鼠空腹血糖，并具有較強的調脂作用[4]。也有薈萃分析顯示，馬齒莧可能具有改善血脂和血糖水平的作用[18]。上述研究與本研究結果相一致。本研究發現，NAFLD小鼠的ALT、AST、TG和空腹血糖都異常升高，H-E和油紅O染色也證實NAFLD小鼠發生了肝組織損傷且脂質堆積嚴重。而經過一定劑量的POTF給藥后，上述癥狀得到明顯緩解，顯然POTF在NAFLD小鼠中具有降血脂和血糖的功效。本研究脂肪代謝標志物CPT-1和ACC的蛋白表達結果進一步說明，POTF可通過上調脂肪分解代謝指標CPT-1同時下調脂肪合成代謝指標ACC對脂質代謝起調控作用。

固有免疫激活相關的炎癥反應在NAFLD的誘發和加重中起重要作用[19]。來自脂肪組織的炎癥信號、腸道微生物的產物和肝炎導致的受傷或垂死載脂肝細胞信號均能激活肝臟內免疫細胞的固有免疫，誘發和加重肝炎，導致NAFLD進展。研究發現，對固有免疫和炎癥的調控機制可能是二甲雙胍等對NAFLD的作用[20]。抑制炎癥可能是阻止NAFLD惡性進展的有效手段，而馬齒莧具有典型的抗炎和免疫調節作用[21]。本研究發現，在高脂飲食的小鼠中，POTF能降低IL-6水平，增加IL-10水平，表明其抑制NAFLD可能與炎癥抑制有關。

炎癥和脂肪變性可誘導內質網應激、氧化應激、細胞凋亡和壞死等一系列惡性變化，進而導致肝纖維化和肝硬化進展[22]。這些因素往往在免疫系統作用下相互促進[23]。NAFLD自身造成的代謝綜合征以及在患者基因突變等綜合因素影響下，肝病可進一步進展甚至導致肝癌[24]。有研究發現，馬齒莧提取物對LPS誘導的大鼠肺損傷有抗炎、抗氧化作用[6]。還有研究證實，POTF可通過下調大鼠肝纖維化細胞TGF-β1基因及蛋白表達有效治療肝細胞纖維化病變，預防肝癌及肝硬化[25]。在大鼠急性酒精性脂肪肝病模型中，POTF能有效改善炎癥、氧化應激和脂質代謝，進而減輕大鼠的急性酒精性脂肪肝病[13]。本研究對氧化應激相關分子SOD、MDA和GSH的檢測結果顯示，POTF可逆轉氧化應激造成的SOD和GSH水平下降，并消除脂質過氧化產物MDA的積累。POTF也可減少NAFLD小鼠的促炎因子IL-6水平，并刺激抗炎因子IL-10高表達。這些結果均提示，POTF可明顯改善NAFLD小鼠的氧化應激和炎癥反應。用IHC進一步檢測與炎性因子合成相關的NF-κB p65在組織中的表達情況，結果顯示POTF可減輕氧化應激，下調NAFLD小鼠NF-κB p65的高表達，進而抑制肝臟損傷。

綜上所述，POTF可通過調節脂質代謝異常、緩解氧化應激和抑制炎癥反應來改善NAFLD小鼠的肝損傷。本研究為POTF作為治療NAFLD的潛在、有效的藥物提供了基礎證據。