熊憶茗,李紅梅,秦占芬,*
1. 中國科學院生態環境研究中心,環境化學與生態毒理學國家重點實驗室,北京 100085 2. 中國科學院大學,北京 100049
雙酚A(bisphenol A, BPA)為大量生產化學品,主要用于合成聚碳酸酯、環氧樹脂等高分子材料,后者被用于制造飲料瓶、奶瓶和食品包裝等眾多的消費品。在生產、使用以及相關廢棄物的處置過程中,BPA被釋放進入環境;人體通過飲食、呼吸、直接接觸等途徑攝入BPA,BPA甚至可經子宮和母乳進入胎兒和新生兒。監測數據顯示,BPA在成人和新生兒的體液與組織中均有檢出,在血液與母乳中的濃度一般在皮摩爾和納摩爾水平,有的樣品中高達微摩爾水平[1-3]。
BPA是一種復雜的內分泌干擾物,具有包括雌激素活性、雄激素活性在內的多種內分泌干擾活性,其對生殖系統尤其是雄性生殖系統的影響一直受到關注[4]。有文獻報道低劑量BPA即可影響睪丸、附睪及附屬腺的結構、精子質量和數量、激素水平以及其他的生殖相關參數,但同時又有一些研究顯示BPA對雄性生殖系統沒有明顯的影響[5-6]。雖然美國食品藥品監督管理局(US FDA)曾提出,不同研究間出現不一致的結果可能源于暴露方式或者毒性測試指標的差異[7],但事實是有些采用相同暴露方式和毒性測試指標的研究也出現不一致的結果??傮w來看,雖然目前關于BPA對雄性生殖系統發育影響的數據很多,但是對這一問題的整體認識并不清楚。
為此,本文嘗試通過分析BPA對哺乳類實驗動物(大鼠和小鼠)雄性生殖系統發育影響的文獻,比較不同研究間毒性效應的差異,并探討產生差異的可能原因,以期獲得關于BPA雄性生殖毒性較為全面的認識。文章首先以“bisphenol A”、“male”、“reproduction/reproductive”為檢索詞,通過Pubmed獲得MEDLINE數據庫中的研究文獻139篇,根據公認的BPA無可見不良效應劑量水平(NOAEL)5 mg·(kg bw·d)-1[8]),過濾掉高于此劑量的文獻,最后確定對46篇進行分析??紤]到雄性生殖系統在妊娠期和哺乳期完成不同的發育程序[9-10],理論上不同發育期內的BPA暴露會產生不同的效應,因此文章按照妊娠期、哺乳期和妊娠-哺乳期3個暴露時期對文獻進行分類分析,重點關注BPA對睪丸及附睪的質量和組織學結構、附屬腺和外生殖器參數、肛殖距(anogenital distance, AGD)、精子參數和性激素水平的影響,在此基礎上討論暴露途徑、劑量、實驗動物品系等實驗因素與毒性效應的關系。
本文收集到19篇關于妊娠期BPA暴露對雄性生殖系統發育影響的文獻,考慮睪丸形成前后暴露導致的效應可能不同,因此將文獻大致分為妊娠前期(GD0~14/15,睪丸形成)、妊娠后期(GD14/15~21,睪丸和生殖道發育)和整個(或大部分)妊娠期暴露分別分析。表1匯集了這些文獻的實驗設計和毒性效應的信息,具體分析如下。
Hong等[11]報道ICR小鼠著床期(GD1~5)口服暴露20 μg·(kg bw·d)-1BPA,導致子鼠在出生后PND24和PND35睪丸質量和雄激素水平下降;但當發育至PND50,睪丸質量下降的效應消失。Rahman等[12]報道ICR孕鼠在睪丸形成期間(GD7~14)灌胃BPA,5 mg·(kg bw·d)-1的劑量抑制子代成年后的生精功能,而低劑量50 μg·(kg bw·d)-1的處理沒有明顯效應。在稍晚期(GD10~16)的C57BL/6小鼠暴露研究中,LaRocca等[13]發現50 μg·(kg bw·d)-1和1 000 μg·(kg bw·d)-1的灌胃處理對子鼠成年后的睪丸在器官、組織、細胞水平以及分子水平上都沒有影響,同時也不影響精子的發生和睪酮(T)的水平。
以上3項研究好像顯示著床時期的BPA暴露對子鼠的雄性生殖系統發育有一定的影響,但是隨著時間的延長,BPA的效應似乎有被修復的趨勢;睪丸形成時期的BPA暴露對子鼠成年后的生殖系統似乎沒有明顯影響。
亦有研究在妊娠后期進行BPA暴露,此時睪丸已經形成。Quan等[14]選擇在GD14~21對SD大鼠進行灌胃處理,發現1 mg·(kg bw·d)-1BPA對子代雄性生殖系統有明顯影響,表現在斷乳后睪丸組織學結構異常、T水平下降,而且腎小管的結構也出現異常;PND50時精子數量與質量降低、畸形率增加。Lv等[15]報道相同方式和相近劑量(4 mg·(kg bw·d)-1)的BPA暴露(GD12~21),導致SD大鼠子代出生后T水平降低。在Abdel-Maksoud等[16]的灌胃暴露研究中,也發現低劑量(2.5 μg·(kg bw·d)-1和25 μg·(kg bw·d)-1)BPA對Long-Evans大鼠的睪丸產生不良影響,表現為PND35時生精上皮的結構受到明顯破壞,生精小管結構紊亂并萎縮,生殖細胞脫落進入管腔中。
Timms等[17]對妊娠后期(GD14~18)的CD-1小鼠(與ICR小鼠為同一品系)短期暴露10 μg·(kg bw·d)-1BPA,觀察到胎鼠前列腺導管被刺激發育,尿道呈現狹窄性異常。另一項對CD-1小鼠妊娠后期(GD16~18)的暴露研究發現,低劑量BPA(50 μg·(kg bw·d)-1)雖然沒有影響子鼠(PND3、21、60)的睪丸質量,但導致附睪質量減少和肛門-生殖器距離(AGD)增加[18];這些結果好像指示BPA影響小鼠的雄性生殖系統發育,但是附睪質量與AGD作為生殖風險的標志表現出了相反的變化趨勢,有違二者正相關的一般認識[19]。
就以上幾項研究來看,妊娠后期BPA暴露對大鼠和小鼠的雄性生殖系統發育都有不同程度的影響,妊娠后期可能是BPA作用的較為關鍵的窗口期。
全妊娠期覆蓋睪丸和生殖道的發生和早期發育的過程,此時期的暴露理論上能夠較好地揭示BPA對雄性生殖系統發育的影響。3篇文章研究了整個妊娠期內飲水暴露BPA的影響。Ullah等[20]對SD大鼠進行BPA暴露 (1 mg·(kg bw·d)-1和5 mg·(kg bw·d)-1),PND16檢測到生精小管面積、間隙面積、上皮面積、曲細精管直徑降低而上皮高度增加等組織學變化,且睪丸的生精與激素合成功能也受到影響。Yang等[21]對C57BL/6J小鼠進行BPA暴露(5 μg·mL-1和50 μg·mL-1),觀察到BPA引起了生精小管細胞凋亡,影響了睪丸類固醇合成能力而降低了T的水平。Tanaka等[22]對SD大鼠進行BPA暴露(0.2、2、20和200 μg·mL-1),新生大鼠同樣檢測到T降低的變化。此3項研究實驗設計接近,結果也一致顯示妊娠期飲水暴露BPA明顯損傷雄性生殖系統發育。與飲水暴露類似,完整妊娠期內的灌胃暴露研究中也觀察到BPA對雄性生殖系統發育的損傷。Henafy等[23]報道妊娠期暴露于低劑量BPA的Wistar大鼠的雄性子代出現睪丸與附睪質量降低,AGD減少的變化,但T水平沒有受到明顯影響。Ma等[24]對SD大鼠灌胃BPA(0.05 mg·(kg bw·d)-1),觀察到8周齡大鼠睪丸組織結構受損、精子數量減少和T水平降低。Vilela等[25]對Calomyslaucha小鼠在妊娠期灌胃BPA,研究發現,BPA(40、80和200 μg·(kg bw·d)-1)導致PND70的子鼠精子活動性降低,雖然在PND21時AGD沒有受到影響。
另有幾項研究雖然不是在整個妊娠期都暴露于BPA,但也幾乎覆蓋了睪丸發生和發育的大部分過程。Wistar大鼠在GD10~21灌胃暴露于BPA(25 μg·(kg bw·d)-1和250 μg·(kg bw·d)-1),子鼠在4月齡時檢出睪丸器官系數降低、間質細胞壞死、生殖細胞變性、精子數量與質量降低、促黃體生成素(LH)與T水平降低等明顯損傷[26]。CD-SD大鼠在GD6~21暴露于BPA(2.5、25、250和2 500 μg·(kg bw·d)-1),子鼠出生后有尿道短小、尿路上皮厚度小和精阜形態異常等癥狀[27]。相同時期(GD6~21)SD大鼠的BPA(0.1 mg·(kg bw·d)-1)暴露研究,卻發現1年齡子鼠沒有出現精子和睪丸組織學結構的異常[28]。Shi等[29]在GD11~21將CD-1小鼠暴露于BPA(0.5、20和50 μg·(kg bw·d)-1),雖然檢測到BPA引起了睪丸細胞的凋亡,但在PND60時發現BPA沒有明顯影響小鼠睪丸質量或T濃度,僅低劑量BPA降低了精子數量。Wei等[30]的研究也報道了相似的結果,在GD0.5~17.5通過腹腔注射對昆明小鼠進行BPA暴露(2.5 mg·(kg bw·d)-1和5 mg·(kg bw·d)-1),雖然小鼠斷乳后血清T濃度顯著降低,但發育至8周齡后,T濃度略有回升。這4項研究的結果差異似乎顯示,停止暴露或斷乳后立即檢測比發育至一定階段后再檢測顯示的生殖毒性更強,即BPA對生殖系統的影響在停止暴露后發生一定程度的修復。
表1 妊娠期雙酚A(BPA)暴露對實驗鼠的雄性生殖系統發育的影響Table 1 Developmental effects of gestational exposure to bisphenol A (BPA) on the male reproductive system in laboratory rats or mice
就以上文獻來看,妊娠前期、后期以及整個妊娠期的BPA暴露對實驗鼠的雄性生殖系統發育都有不良影響,且不良效應的產生可能與暴露方式無關,灌胃、飲水和注射的暴露方式都可產生陽性結果。
哺乳期內睪丸、生殖道乃至整個雄性生殖系統進一步發育,研究此發育期內BPA暴露效應的文獻較多,在表2中概括了主要文獻研究的實驗設計和毒性效應的信息,具體分析如下。
Kalb等[31]對瑞士白化小鼠母體管飼BPA(300、900和3 000 μg·(kg bw·d)-1),發現高劑量組的子鼠在8個月齡時出現AGD降低、生精小管發育不全的現象,且所有劑量的BPA均影響了精子生成。解美娜和李鋒杰[32]用相似方式處理ICR小鼠(0.01 mg·(kg bw·d)-1和5 mg·(kg bw·d)-1),PND75檢測到BPA對子鼠睪丸組織學結構的損傷并伴有細胞凋亡。該作者也研究了通過皮下注射相同劑量BPA的方式直接處理哺乳期ICR小鼠,哺乳結束時發現BPA處理組的生精小管結構破壞、生殖細胞凋亡[33]。事實上,更多的研究都選擇使用BPA直接處理哺乳期的子鼠而不是通過母鼠給藥經哺乳暴露。Henafy等[23]報道哺乳期大鼠管飼BPA(50 μg·(kg bw·d)-1),在PND60檢測到大鼠體質量、睪丸與附睪質量降低,伴有AGD縮小和T水平降低。
除整個哺乳期的暴露外,另有哺乳期內部分時間段暴露BPA對雄性生殖系統發育影響的報道。Aikawa等[34]對新生SHN小鼠持續5 d皮下注射BPA(0.5 μg·(只·d)-1和50 μg·(只·d)-1),檢測到10周齡小鼠精子畸形發生率增加、活動率降低,但睪丸組織學結構未出現明顯異常。Salian等[35]報道相同時期的皮下注射(劑量為100、200、400、800和1 600 μg·(kg bw·d)-1),Holtzman大鼠在PND125時精子數量和質量也受到明顯影響,且有生殖細胞脫落到生精小管腔中,成年后生育能力也受到影響;但該研究還在400 μg·(kg bw·d)-1劑量組中觀察到了T增加的現象,與其他參數的結果存在一定的矛盾。Toyama和Yuasa[36]對Wistar大鼠及ICR小鼠在PND1~11期間隔日皮下注射600 μg BPA,青春期時檢測到動物精子形態異常,性成熟后雖仍有部分精子頭部發生變形,但生殖能力并未損傷。而Nagao等[37]雖然也進行了5 d的BPA暴露(300 μg·(kg bw·d)-1),但在斷乳(PND21)或性成熟(PND84)時均未檢測到對睪丸質量或結構的影響。Kato等[38]在PND1~9對SD大鼠進行0.024、0.12、0.6和3 μg·(只·d)-1BPA的暴露,PND35和PND150時同樣未檢測到睪丸和附睪質量、結構及性激素生成方面的缺陷。這幾項研究雖然在相似發育期同樣使用了皮下注射的給藥方式,但結果互有矛盾。而Brouard等[39]在PND15~30對SD大鼠皮下注射BPA(50 μg·(kg bw·d)-1),結束后檢測到大鼠睪丸質量增加、生精小管中管腔和頂體數目增加的現象,但對編碼血液睪丸屏障(BTB)蛋白的基因的分析顯示了BPA對血液睪丸屏障的形成有一定抑制作用,這不利于精子發生或對已形成精子有損害作用。這項研究報道的BPA效應指標中存在矛盾,也缺少對精子數量或質量的評估,難以直接判斷BPA對生精功能的影響。
Zhang等[40]雖然從PND3才開始對CD-1小鼠進行BPA暴露處理(20 μg·(kg bw·d)-1和40 μg·(kg bw·d)-1),但是持續到PND21、35、49時,發現2個長時間暴露組的睪丸組織學結構發生異常,精子數量和精液質量也顯著降低,但是PND21組沒有出現類似的效應。
整體來看,文獻中有關BPA對實驗鼠雄性生殖發育影響的數據出現諸多不一致的結果,即便在實驗設計相似的情況下也出現了這樣的現象,而且不良效應的有無好像與鼠的品系或暴露方式沒有明確的關系。
妊娠期與哺乳期的長期暴露是研究化學物質生殖毒性必須要考慮的實驗設計。本文共收集到16篇關于此時期內BPA暴露對雄性生殖系統發育影響的文獻,主要信息統計在表3中。
有5篇文獻報道了整個妊娠期至哺乳期的暴露研究。Liu等[41]對ICR小鼠進行飲水BPA暴露(10、100和1 000 nmol·L-1),結束后小鼠睪丸器官系數略有降低,但在電鏡下觀察到100 nmol·L-1BPA引起睪丸中精原細胞、Sertoli細胞、Leydig細胞及腎小管周圍肌樣細胞形態異常及凋亡。Cardoso等[42]對Wistar大鼠進行了相似的BPA暴露研究(2.5 mg·(kg bw·d)-1),至PND90檢測到大鼠性激素分泌與調節功能受損。Gámez等[43]則進行了低劑量的飲水暴露(3 μg·(kg bw·d)-1),至PND35時也檢測到了BPA引起了大鼠睪丸組織學損傷,生精小管管腔面積減少。另有研究使用灌胃暴露的方式處理大鼠,斷乳后大鼠的生殖器官發育顯著受損,睪丸及附睪質量減少、AGD降低,且T濃度也降低[23]。而Okada和Kai[44]設計了一種特殊的給藥方式,將定量BPA(100 μg、5 mg)裝入醫用聚乙烯管皮下植入小鼠體內,使化合物以一定速度持續釋放。暴露結束后雖然雄性子代睪丸、附睪和附屬腺的相對質量沒有明顯變化,但生精小管中觀出現生殖細胞脫落、細長精子數量減少,且BPA表現出對T合成低劑量促進而高劑量抑制的雙向劑量-效應影響。相較前3項研究,Okada和Kai[44]的研究克服了飲水給藥過程中藥物攝入量不穩定、代謝轉化的問題,所使用的藥物劑量可能更接近于理想模型。
表2 哺乳期BPA暴露對實驗鼠的雄性生殖系統發育的影響Table 2 Developmental effects of lactational exposure to BPA on the male reproductive system in laboratory rats or mice
表3 妊娠-哺乳期BPA暴露對實驗鼠的雄性生殖系統發育的影響Table 3 Developmental effects of exposure to BPA from gestion to lactation on the male reproductive system in laboratory rats or mice
此外,另有11篇文獻研究了部分妊娠期至哺乳期BPA暴露的效應。Sadowski等[45]在GD1~PND9對Long-Evans大鼠灌胃BPA(4、40和400 μg·(kg bw·d)-1),斷乳后發現BPA僅引起了促卵泡生成素(FSH)降低。Sp?rndly-Nees等[46]在著床期開始至哺乳期結束(GD3.5~PND22)對Fischer 344大鼠進行飲水低劑量BPA暴露(0.5 μg·(kg bw·d)-1和50 μg·(kg bw·d)-1),但無論在發育早期(PND35)或晚期(PND365)檢測均未發現生殖系統受到明顯損害。另一些從著床期之后進行暴露的研究也報道了不同的結果。Meng等[47]自GD6對C57BL/6小鼠進行飲水BPA暴露(15 μg·(kg bw·d)-1和150 μg·(kg bw·d)-1),至PND49時雖然未檢測到睪丸、附睪質量的變化,但引起了生精小管萎縮、生精細胞紊亂和管腔精子減少等病變,并在高劑量組觀察到精子數量降低、畸形率提高。Kobayashi等[48]的研究用相同方式處理大鼠,無論劑量高低,檢測時間早晚,雄性子代都未表現出明顯的生殖損傷。除飲水暴露外,使用灌胃途徑給藥的研究也得到不一致的結果。美國國家毒理學計劃(NTP)曾對BPA進行了一項系統的研究:在GD6~PND21對CD-SD大鼠灌胃BPA(2.5、25、250、2 500和25 000 μg·(kg bw·d)-1)并在PND365或者PND730進行多指標檢測,發現BPA對相關生殖器官的發育及生精功能均沒有明顯的影響[49]。Delclos等[50]同樣進行了大范圍劑量的研究,在GD6~21的孕期暴露結束后持續至PND15、21對CD-SD大鼠灌胃BPA(2.5、8、25、80、260、840和2 700 μg·(kg bw·d)-1),發育成熟后沒有檢測到生殖器官形態異?;蛏δ軗p傷。Christiansen等[51]對Wistar大鼠灌胃BPA(0.025、0.25和5 mg·(kg bw·d)-1),暴露結束后,雖然BPA沒有影響睪丸、附睪、腹側前列腺、精囊、膀胱小腺、腎上腺和甲狀腺等器官的質量,但引起了AGD降低。Hass等[52]進行了同樣的實驗設計,在多個發育期均未檢測到BPA對生殖器官的顯著影響,僅發現低劑量BPA表現出抑制精子生成的作用。Watanabe等[53]對ICR小鼠灌胃BPA(4 mg·(kg bw·d)-1),在9周齡及36周齡時檢測到T增加的異常變化。Salian等[54]在GD12~PND21對Holtzman大鼠進行了低劑量BPA灌胃暴露(1.2 μg·(kg bw·d)-1和2.4 μg·(kg bw·d)-1),PND75檢測到大鼠精子數量與活動能力降低,而Nanjappa等[55]對Long-Evans大鼠進行的同時期灌胃研究(2.5 μg·(kg bw·d)-1和25 μg·(kg bw·d)-1)也發現BPA抑制了類固醇生成酶的表達。圍產期(GD14~PND7)暴露也是研究關注的重要窗口之一。Oliveira等[56]在GD18~PND5對Wistar大鼠皮下注射BPA(0.5 mg·(kg bw·d)-1和5 mg·(kg bw·d)-1),發現在PND90,BPA同樣沒有明顯影響性激素的分泌與調節。Campos等[57]進行了相同暴露期與劑量的研究,在PND90時檢測到BPA抑制生精小管的發育與精子生成的陽性結果,但同時T水平升高,這些指標之間存在矛盾。
通過以上分析,發現妊娠期-哺乳期BPA暴露研究比哺乳期暴露研究呈現更多的矛盾結果。以T水平這一單一指標為例,11項妊娠期-哺乳期BPA暴露研究中,6項報道BPA對T水平沒有影響,2項報道BPA導致T降低,3項報道BPA導致T升高(表4)。Goodman等[58-59]在綜述BPA對大鼠生殖和發育影響的文獻時也發現,不同研究間存在諸多矛盾的結果;通過評價研究的質量控制,作者認為矛盾的結果可能與不嚴格的質量控制有關,所以即便有陽性的結果也不足以確定BPA是否影響大鼠的生殖和發育。本文參考Goodman提出的方法,根據實驗方法描述是否詳細規范、統計檢驗方法是否合理、統計單元設置是否正確以及是否設置了陽性對照等4項要求,對以上涉及T水平的11項研究進行質量控制的評價(表4)。結果表明,僅有1項研究能夠滿足所有4項要求,而其他研究僅滿足4項要求中的2項或者3項。值得注意的是,多項研究均未使用“窩/籠”作為統計單元,而以實驗動物個體作為統計單元,這在發育毒性的研究中是不可接受的。因此,綜合實驗質量評價結果,可以認為目前這些文獻因為缺乏嚴格的質量控制,所得到的結果尚不能對妊娠-哺乳期BPA暴露是否影響T水平乃至雄性生殖系統發育給出明確的結論。
本文分析了妊娠期、哺乳期以及妊娠期-哺乳期BPA暴露對雄鼠生殖系統發育影響的文獻,以睪丸和附睪的質量、睪丸組織學結構、附屬腺和外生殖器參數、AGD、精子參數和性激素水平等6項指標為標準,綜合評價了各研究的結果及與實驗設計的關系,發現妊娠期BPA暴露對雄性生殖系統發育影響的研究給出了比較一致的陽性結果,而哺乳期暴露研究的結果呈現陽性和陰性的矛盾。這些現象似乎指示妊娠期暴露的影響比哺乳期暴露的影響更加明顯。然而,當BPA暴露從妊娠期延長至哺乳期,發現對雄性生殖系統發育的影響非但沒有像單獨妊娠期暴露那樣得出比較一致的陽性結果,反而出現了更多的陰性結果。這種現象在邏輯上好像是不合理的??紤]到使用不同暴露方式可能導致BPA在體內經歷不同的代謝過程,導致BPA在生物體組織中的濃度差異[60],本文嘗試分析暴露方式與矛盾結果的關系。然而,上述分析表明暴露方式以及動物品系、劑量等其他實驗設計因素與陰性、陽性結果之間沒有明確的關系,即便相似甚至相同的實驗設計下也出現了不同的結果。如前文所述,我們分析妊娠-哺乳期暴露的部分研究在實驗的質量控制方面存在一定的缺陷,所以更傾向于用實驗質量控制不嚴格來解釋目前文獻中出現的矛盾結果。也就是說,盡管目前有關BPA暴露對雄性生殖系統發育影響的數據很多,但是因實驗質量控制問題導致的矛盾結果并不能給出明確的結論??傮w來看,BPA對睪丸和附睪的質量、睪丸組織學結構、附屬腺和外生殖器參數、AGD、精子參數和性激素水平等較為宏觀的雄性生殖毒性指標的影響即便存在也相對較弱,因此微弱的實驗條件的差異甚至是相同實驗條件下只是質量控制的差異就可導致結果的不同。
為獲得低劑量BPA是否影響雄性生殖系統發育這一問題的更有說服力的結果,今后的研究中務必加強實驗質量的控制,尤其需要選擇合適的統計方法和統計單元并適當增加樣本量。另外,除關注睪丸和附睪的質量、睪丸組織學結構、附屬腺和外生殖器參數、AGD、精子參數、性激素水平等傳統的和粗放的雄性生殖毒性指標外,需要開發和使用細胞和分子層面的指標,建立更為敏感的研究方法,以在更精細的水平識別BPA對雄性生殖系統發育的損傷,這也正是目前化學品毒性測試面臨的課題和未來發展的方向。
表4 實驗質量評價:妊娠-哺乳期BPA暴露對鼠睪酮(T)水平的影響Table 4 Evaluation of experimental quality: Effects of exposure to BPA from gestation to lactation on testosterone (T) levels in laboratory rats or mice