除草劑對非靶標生物及人體的生殖毒性與遺傳毒性研究進展

楊嘉輝，王安,*，楊秀鴻

1. 中南大學湘雅公共衛生學院衛生毒理學系，長沙 410078 2. 湖南省職業病防治院毒理實驗室，長沙 410007

除草劑(herbicide)主要被用于農業及非農業中雜草及有害植物的殺滅或防治，已逐漸成為農業生產中至關重要的工具。而因藥害、殘留性、污染性、雜草抗藥性及毒性等問題，一些除草劑漸漸被更加高效安全的產品取代。本文所涉及的22種除草劑及其主要施用場景如表1所示。

除草劑可隨水循環及食物鏈在不同生態系統中的生物間傳遞，目標雜草以外的生物即為非靶標生物(non-target organism)。其中適宜的物種可作為除草劑生殖及遺傳毒性研究的模式生物(model organism)。生殖毒性(reproductive toxicity)又稱繁殖毒性，是指外源性化學物引起的親代雌性或雄性繁殖功能損傷或生殖能力下降；遺傳毒性(genotoxicity)則是外源化學物對遺傳物質的毒性作用。傳統的生殖毒性研究多以大鼠和小鼠等嚙齒類動物為試驗對象，往往因效率、周期和成本問題而無法滿足現實的研究需要；而經典的遺傳毒性試驗也大多無法真實地反映生態系統中生物遺傳物質所受的損害。隨著研究技術的發展和倫理學方面的要求，鳥類、魚類、兩棲動物、爬行動物等脊椎動物，以及節肢動物、線蟲動物等無脊椎動物在生殖和遺傳毒性安全評價中獲得了一定的青睞。本文綜述了多種常見除草劑對一些非靶標生物以及人體的生殖毒性和遺傳毒性作用，希望能為除草劑的生態毒理研究提供思路，為新品類除草劑毒性試驗中模式生物的選擇提供參考。

表1 文中涉及的除草劑及其施用場景Table 1 Herbicides studied in this article and their application

1 魚類與鳥類(Fish and birds)

1.1 魚類

除草劑可通過水體由農田生態系統向水生生態系統轉移，并通過食物鏈向上傳遞，對其中的魚類造成毒害作用[1]。研究顯示，一些除草劑可影響魚類的類固醇合成相關基因的表達，干擾睪酮及雌二醇等性激素的分泌，從而對生殖產生不利影響。Uren等[2]以0.01、0.5和10 mg·L-1的草甘膦對繁殖期的斑馬魚染毒21 d。在10 mg·L-1的劑量下，雌性斑馬魚的受精率不受影響，而產卵量降低，胚胎早期死亡及早產的發生率升高。性腺基因轉錄表達譜顯示，在10 mg·L-1的劑量下，草甘膦可使雄性斑馬魚睪丸中過氧化氫酶(catalase, CAT)和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)、hsd3b2及雌性斑馬魚卵巢中cyp19a1和ersl的表達上調。Armiliato等[3]發現，65 μg·L-1草甘膦染毒15 d可誘導雌性斑馬魚的類固醇生成因子-1表達上調，并引起卵母細胞直徑增大及卵巢超微結構異常。Zhu等[4]研究發現，精喹禾靈對斑馬魚的48 h半數致死濃度(LC50)為1.21 mg·L-1，據此設立劑量為2、20和200 μg·L-1，染毒30 d后檢測發現精喹禾靈可通過調節斑馬魚體內卵黃蛋白原1(vitellogenin1, VTG1)、雌激素受體α(estrogen receptorα, ERα)、hhex和pax8等分泌相關的基因表達而影響生殖。雄魚體內下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic pituitary gonadal, HPG)軸的相關基因表達上調，卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)及雌激素水平升高；而雌魚HPG軸相關的基因表達下調，VTG水平下降。此外，精喹禾靈可誘導斑馬魚性腺組織學損傷，引起胚胎孵化及生長抑制乃至畸形。Jiang等[5]以50、100和200 μg·L-1的丙草胺染毒斑馬魚96 h，發現丙草胺除通過HPG軸誘導芳香化酶活性及VTG表達增強外，還可引起凋亡途徑中P53、mdm2、bbc3的表達及caspase3、caspase9活性上調，從而誘導胚胎細胞凋亡。

Richter等[6]以0.5、5和50 g·L-1的阿特拉津染毒雌性日本青鳉(Oryziaslatipes)和黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)30～38 d，發現染毒組的產卵量均有減少，VTG1及透明帶糖蛋白3.1(zp3.1)等與卵成熟、卵巢中類固醇有關的物質、肝臟中雌激素受體(estrogen receptor, ER)以及大腦中促性腺激素的表達下調。Ahmadivand等[7]發現，經0.39 mg·L-1丁草胺染毒10 d的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)，其血漿睪酮水平下降，性腺指數(gonadosomatic index, GSI)無顯著變化；參與減數分裂的boule表達下調，減數分裂進程受抑制。Papoulias等[8]以0.5、5和50 μg·L-1的阿特拉津染毒日本青鳉，所有劑量組的雌性日本青鳉總產卵量均較對照組降低(36%～42%)，主要歸因于雌性排卵數的減少以及雄性生殖細胞異常，而睪酮、雌二醇、芳香化酶蛋白水平以及性腺指數不受影響，這一結果與前述研究有所不同。

除草劑對魚類生殖系統也可能存在直接毒性作用。Lopes等[9]利用5 mg·L-1和10 mg·L-1的草甘膦染毒雄性斑馬魚，在24 h和96 h這2個時間點采集精子，結果顯示，2個劑量組精子的線粒體膜及DNA完整性均遭到破壞，精子活性降低。

在遺傳毒性評價中，常用微核試驗和單細胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)評價化學物的染色體損傷作用和DNA損傷作用。Anbumani和Mohankumar[10]以亞致死濃度(0.016、0.032和0.064 mg·L-1)的丁草胺染毒卡特拉鲃(Catlacatla)35 d，隨染毒時間增加，各劑量組外周血紅細胞微核率升高，并有雙核細胞和無核細胞出現。Adeyemi等[11]的研究顯示，0.1 mmol·L-1阿特拉津染毒96 h對斑馬魚胚胎具有致畸作用、氧化應激作用以及遺傳毒性，表現為卵凝結、卵水腫、生長遲緩、脊柱側凸、脂質過氧化水平升高、CAT活性減弱以及DNA尾矩增加。

Nwani等[12]采用半靜態法測得草甘膦和阿特拉津對翠鱧(Channapunctatus)的96 h-LC50值分別為32.0 mg·L-1和42.0 mg·L-1，并以LC50值的1/4、1/2和3/4作為染毒劑量，即以草甘膦(8.1、16.3和24.4 mg·L-1)及阿特拉津(10.6、21.2和31.8 mg·L-1)染毒翠鱧96 h，每隔24 h采集外周血，微核試驗顯示各劑量組外周血紅細胞微核率均升高，在96 h達最高值，并出現核碎裂和雙核等核異?，F象。Piancini等[13]以環境相關濃度(1.8、7、30、115和460 μg·L-1)的硝磺草酮分別處理尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)和巴西珠母麗魚(Geophagusbrasiliensis)96 h，在各染毒組中均可觀察到氧化應激和DNA損傷，尼羅羅非魚體內谷胱甘肽(glutathione, GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)水平升高；巴西珠母麗魚體內谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase, GST)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性增加，SCGE結果顯示肝臟、外周血淋巴細胞及腮組織存在DNA損傷。Wang等[14]以環境相關濃度(1.8、18和180 μg·L-1)的硝磺草酮處理錦鯉(Cyprinuscarpio)，在7、18和28 d收集鰓、肝臟和肌肉組織，SCGE檢測顯示各劑量組均出現DNA損傷，以肝臟最甚，僅第28天時在180 μg·L-1劑量組中觀察到SOD、CAT和活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高，而丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、GSH、GPx及谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GSR)活性無顯著變化。Ruiz等[15]以2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和麥草畏的亞致死濃度，即96 h-LC50值的2.5%和5%(2,4-D為25.2 mg·L-1和50.4 mg·L-1，麥草畏為41 mg·L-1和82 mg·L-1)分別染毒花鳉(Cnesterodondecemmaculatus)28 d，2,4-D可在7～28 d時誘導原發性DNA損傷，而2種劑量的麥草畏分別在7～14 d和7～28 d內誘導原發性DNA損傷，損傷表現為DNA鏈的斷裂。

1.2 鳥類

畜牧業與種植業同為農業的組成部分，在空間分布上較為接近，故家禽容易暴露于除草劑等農藥中。Somers等[16]早在1978年便以雞為對象進行了除草劑一代和二代繁殖試驗，2,4-D、2,4,5-涕(2,4,5-T)及氨氯吡啶酸的推薦田間施用量為746 L·hm-2，稀釋后通過噴霧形式使公雞與母雞分別暴露于10倍推薦施用量(11.2 kg·hm-2)，以人工授精技術得到胚胎并進行孵化，發現該劑量下交配成功率、胚胎的死亡率及畸形率無顯著變化，子代的生長發育及生殖未受影響。Arias[17]根據8 mg·胚胎-1的半數致死劑量(LD50)值，按0、0.5、1、2和4 mg的劑量向雞卵殼膜內注射2,4-D，在染毒第4、7和10天進行姐妹染色單體互換(sister-chromatid exchange, SCE)和細胞周期動力學方面的檢測，除0.5 mg以外的劑量組中均觀察到了雞胚SCE率升高及細胞周期減慢，提示2,4-D對雞胚具有一定的遺傳毒性，其最低可觀測效應濃度(lowest observed effect concentration, LOEC)為1 mg·胚胎-1，遠超過推薦田間施用量。靳生等[18]測得阿特拉津對雛雞的LD50為451 mg·kg-1體質量，并以LD50的1/20、1/15和1/10設置劑量組，通過微核試驗發現阿特拉津對雛雞具有致突變作用，可誘導雛雞骨髓嗜多染紅細胞微核率升高，呈劑量依賴性，LOEC為22.55 mg·kg-1體質量。

de la Casa-Resino等[19]在第0、5和10天以阿特拉津染毒雌性歐洲鵪鶉(Coturnixcoturnixcoturnix)，劑量為25 mg·kg-1和100 mg·kg-1，并在第15、30和45天取樣，在第30天時2種劑量下均可引起肝臟ERα表達上調，血漿雌二醇水平升高；100 mg·kg-1劑量下可引起血清VTG濃度升高，低于美國環境保護局給出的未觀察到有害作用濃度(no observed adverse effect concentration, NOAEC)225 mg·kg-1體質量，提示阿特拉津具有雌激素作用，可干擾雌性鵪鶉HPG軸的激素調節。Soni等[20]通過靜脈注射染毒日本鵪鶉(Coturnixcoturnixjaponica)1周，劑量為10 mg·kg-1體質量，發現百草枯可作用于光感受器和HPG軸，使視紫紅質、黑視蛋、類固醇、雄激素受體(androgen receptor, AR)和促性腺激素釋放激素-I(gonadotropin-releasing hormone-I, GnRH-I)表達下調，而使褪黑素受體(MEL-1A-R、MEL1BR、MEL1CR)和促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH)表達上調，從而影響日本鵪鶉的生殖功能。李薇[21]的研究顯示，阿特拉津及其細胞代謝產物二氨基氯三嗪(diaminochlorotriazine, DACT)可抑制鵪鶉卵巢顆粒細胞活性，誘發氧化應激，誘導性激素合成相關蛋白及cAMP表達上調，從而引起卵巢顆粒細胞內分泌紊亂，阿特拉津的半數抑制濃度(IC50)為(261.20±1.88) μmol·L-1，DACT的IC50為(214.17±2.98) μmol·L-1。

2 兩棲動物與爬行動物(Amphibians and reptiles)

2.1 兩棲動物

隨著農業生產中除草劑的應用，以水稻田生態系統為棲息地的兩棲動物染毒的隱患逐漸增大。Lajmanovich等[22]研究了草甘膦、甲磺隆、雙草醚和氨氯吡啶酸4種除草劑對蟾蜍(Rhinellaarenarum)蝌蚪的遺傳毒性，4種除草劑均可抑制蝌蚪體內乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase, AChE)活性；除草甘膦外，甲磺隆、雙草醚和氨氯吡啶酸可引起蝌蚪核異常率升高。

鎮海林蛙(Ranazhenhaiensis)、黑眶蟾蜍(Bufomelanostictus)和澤陸蛙(Fejervaryamultistriat)是我國南方稻田常見蛙類，以0.2、0.4、1.0和1.5 mg·L-1劑量的丁草胺處理鎮海林蛙的蝌蚪，以0.2、0.4、0.6和0.8 mg·L-1劑量的丁草胺處理黑眶蟾蜍和澤陸蛙的蝌蚪，染毒第1、2、3和4天收集蝌蚪血細胞。微核試驗結果表明，隨染毒時間增加，各劑量組蝌蚪紅細胞的微核率及核異常率逐漸升高，第3天達峰值，第4天降至對照水平，0.2 mg·L-1和0.4 mg·L-1的劑量下微核率及核異常率的升高不具有統計學意義。SCGE檢測結果顯示，0.2 mg·L-1丁草胺即可引起3種蝌蚪的DNA損傷，隨濃度升高DNA損傷水平升高[23]。葉圣濤[24]以澤陸蛙和黑斑側褶蛙(Pelophylaxnigromaculata)為對象，以0.025、0.05、0.1和0.25 mg·L-1終濃度的乙草胺和丁草胺處理其血液，SCGE檢測結果顯示，0.025 mg·L-1的乙草胺和丁草胺即可引起紅細胞DNA損傷，損傷水平呈劑量依賴性；以2、8和32 mg·L-1終濃度的乙草胺和丁草胺染毒個體，微核試驗結果顯示，2 mg·L-1丁草胺即可引起澤陸蛙紅細胞微核率升高，不同劑量組間無差異；各劑量組乙草胺均不引起澤陸蛙紅細胞微核率變化。2 mg·L-1的乙草胺或丁草胺即可誘導黑斑側褶蛙的紅細胞微核率升高，表現出劑量效應關系。Liu等[25]發現，丁草胺在環境濃度下對澤陸蛙蝌蚪的生存、發育及變態過程存在不利影響，其96 h-LC50為0.87 mg·L-1，遠低于稻田推薦施用量4.8 mg·L-1，以0.2、0.4和0.8 mg·L-1的丁草胺染毒澤陸蛙蝌蚪35 d，SCGE檢測結果顯示0.4 mg·L-1和0.8 mg·L-1劑量組蝌蚪紅細胞出現DNA單鏈斷裂等DNA損傷。惡唑禾草酸(fenoxaprop acid, FA)和6-氯苯并惡唑酮(6-chloro-2-benzoxazolone, CDHB)是惡唑禾草靈的2種主要代謝產物。Jing等[26]通過經口和經皮的途徑給予青蛙惡唑禾草靈，經口染毒后在其體內未檢出惡唑禾草靈，但在肝臟、腎臟、大腦、卵、皮膚、肌肉和血液組織中可檢出FA；經皮染毒后在體內檢測不到惡唑禾草靈及代謝產物。僅CDHB具有明顯的急性毒性，96 h-LC50為30.4 μg·mL-1。蝌蚪外周血紅細胞微核試驗結果顯示，僅在最高劑量組(10 mg·L-1)中，CDHB以及FA的S-異構體和R-異構體均表現出了遺傳毒性，染毒96 h后微核率分別為對照組的1.7倍、2.4倍和2.8倍。

阿特拉津作為一種內分泌干擾物，對兩棲類動物的生殖存在不利影響，在歐洲一些國家已逐漸被其他除草劑所取代。阿特拉津可上調或下調非洲爪蟾(Xenopuslaevis)環狀RNA(circRNA)以及長鏈非編碼RNA(IncRNA)的表達，受阿特拉津影響的RNA主要涉及19條通路[27-28]，這些信號通路與NOD樣受體、緊密連接、過氧化物酶體增殖物激活受體、黏附連接、甘油磷脂代謝和脂肪酸生物合成有關。m6A修飾與mRNA豐度呈正相關，提示m6A可能與兩棲類睪丸發育有關[29]；Hayes等[30]通過2.5×10-3mg·L-1阿特拉津乙醇溶液處理40只雄性爪蟾，染毒期包括了爪蟾幼體期及變態后3 a。方差分析顯示，與溶劑對照組相比，阿特拉津可誘導雄性爪蟾的雌性化，引起睪酮水平降低，生殖腺萎縮，精子生成減少，交配行為抑制及生育能力下降。染毒組中10%的雄性爪蟾具有雄性基因和雌性功能，可與未暴露組的雄性交配產生可存活的卵。這一劑量水平遠低于美國中西部降水中檢測出的水平(0.1 mg·L-1)。模擬環境中阿特拉津的濃度，以0、0.1、1和10 μg·L-1的劑量對繁殖期的成年蟋蟀蛙(Acrisblanchardi)進行染毒，發現0.1 μg·L-1和10 μg·L-1劑量組中雄性個體比對照組分別少51%和55%，即阿特拉津可引起蟋蟀蛙的性別比例失衡，使正常族群中偏向男性的性別比轉為偏向女性，但未發現睪丸卵等性腺結構異常情況，染毒組繁殖率及產蝌蚪數量與對照組無顯著差異[31-32]。Gon?alves等[33]以2.25、4.5、9和18 mg·L-1的阿特拉津對金色小樹蛙(Dendropsophusminutus)染毒96 h，并觀察不同發育階段的遺傳毒性。SCGE檢測結果顯示，各劑量組在前變態期(Gosner發育階段25～33期)及變態后期(Gosner發育階段42～43期)均出現了DNA損傷，呈劑量依賴性。18 mg·L-1劑量的阿特拉津可誘導變態期(Gosner發育階段36～39期)的DNA損傷，但無劑量反應關系。微核試驗結果顯示，各發育階段均出現微核率的升高，與DNA損傷程度呈正相關。

2.2 爬行動物

爬行動物不僅在陸地生態系統中廣泛分布，龜科和鱷科爬行動物也存在于水生生態系統中。一些除草劑可干擾爬行動物的內分泌系統，Vonier等[34]針對美洲短吻鱷(Alligatormississippiensis)的研究顯示，甲草胺及阿特拉津可與17β-雌二醇競爭ERα，從而抑制雌二醇與受體的結合，IC50分別為20.7 μmol·L-1和27.5 μmol·L-1。Bicho等[35]以葡萄牙西北部玉米田中捕獲的37只雄性蜥蜴(Podarcisbocagei)為對象，以協方差分析(overview of analysis of covariance, ANCOVA)法分析實驗數據，發現與甲草胺非暴露區域的蜥蜴相比，甲草胺暴露區域蜥蜴的甲狀腺激素受體表達上調，甲狀腺濾泡面積增大(ANCOVA:F=6.9,P=0.02)；睪丸生精小管直徑有所增大(ANCOVA:F=4.5,P=0.04)，生精細胞層數顯著減小(ANCOVA:F=9.1,P=0.005)。

也有研究利用爬行動物的卵進行遺傳毒性試驗。Schaumburg等[36]以50、100、200、400、800和1 600 μg·卵-1劑量的草甘膦染毒阿根廷黑白泰加蜥(Salvatormerianea)的卵，未觀察到致畸作用。各劑量組的微核率及核異常率與對照組相比無顯著差異，劑量高于100 μg·卵-1時DNA損傷作用顯著增加。Burella等[37]利用草甘膦染毒寬吻凱門鱷(Caimanlatirostris)的卵。寬吻凱門鱷卵的孵化期可分為3個階段，每個階段約23 d，各階段染毒劑量分別為750、1 250和1 750 μg·卵-1，與對照組相比，微核率及核異常率無顯著變化，SCGE檢測結果顯示750 μg·卵-1濃度下即出現DNA損傷，各劑量組與對照組間差異具有統計學意義，而各暴露階段間無顯著性差異。

3 節肢動物與軟體動物(Arthropoda and mollusks)

3.1 節肢動物

溞是水體食物鏈中關鍵的一環，而除草劑對溞的生殖存在不利影響。草甘膦對大型溞(Daphniamagna)的毒性為低毒，其48 h-LC50為151.057 mg·L-1。21 d慢性毒性試驗結果顯示，草甘膦可使大型溞產幼溞的胎數以及數量減少，21 d-LOEC為3.125 mg·L-1，無可觀測效應濃度(no observed effect concentration, NOEC)為1.56 mg·L-1；25 mg·L-1劑量下首次產幼溞時間延后[38]；草甘膦和氰氟草酯對隆線溞(Daphniacarinata)的24 h-LC50分別為66.58 mg·L-1和63.15 mg·L-1，以LC50的1/20和1/10設立劑量組進行染毒，3.33 mg·L-1草甘膦及3.16 mg·L-1氰氟草酯即可引起隆線溞初產齡延后，雄溞百分率增加，幼溞死亡率及母溞產后死亡率升高[39]。

蟹類常被用于評價污染物對水生態系統影響。Canosa等[40]通過體內實驗發現，1 mg·L-1劑量的草甘膦染毒30 d可使顆粒新厚蟹(Neohelicegranulata)體質量增量、肌肉蛋白質水平降低，并通過干擾雄激素的分泌和轉導而抑制精子發生，導致輸卵管的精包中精子數顯著減少，精包的異常率升高。體外實驗中，輸精管與雄激素腺共孵育時，后者可使精子及精包數量增加，而在加入1 mg·L-1草甘膦后這一趨勢完全逆轉。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是一種在我國分布廣泛的淡水蟹類，也是我國研究者選用較多的模式生物。王海玲[41]以0.001、0.01、0.1和1 mg·L-1劑量的阿特拉津染毒中華絨螯蟹，結果顯示，0.1 mg·L-1阿特拉津可誘導中華絨螯蟹的精子組蛋白H3及H4表達上調，H3K79甲基轉移酶基因edot1l-1和edot1l-2表達下調，以及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)活性升高；0.001 mg·L-1劑量組中即觀察到DNA受損的精子，其占比隨著劑量升高而增加。朱杰[42]以0.001、0.01、0.1和1 mg·L-1劑量的阿特拉津染毒中華絨螯蟹，SCGE檢測結果顯示0.1 mg·L-1和1 mg·L-1劑量組出現DNA條帶彌散；經TUNEL檢測發現1 mg·L-1劑量組中DNA損傷程度高于對照；免疫熒光檢測結果顯示，各劑量組生精細胞中出現γ-H2AX蛋白，呈劑量依賴性；經流式細胞儀檢測發現，與對照組相比，1 mg·L-1劑量組的活細胞比例下降58.47%，死細胞比例升高27.30%，即阿特拉津對中華絨螯蟹生精細胞具有毒性作用。劉歡[43]同樣采用了0.001、0.01、0.1和1 mg·L-1的劑量設計，但未觀察到阿特拉津對中華絨螯蟹生精細胞的毒性作用，0.001 mg·L-1阿特拉津即可破壞精子染色質超微結構，導致形態異常，呈劑量依賴性。穆淑梅[44]發現，阿特拉津對中華絨螯蟹的96 h-LC50為>181 mg·L-1，以0.001、0.01、0.1和1 mg·L-1的劑量染毒1歲齡中華絨螯蟹90 d，0.001 mg·L-1劑量組中，卵巢中可觀察到閉鎖卵母細胞；雄性血清睪酮水平下降，雌性血清中雌二醇及孕酮水平上升，隨劑量升高而程度加??；0.01 mg·L-1劑量組雌性血清中孕酮水平下降；0.1 mg·L-1和1 mg·L-1劑量組中精子頂體反應率受抑制，隨作用時間延長程度加??；SCGE檢測未觀察到精子核DNA損傷。

此外，阿特拉津對雌性日本沼蝦的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50分別為134.23、90.24、52.57和46.36 mg·L-1，安全質量濃度(safe concentration, SC)為4.64 mg·L-1，32.0 mg·L-1劑量下卵母細胞出現細胞間隙增大及胞體變性，程度隨劑量增大而加??；阿特拉津對日本沼蝦卵巢LDH具有毒物興奮效應，在低于0.46 mg·L-1劑量下可誘導提高LDH活性，而高于0.46 mg·L-1時顯著抑制LDH活性并表現出劑量效應關系[45]。

3.2 軟體動物

Druart等[46]測定了施用Bypass?和Reglone?-Agral?(R-A)混合物后土壤的預測環境濃度，其中，草甘膦、敵草快和壬基酚的含量分別為3、1.3和0.6 mg·kg-1(土壤)。在該土壤環境以及對照土壤環境下飼養陸生蝸牛(Cantareusaspersus)并對蝸牛進行全生命周期(240 d)生物實驗，方差分析實驗數據，結果顯示，R-A混合物和草甘膦均可促進蝸牛生長，抑制蝸牛繁殖。機制研究表明，R-A混合物可導致雄性蝸牛生殖器外翻，大幅減少交配次數，并延遲雌性蝸牛產卵期20 d；草甘膦可阻礙外環境中蝸牛卵的受精過程，導致生育率的降低。Wilson等[47]利用吡草酮(濃度為1.2～60 mg·L-1)染毒水生蝸牛(Isidorellanewcombi)24 h，并在之后的21 d內監測產卵量和糞便量，發現各劑量組的蝸牛產卵量和糞便量均較對照組有所下降，但差異無統計學意義。Baurand等[48]的研究顯示，草甘膦對陸生蝸牛胚胎孵化的半數效應濃度(EC50)為29.02 mg·L-1。通過隨機擴增多態DNA(PARD)和高分辨率毛細管電泳系統(HRS)檢測了陸生蝸牛胚胎的基因，30 mg·L-1草甘膦染毒的胚胎中觀察到了譜帶的消失及新擴增產物的出現，提示胚胎出現了DNA損傷和寡核苷酸啟動位點的變化，該劑量遠低于推薦葡萄園田間施用量(5 140 mg·L-1)。

Mai等[49]以法國西南部阿卡洪灣的太平洋牡蠣(Crassostreagigas)為對象，以0.01、0.1、1和10 μg·L-1的異丙甲草胺染毒24 h，以海水為對照，DNA損傷本底值為(9.56±0.59)%，非畸胎率為(79.03±2.6)%，0.01 μg·L-1劑量組中，幼體的畸形率及DNA單鏈斷裂率即顯著高于對照，并隨劑量增大而升高，10 μg·L-1時分別達到47.4%和18.3%，且二者存在正相關關系(r2=0.71)；精異丙甲草胺(S-metolachlor)及其代謝產物異丙甲草胺乙烷磺酸(metolachlor ethane sulfonic acid, MESA)和異丙甲草胺苯甲酸(metolachlor oxanilic acid, MOA)染毒24 h后，0.01 μg·L-1的精異丙甲草胺及0.1 μg·L-1的MESA和MOA可引起太平洋牡蠣幼體畸形率及DNA損傷率升高，代謝產物的胚胎毒性和遺傳毒性較原藥弱；0.01 μg·L-1的精異丙甲草胺、0.01 μg·L-1的MOA及1 μg·L-1的MOA可引起雄性牡蠣的精子損傷，其機制與異丙甲草胺和MESA引起氧化應激反應相關蛋白(線粒體SOD和CAT)基因轉錄水平的變化有關[50]。Mantecca等[51]發現百草枯對斑馬貽貝(Dreissenapolymorpha)具有細胞毒性和遺傳毒性，以0.125、0.25和0.5 mg·L-1的百草枯染毒斑馬貽貝，0.25 mg·L-1和0.5 mg·L-1劑量下可觀察到睪丸細胞空泡化、細胞溶解及生發上皮變薄等組織病理學變化，微核試驗結果顯示，貽貝紅細胞的微核自發率為2.75%～0.425%，而染毒組的微核率升高，為3.5%～1.25%。

4 環節動物與線蟲(Annelida and nematoda)

4.1 環節動物

蚯蚓在土壤生態系統中的生物量占比最大，具有位于食物鏈底端以及對于毒物敏感的特點，適合作為檢測土壤污染的指示生物[52]。除草劑可通過皮膚及消化系統進入蚯蚓體內。Li等[53]的研究顯示，10 mg·kg-1的硝磺草酮可誘導赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)體內的氧化應激，SOD、CAT及過氧化物酶(peroxidase, POD)的活性降低，MDA含量顯著增加；SCGE檢測結果顯示10 mg·kg-1的硝磺草酮可引起赤子愛勝蚓的DNA損傷，程度隨時間和劑量增加而加劇。Hackenberger等[54]研究了草甘膦、環磺酮和煙嘧磺隆對蚯蚓(Dendrobaenaveneta)的影響。草甘膦、環磺酮和煙嘧磺隆的環境濃度為2 160、66和30 μg·kg-1土壤干重，劑量設置為環境濃度、1/10環境濃度及1/100環境濃度。試驗觀察到了3種除草劑對蚯蚓體內氧化應激狀態的影響。環境濃度下的草甘膦在染毒7 d時可顯著增加蚯蚓AChE活性；環境濃度下煙嘧磺隆對AChE活性無影響，而在較低的劑量(1/10環境濃度)下染毒28 d可顯著增加AChE活性；6.6 μg·kg-1和66 μg·kg-1劑量的環磺酮染毒7 d可誘導蚯蚓的氧化應激和神經毒性，染毒28 d時66 μg·kg-1劑量組AChE活性恢復至對照水平，而6.6 μg·kg-1劑量組保持不變。暴露28 d后，煙嘧磺隆3 μg·kg-1和30 μg·kg-1劑量組中蚯蚓的繁殖量顯著高于對照組；暴露56 d后，3種除草劑各劑量組中未孵化繭數均顯著低于對照組。Muangphra等[55]的研究顯示，草甘膦和百草枯對蚯蚓(Pheretimapeguana)的48 h-LC50分別為251.45 μg·cm-2和3.9 μg·cm-2，以LC50及其1/10、1/100、1/1 000和1/10 000設立劑量組，微核試驗結果顯示，在≥0.25 μg·cm-2的草甘膦劑量組和≥39×10-5μg·cm-2的百草枯劑量組中，蚯蚓體腔細胞的微核率、雙核率及三核率總數較對照組顯著升高，核異常細胞數與草甘膦或百草枯劑量的相關系數分別為0.69和0.66；SCGE檢測結果顯示，草甘膦無DNA損傷作用，而在≥39×10-2μg·cm-2上的百草枯劑量組中，尾部DNA百分比(TD%)和尾部長度(TL)顯著高于對照組，在3.9 μg·cm-2組中，尾矩也顯著增大。

4.2 線蟲

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)具有子代數目多、發育過程簡單以及生殖系統易于觀察等特點，已在生殖毒性研究中得到廣泛應用[56]。Wang等[57]的研究顯示，草甘膦、銅和砷對秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別為18.5、85.1和130.5 mg·L-1，以LC50的1/1 000、1/100和1/10設立劑量組，各劑量下，草甘膦在單獨應用及分別與砷或銅聯合應用時均可抑制秀麗隱桿線蟲的繁殖，表現出協同作用和劑量反應關系。Pristionchuspacificus(P.pacificus)線蟲已作為秀麗隱桿線蟲的衛星生物應用于毒理學評價中，Zhang等[58]的研究顯示，乙草胺對秀麗隱桿線蟲和P.pacificus的24 h-LC50及48 h-LC50分別為1 296 mg·L-1及5 400 mg·L-1、2.107 mg·L-1及1.264 mg·L-1，據此設立乙草胺劑量為0、2.5、5、10、20、40、80和160 mg·L-1，乙草胺對秀麗隱桿線蟲的繁殖幾乎沒有抑制作用；40～160 mg·L-1劑量下P.pacificus的三代繁殖量較對照組降低。對于繁殖能力的檢測，P.pacificus比秀麗隱桿線蟲更為敏感。

5 人體(Human beings)

在工業生產及農業施用過程中接觸除草劑的人員可能會發生職業暴露，通過分析暴露者的生物樣本及暴露史資料可評價暴露與生殖遺傳之間的聯系。厄瓜多爾北部的農業生產者使用空中噴灑草甘膦的方式控制雜草，Paz-Y-mio等[59]通過SCGE檢測了該區域內24名暴露者和21名對照者，結果顯示，暴露組(彗星尾長35.5 μm)的DNA損傷程度高于對照組(彗星尾長25.94 μm)。Garaj-Vrhovac和Zeljezic[60]研究了多種除草劑的混合物(阿特拉津、甲草胺、氰草津、2,4-D)在生產過程中對工人的遺傳毒性作用，以10名暴露者和20名未暴露者為對象，染色體畸變分析結果顯示，暴露組染色單體和染色體斷裂、雙著絲粒染色體、SCE發生的頻率較高；微核試驗結果顯示，暴露組微核率較高；SCGE檢測發現染毒組的DNA遷移率較高。Barrón Cuenca等[61]對玻利維亞農業人群的調查顯示，暴露于以2,4-D為主的農藥混合物是DNA鏈斷裂的危險因素(比值比(OR)=1.99)。單精子卵胞漿顯微注射(ICSI)是一種人工授精技術，Al-Hussaini等[62]收集了94對接受ICSI治療的夫婦的卵泡液樣本，并檢測其中農藥的含量，丙草胺含量與子宮內膜厚度、獲卵數、受精率及早期胚胎分裂率呈負相關，提示除草劑對ICSI產生不利影響的可能性。

除草劑對男性生殖細胞的影響也受到了研究者的關注。Swan等[63]采集了美國密蘇里州和明尼蘇達州農業區生育年齡男性的尿液和精子，以精液參數較低男性為病例組，以精液參數在正常范圍內的男性為對照組，分析比較尿樣中的除草劑濃度，發現精液參數較低者尿液中甲草胺含量較高(OR=30.0)，阿特拉津含量超出檢出限(OR=11.3)，提示除草劑與男性精液質量降低有關。Lerda和Rizzi[64]對農場中32名施用除草劑的男性進行研究，與正常人群相比，其弱精子癥、死精癥及精子畸形癥水平與尿中2,4-D代謝物水平顯著升高。隨暴露時間的增加，暴露者的弱精子癥和死精癥的水平逐漸降低，而精子畸形癥的水平仍較高。Tan等[65]發現2,4-D可降低體外人類精子的總活力、前向運動力、穿透粘性介質的能力及頂體反應速率，并可阻礙孕酮誘導的獲能，阻礙作用隨劑量增大而增強，即2,4-D的在精漿和卵泡液的積累可能增加不育的風險。孫雪照等[66]針對農藥廠男性工人的研究顯示，乙草胺職業暴露對精液質量存在不利影響，與正常人群相比，職業暴露者精液量減少、精子活力減弱、精子平均路徑速度(VAP)降低，精液pH值下降。Tomenson等[67]收集了美國3家工廠272名除草劑生產工人的精液樣本及相關資料，分析顯示禾草敵的職業暴露與工人精子水平或血清激素水平不存在相關關系，也未觀察到其對生殖結局的影響。

病例對照研究可用于探索子代畸形的可疑危險因素。Ueker等[68]以巴西馬托格羅索州一家醫院5歲以下患兒為對象開展病例對照研究，結果顯示，母親受教育水平低(OR=8.40，95%置信區間(CI)為2.17～32.52)、父親務農(OR=4.65，95%CI為1.03～20.98)及草甘膦等農藥接觸史(OR=4.15，95%CI為1.24～13.66)是子代畸形的危險因素。Meyer等[69]基于地理信息系統(geographic information system, GIS)暴露模式評估尿道下裂與施用農藥之間的關系，以美國阿肯色州354例尿道下裂患兒為病例組，以727例非患兒為對照組，對妊娠6～16周期間受試者家庭500 m范圍內施用農藥劑量進行分類，發現孕期暴露于禾草靈與后代尿道下裂的發生呈正相關(OR=1.08，95%CI為1.01～1.15)；而孕期暴露于甲草胺則與后代尿道下裂的發生呈負相關(OR=1.08，95%CI為1.01～1.15)。Arbuckle等[70]對加拿大安大略省農場的人群研究顯示，孕前的草甘膦(OR=1.7，95%CI為1.0～2.9)及硫代氨基甲酸酯類除草劑(OR=1.8，95%CI為1.1～3.0)的暴露史是孕晚期自然流產的危險因素。Weselak等[71]收集了加拿大安大略省農場家庭的數據，logistic二次回歸分析結果顯示，母親孕前暴露于氰草津(OR=4.99，95%CI為1.63～15.27)和麥草畏(OR=2.42，95%CI為1.06～5.53)與男性后代出生缺陷的風險增加有關。

6 展望(Prospects)

模式生物的定義已不再局限于遺傳學和發育生物學研究中所采用的物種，隨著模式生物所涵蓋的范圍逐漸擴大，自然界中越來越多的物種被用于毒理學研究中。除草劑的生殖和遺傳毒性研究所采用的模式生物，往往也是自然界中受到除草劑影響的非靶標生物，它們在生態系統中的分布以及在食物鏈中的地位有所區別，接觸除草劑的機會及程度也有所不同?，F有的研究多是采用點評估法(point-estimate approaches)，通過前期試驗獲得的急性毒性資料設立染毒劑量，往往不能真實反映生態系統中該生物的除草劑暴露水平，所得的結果也不能直接說明所研究的除草劑對該生物的風險。而采用假設法(hypothesis approaches)開展的試驗，雖然可以直接得出該除草劑的風險，但不能獲得生殖或遺傳毒性的閾值。今后的生殖和遺傳毒性研究設計可以考慮將急性毒性資料與環境資料相結合，試驗動物既是毒理學研究中的模式生物，也是生態系統中的非靶標生物，所得的結果將具有一定的生態毒理學意義。而與生態系統中的動物相比，人類的暴露途徑更為多樣，在除草劑的生產及使用過程中有發生職業暴露的可能，暴露的危害可能更大，而針對人的研究時效性較差。研究者可對稻田、麥田或林場等不同除草劑應用場景中的非靶標生物予以更多關注，以這些動物為模式生物開展生殖或遺傳毒性研究，其結果對于人類的生殖遺傳健康有一定的參考價值。