番石榴葉中總黃酮的提取及其抗氧化活性研究

李丙添，宋鳳蘭，劉銳鋒，廖礎欣，趙偉國

(1.中山市人民醫院藥學部，廣東 中山 528403；2.廣東藥科大學中山校區，廣東 中山 528400)

對于桃金娘科番石榴樹植物中的番石榴，其干燥葉以及帶葉嫩枝就是番石榴葉，在我們華南地區多有種植，資源豐富[1]。在中醫領域中，認為番石榴味澀以及性平，具有清熱解毒、燥濕健脾的功效。而通過現代醫學的實驗發現，番石榴的抗病毒、抗瘧、止瀉、降血糖血脂等藥理作業非常顯著[2-4]。番石榴葉中的黃酮、酚類、多糖、皂苷、揮發油等功能成分含量較大，特別是黃酮類化合物和其抗菌消炎、降血糖、降血脂、抗病毒等方面有著直接關系，具有很高的研究價值[5-6]。本課題采用超聲法提取番石榴葉中的總黃酮，采用正交實驗方式對番石榴葉總黃酮的提取工藝展開優化，并對提得總黃酮的抗氧化活性進行考察，為其后續深入開發以及應用提供理論保障。

1 材料與試劑

紅心番石榴葉采自廣東省湛江市，經鑒定為桃金娘科番石榴屬番石榴葉；采用天津市大茂化學試劑廠的三氨基甲烷、焦性沒食子酸、硝酸鋁；采用上海伊卡生物技術有限公司的DPPH、ABTS；采用天津市永大化學試劑有限公司的硫酸亞鐵、水楊酸、30%雙氧水、過硫酸鉀、鹽酸；其他實際都選擇分析純。

選擇昆山市超聲儀器有限公司的KQ-100VDE三頻數控超聲波清洗器；選擇上海美譜達儀器有限公司的V-1100型可見分光光度計；選擇溫嶺市林大機械有限公司的搖擺式高速萬能粉碎機；選擇上海博迅實業有限公司GZX-9240MBE數顯鼓風干燥箱。

2 方法與結果

2.1 番石榴葉總黃酮的含量測定

參考有關文獻，采用Al(NO3)3直接顯色法測定番石榴葉總黃酮含量[7]。移取蘆丁標準溶液或待測樣品液1mL于25mL容量瓶中，添加1mL的10%Al(NO3)3溶液，混勻，之后靜止放置6分鐘，采用70%乙醇進行定容處理，保證滿足刻度要求，之后搖勻并靜止放置10分鐘，在413納米位置開展吸光度的測試工作。蘆丁標準溶液在0.0128～0.0896mg/mL的范圍內，吸光度與濃度的線性方程為Y=19.852X+0.1224，r=0.9996，線性關系良好。

2.2 改進番石榴葉的總黃酮提取工藝

番石榴葉40℃干燥至恒重，粉碎過40目篩，得番石榴葉粉末備用。經預實驗篩選，選擇超聲法提取番石榴葉中總黃酮。稱取0.500g番石榴葉粉末，置具塞三角瓶中，加入一定比例的70%乙醇，稱重，浸潤5min，于50℃、功率100w、頻率80Hz的條件下，采用超聲方式開展提取工作，時間為30分鐘，冷卻，溶劑補足重量，過濾，得總黃酮提取液。

2.2.1提取工藝單因素考察

(1)總黃酮提取效果受到乙醇濃度的影響情況

稱取0.500g番石榴葉粉末6份，并添加到10mL的40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇(料液比1∶20)中，于50℃條件下，采用超聲方式開展提取工作，時間為30分鐘，通過提取液進行總黃酮含量計算，并對該工藝提取率進行計算。由結果可見，番石榴葉中的總黃酮提取效果會受到乙醇濃度影響，若是乙醇的濃度低于80%，則總黃酮提取率和乙醇濃度之間屬于正比關系。若是乙醇的濃度超出80%，則黃銅提取效率并不會隨之增加，還會出現一定下降。故番石榴葉總黃酮超聲提取，應該盡量選擇80%左右的乙醇。

(2)總黃酮提取效果受到料液比的影響情況

稱取0.500g番石榴葉粉末6份，分別按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入70%的乙醇，于50℃條件下，采用超聲方式開展提取工作，時間為30分鐘，通過提取液進行總黃酮含量計算，并對該工藝提取率進行計算。由結果可見，提取溶劑用量越大，黃酮提取率越高，降低料液比有利于黃酮類物質的溶解與擴散，提取效果更佳。但也可以看出，當料液比小于1∶20時，番石榴總黃酮提取率增幅變緩。綜合考慮生產成本，料液比選擇1∶25左右較佳。

(3)總黃酮提取效果受到溫度的影響情況

稱取0.500g番石榴葉粉末5份，各加入70%的乙醇10mL(料液比1∶20)，分別于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，采用超聲方式開展提取工作，時間為30分鐘，通過提取液進行總黃酮含量計算，并對該工藝提取率進行計算。通過計算結果能夠發現，溫度并不會對航通提取效率產生較大影響。這可能是因為超聲提取溫度是通過外部水浴溫度調控的。雖外部水浴控制一定溫度，但溶劑內部會局部升溫，溶劑溫度短時間難以與外部水浴一致，不同提取溫度下，溶劑內部溫度相差并不大。40℃～60℃時提取率隨溫度增加而增大，溫度超過60℃，提取率反而下降。故提取溫度選擇60℃左右較佳。

(4)總黃酮提取效果受到時間的影響情況

稱取0.500g番石榴葉粉末6份，各加入70%的乙醇10mL(料液比1∶20)，于50℃分別超聲20min、25min、30min、35min、40min、45min，提取液測定總黃酮含量，計算總黃酮提取率。由結果可見，超聲提取時間小于40min時，在時間不短延長過程中，黃酮提取效率不斷增加，但提取時間超過40min，提取率反而有所下降。因此，提取時間選擇40min左右較佳，見圖1。

圖1 番石榴葉總黃酮提取率受到乙醇濃度、料液比、溫度、時間的影響情況

2.2.2正交實驗優化提取工藝

結合單因素的實驗情況，采用溫度、時間、料液比以及乙醇4個因素設計正交實驗，優化總黃酮提取工藝，詳見表1、表2、表3。

表1 正交實驗中相關因素以及水平情況

表2 番石榴葉總黃酮正交實驗設計與結果

表3 方差分析表

由正交實驗結果(表2，表3)可知，上述因素中，乙醇濃度對于黃酮提取效率影響最為嚴重，料液比次之，溫度對于黃酮提取效率影響最小，并且料液比和乙醇濃度對于黃酮提取的影響遠遠高于溫度和時間的影響，有顯著性差異。A2B3C1D2是番石榴葉總黃酮的最佳提取工藝。即乙醇濃度為80%，料液比為1∶30，提取溫度為55℃，提取時間為40min。按照該工藝技術進行總黃酮提取，重復3次，平均提取率為(4.668±0.18)%，表明該工藝具有良好穩定性，并且提取率充分滿足預期要求。

2.3 番石榴葉總黃酮體外抗氧化活性研究

以上述番石榴葉中的總黃酮最佳提取工藝為基礎，參考有關文獻[8-9]并結合預實驗考察配制成適宜濃度的待測溶液對其DPPH、超氧陰離子自由基、羥基自由基、ABTS+自由基的清除性能展開研究。

(1)清除DPPH自由基的實驗

加顯色劑的樣品溶液：取待測溶液5mL，加1mmol/L DPPH溶液5mL，搖勻，基于室溫避光條件，反應30分鐘，517納米處測其吸光度記為A1。不加顯色劑的對照溶液：取待測溶液5mL，加5mL無水乙醇并搖勻，基于室溫避光條件，進行靜止放置處理，時間為30分鐘，測其吸光度記為A2?？瞻兹芤海喝PPH溶液5mL，加5mL無水乙醇，搖勻，室溫避光靜置30min，測其吸光度記為A0。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

番石榴葉總黃酮清除DPPH自由基的性能情況如圖2，總黃酮對DPPH自由基具有顯著清除作用，其清除能力在0.0216～0.1296mg/mL的濃度范圍內隨樣品的濃度增加而增加，最高清除率可達62.78%。

圖2 番石榴葉總黃酮清除DPPH自由基的性能情況

(2)清除超氧陰離子自由基(O2-·)的實驗

加顯色劑的樣品溶液：取待測溶液1mL，0.05mmol/LTris-HCl緩沖溶液4mL，鄰苯三酚鹽酸液0.5mL，混勻后靜置4min加濃HCl兩滴停止反應，325nm處測其吸光度記為A1。不加顯色劑的對照溶液：取待測溶液1mL，0.05mmol/LTris-HCl緩沖溶液4mL，10mmol/L的鹽酸0.5mL混勻，靜置4min加濃HCl兩滴停止反應，測其吸光度記為A2?？瞻兹芤海喝?0%乙醇1mL，0.05mmol/LTris-HCl緩沖溶液4mL，鄰苯三酚鹽酸液0.5mL，混勻后靜置4min加濃HCl兩滴停止反應，測其吸光度記為A0。

超氧陰離子自由基(O2-·)清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

由圖3可見番石榴葉總黃酮對超氧自由基(O2-·)雖清除率不高，但仍有一定程度的清除作用，其清除能力在0.0306～0.0714mg/mL的濃度范圍內與樣品的濃度有正相關的量效關系。

圖3 番石榴葉總黃酮清除超氧陰離子自由基性能情況

(3)對羥自由基(·OH)的清除實驗

加顯色劑的樣品溶液：取待測溶液0.5mL，依次加入9mmol/LFeSO4溶液0.5mL，9mmol/L水楊酸-乙醇液0.5mL，8.8mmol/LH2O2溶液0.5mL，純化水定容至10mL，避光靜止放置30分鐘，510納米處進行吸光度定并記為A1。不加顯色劑的對照溶液：取待測溶液0.5mL，依次加入9mmol/LFeSO4溶液0.5mL，9mmol/L水楊酸-乙醇液0.5mL，純化水定容至10mL，避光靜止放置30分鐘，測其吸光度記為A2?？瞻兹芤海喝?0%乙醇0.5mL，依次加入9mmol/LFeSO4溶液0.5mL，9mmol/L水楊酸-乙醇液0.5mL，8.8mmol/LH2O2溶液0.5mL，純化水定容至10mL，避光靜止放置30分鐘，測其吸光度記為A0。

羥自由基(·OH)清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

圖4 番石榴葉總黃酮對羥自由基的清除作用

結果可見，番石榴葉總黃酮可以充分清除Fenton體系產生的羥自由基，并呈現一定的量效關系。在0.216～1.512mg/mL的濃度范圍內，在黃酮濃度不斷增大過程中，其清除羥自由基的效果更加顯著，清除率可達92.35%。

(4)對ABTS+自由基的清除實驗

加顯色劑的樣品溶液：取待測溶液1mL，加入7mmol/LABTS+溶液4mL，靜置30min，于734nm處測其吸光度記為A1。不加顯色劑的對照溶液：取待測溶液1mL，加純水4mL，靜置30min，測其吸光度記為A2?？瞻兹芤海喝?0%乙醇1mL，加入7mmol/LABTS+溶液4mL，靜置30min，測其吸光度記為A0。

ABTS+自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

圖5 番石榴葉總黃酮對ABTS+自由基的清除作用

結果可見，番石榴葉總黃酮對ABTS+自由基具有較為顯著清除作用，在0.015～0.090mg/mL的濃度范圍內清除率與濃度幾乎成正相關，在0.126mg/mL的濃度時，清除率更是高達99.81%。

3 討論

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系統顯色是黃酮含量測定的常用方法[10]，但對番石榴葉總黃酮顯色時，發現NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色處理會有棕褐色沉淀，可能是提取液中其它成分干擾所致，故本實驗選擇Al(NO3)3直接顯色對番石榴葉總黃酮含量展開測定，方法學驗證該含測方法穩定可行。

選擇番石榴葉總黃酮具體提取方法時，曾考察了回流法、溫浸法、超聲法、微波提取等，結果發現超聲提取提取率較高，且操作簡單易行，本課題選擇了超聲法來提取番石榴葉總黃酮。通過采用正交優化以及發因素考察的方式對提取工藝展開改進，最終得到80%溢出，料液比1∶30，提取溫度55℃，提取時間40min是總黃酮最佳提取工作，總黃酮提取率可達4.7%左右。

體外抗氧化研究表明，番石榴葉總黃酮對DPPH、·OH、O2-及ABTS+均有一定的清除效果，并且在一定范圍內作用效果與濃度有量效關系，當清除率達到飽和時則不再隨著濃度的增加而增加。但是其對各自由基的清除強度不同，僅從最大清除率比較而言，番石榴葉總黃酮抗氧化性由強到弱依次為ABTS+>·OH>DPPH·>O2-·。