電化學法檢測芴的細胞毒性

周實，李錦蓮，李秀玲，郭曉玲，張樹萌，武冬梅

佳木斯大學藥學院，佳木斯 154007

芴被世界衛生組織和美國環境保護局列為多環芳烴(PAHs)類化合物大氣暴露的評價指標，它是一種可被人體吸入的神經毒性物質[1]，結構簡單，僅由2個苯環及一個五元環組成，因其揮發性高，具有毒性，且空氣中含量高，被美國環境保護局列為16種優先控制的PAHs之一[2]。芴主要來源于汽車尾氣排放、秸稈燃燒、工業生產，是制備塑料、農藥、樹脂、染料和藥品的重要工業原料[3]。近年由于環境污染，芴逐漸進入人類日常生活領域，甚至在人類的食品中也出現了芴的蹤影，是食品中PAHs類污染物的主要來源。Essumang等[4]對煙熏魚樣品進行檢測發現芴的檢出率高達18%～52%；馬運明等[5]在污水處理廠的入水和回用水中均檢測出較高含量的芴。

研究表明，PAHs類化合物具有“三致效應”，長期接觸PAHs會對人體造成不可逆的損害。近年來，體外試驗[6]成為PAHs對環境和人類潛在風險評估的快速方法，常用的方法有染料排斥法、克隆形成實驗、四唑鹽比色法(MTT)和三磷酸腺苷(ATP)發光試驗，然而這些方法難免需要使用有毒的染色劑、前處理復雜、檢測范圍有限，新興的細胞電化學技術憑借其簡單、快速、靈敏和可即時檢測等優點成為了細胞活性評價的一個可靠方法。2015年，Zhu等[7]利用細胞電化學法評價重金屬類和氯酚類污染物的毒性，發現通過細胞中嘌呤核苷酸代謝過程中嘌呤含量的變化，可以更早檢測到外源物質對細胞的影響，而傳統的MTT法是通過終點變化評價細胞活性的體外試驗，只有在細胞發生死亡時才能檢測到變化，細胞電化學法的靈敏度明顯優于傳統的MTT法。

筆者所在團隊前期研究了V79和BALB/c 3T3這2種細胞的電化學行為及信號來源，其中黃/鳥嘌呤(G/X)的信號相比尿酸(UA)更明顯[8]。因此，本文以黃/鳥嘌呤的電化學信號為定量依據，利用基于石墨烯量子點/玻碳電極(RGOQDs/GCE)的細胞電化學法研究了芴作用下2種細胞核苷酸代謝過程中黃/鳥嘌呤含量的變化，對比芴對2種細胞活性的影響，并與MTT法對比。本研究為PAHs的毒性評價提供了科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

小鼠胚胎成纖維細胞(BALB/c 3T3)購自上海細胞庫(中國)；中國倉鼠肺細胞(V79)購自上海細胞庫(中國)；芴(Flu)購自中國Aladdin公司；黃嘌呤(X)購自美國Sigma公司；鳥嘌呤(G)購自美國Sigma公司；青霉素/鏈霉素混合溶液(penicillin-streptomycin solution)購自北京索萊寶科技有限公司(中國)；胰蛋白酶(C6H15O12P3)購自北京索萊寶科技有限公司(中國)；胎牛血清(FBS)購自上海雙洳生物科技有限公司(中國)；三蒸水為實驗室自制；DMEM培養基(Dulbecco’s modified eagle medium)購自美國Gibco公司；非必需氨基酸(nonessential amino acid)購自北京索萊寶科技有限公司(中國)；其他試劑均為分析純。

恒電位儀(CHI 615，辰華儀器有限公司，中國)；高效液相色譜儀系統(G1311Agilent 1100，安捷倫科技有限公司)；酶聯免疫檢測儀(Multiskan FC，美國Bio Tek公司)；微量移液器(P型，Eppendorf公司，德國)；三重純水蒸餾器(SZ-97，上海亞榮生化儀器廠，中國)；二氧化碳恒溫培養箱(311，美國Thermo公司)；超潔凈工作臺(VS-1300U，蘇州華宇凈化設備有限公司，中國)；玻碳電極(φ=5 mm)、Ag/AgCl/KClsat(R1000)、鉑絲電極(1 mm×10 mm)均購自武漢高仕睿聯科技有限公司(中國)。

1.2 細胞培養與收集

配制10%胎牛血清、1% 100 μg·mL-1青霉素/鏈霉素、1%非必需氨基酸的DMEM培養基，細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。采用原位細胞裂解法[9]進行電化學檢測，每皿細胞的培養基吸去，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗培養皿一次，再加入一定量的PBS，于恒溫水浴鍋中50 ℃原位裂解30 min后進行電化學檢測。

加藥組細胞和對照組細胞分別在含芴和二甲基亞砜(DMSO)的完全培養基中培養，DMSO的含量低于0.1%。

1.3 MTT試驗

將濃度為1×104cells·mL-1的細胞接種于96孔板，每孔200 μL，培養24 h后，加藥組細胞加入含不同濃度芴的培養基，對照組加入含DMSO培養基，空白對照組只加入培養基。培養24 h后，每孔加入20 μL的MTT，培養4 h后棄去培養液，加入DMSO，測定490 nm波長下的吸光度值(A)[10-11]。

細胞毒性公式：

式中：Acontrol、Aexp、Ablank分別為對照組、加藥組和空白對照組吸光度值。

1.4 電化學檢測方法

利用RGOQDs/GCE工作電極、Ag/AgCl/KClsat和鉑絲對電極組成的三電極體系，使用差分脈沖伏安法(DPV)進行電化學檢測，電位范圍0.4～0.9 V。

細胞毒性公式[11]：

式中：ip,control和ip,exp分別為對照組和加藥組細胞裂解液的電流強度。

1.5 高效液相色譜(HPLC)檢測

檢測條件：Ascenis RP-Amide色譜柱(4.0 mm×1 250 mm×15.0 μm)；檢測波長254 nm；柱溫25 ℃；流動相0.02 mol·L-1的KH2PO4溶液(pH 4.9)；流動相流速1.0 mL·min-1；進樣量20 μL。樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣檢測。

1.6 數據處理與分析

文中數據為5次測定結果的平均值±標準偏差。利用Origin 2018軟件作圖，SPSS 20.0軟件處理數據。

2 結果(Results)

2.1 HPLC法確定BALB/c 3T3和V79細胞的電化學信號來源

利用HPLC外標法確定BALB/c 3T3和V79這2種細胞裂解液的電化學信號來源。UA、G和X標準品(圖1 (a))的保留時間分別為8.707、13.730和15.210 min，與BALB/c 3T3細胞裂解液(圖1(b))的保留時間8.755、13.937和15.357 min吻合，與V79細胞裂解液(圖1(c))的保留時間8.788、13.962和15.382 min亦吻合，這說明BALB/c 3T3和V79這2種細胞中均含有UA、G和X這3種物質。

2.2 芴作用時間對BALB/c 3T3細胞的影響

通過考察不同作用時間下1 mmol·L-1芴對BALB/c 3T3細胞G/X氧化峰電流的影響，得到相應的時間-效應關系。圖2(a)為加藥組和對照組細胞的G/X氧化峰電流隨作用時間變化圖，加藥組細胞的G/X氧化峰電流均低于對照組，可能芴的存在抑制了細胞中G/X的產生。加藥組和對照組細胞的G/X氧化峰電流均隨著培養時間的增加而增加，對照組細胞的G/X氧化峰電流培養至30 h后開始降低，可能是培養基中的營養物質消耗殆盡；加藥組細胞的G/X氧化峰電流24 h后呈下降趨勢，且加藥組與對照組細胞的G/X氧化峰電流差值在30 h時最大。由加藥組和對照組細胞的G/X氧化峰電流計算出芴在不同作用時間下的細胞毒性，如圖2 (b)所示，隨著芴作用時間的增加細胞毒性增強，在30 h處達到最大值，為最佳作用時間。

圖1 不同樣品的HPLC圖注：(a) 35 μg·mL-1尿酸(UA)、10 μg·mL-1鳥嘌呤(G)和10 μg·mL-1黃嘌呤(X)混合標準樣品；(b) BALB/c 3T3細胞裂解液， 細胞濃度4×106 cells·mL-1；(c) V79細胞裂解液，細胞濃度4×106 cells·mL-1。Fig. 1 HPLC chromatograms of different samplesNote: (a) the mixture of 35 μg·mL-1 uric acid (UA), 10 μg·mL-1 guanine (G) and 10 μg·mL-1 xanthine (X); (b) BALB/c 3T3 cell suspension, cell concentration 4×106 cells·mL-1; (c) V79 cell suspension, cell concentration 4×106 cells·mL-1.

2.3 芴作用劑量對BALB/c 3T3細胞的影響

通過考察不同劑量芴對BALB/c 3T3細胞G/X氧化峰電流的影響，得到相應的劑量-效應關系，并利用MTT法驗證電化學法的準確性。圖3(a)為不同劑量芴作用下BALB/c 3T3細胞G/X氧化峰電流的變化圖，隨著作用劑量的增加，BALB/c 3T3細胞的G/X氧化峰電流降低，說明隨著細胞培養環境中芴劑量的增加，細胞的嘌呤核苷酸代謝被抑制，BALB/c 3T3細胞的G/X含量減少。由不同劑量芴作用下BALB/c 3T3細胞的G/X氧化峰電流變化得到對應的毒性曲線，半數抑制效應濃度(IC50)值為0.89 mmol·L-1。利用基于RGOQDs/GCE的細胞電化學法得到的毒性曲線與MTT法測得的毒性曲線趨勢一致，如圖3(b)所示，且電化學法測得的IC50值低于MTT法(1.34 mmol·L-1)，說明該電化學法有望成為毒性評價的可靠方法。

圖2 芴作用時間對加藥組和對照組細胞氧化峰電流的影響(a)及與BALB/c 3T3細胞毒性的關系(b)注：嵌圖為0、6、12、18、24、30和36 h對應的電化學曲線圖，細胞接種濃度2.0×105 cells·mL-1。Fig. 2 Effect of culture time on cell oxidation peak currents in the drug group and control group (a) and relationship between fluorene action time and the cytotoxicity to BALB/c 3T3 cells (b) Note: The inset diagram is the corresponding electrochemical curve at 0, 6, 12, 18, 24, 30 and 36 h; cell inoculation concentration is 2.0×105 cells·mL-1.

圖3 不同劑量芴對BALB/c 3T3細胞的氧化峰電流的影響(a)以及電化學法和MTT法檢測芴 對BALB/c 3T3細胞的毒性比較(b)注：嵌圖為0～3.8 mmol·L-1芴作用下對應的電化學曲線圖；細胞接種濃度2.0×105 cells·mL-1；芴作用時間30 h。Fig. 3 Effect of fluorene at different doses on the oxidation peak currents of BALB/c 3T3 cells (a), and cytotoxicity curves of fluorene acted on BALB/c 3T3 cells by the electrochemical method and MTT assay (b)Note: The inset diagram is the corresponding electrochemical curve at 0～3.8 mmol·L-1 concentration of fluorene; cell inoculation concentration is 2.0×105 cells·mL-1; fluorene-treated time is 30 h.

PAHs的細胞毒性并不強，在體外細胞實驗中需要加入代謝活化系統，PAHs被細胞加氧酶分解生成的環氧化物、二酮等化合物的細胞毒性較強。顧祖維[12]利用微核試驗對苯并[a]芘、黃曲霉毒素、聯苯胺、3-甲基膽蒽和N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍等致癌物的遺傳毒性進行研究發現，BALB/c 3T3細胞不加入代謝活化系統，其自身就能代謝這些物質而顯現出明顯的遺傳毒性。Colacci等[13]研究了3-甲基膽蒽和苯并[a]芘的對BALB/c 3T3 A31-1-1細胞的“三致效應”，發現不需要加入代謝活化系統，2種化合物就有較強的致癌作用。因此，對芴的BALB/c 3T3細胞毒性效應評價時，不僅考慮芴的作用，還要考慮芴在細胞中發生代謝后產物的毒性作用。

圖4 芴作用時間對加藥組和對照組細胞氧化峰電流的影響(a)及與V79細胞毒性的關系(b)注：嵌圖為0、6、12、18、24、30和36 h對應的電化學曲線圖，細胞接種濃度2.0×105 cells·mL-1。Fig. 4 Effect of culture time on cell oxidation peak currents in the drug group and control group (a) and relationship between fluorene action time and the cytotoxicity to V79 cells (b) Note: The inset diagram is the corresponding electrochemical curve at 0, 6, 12, 18, 24, 30 and 36 h; cell inoculation concentration is 2.0×105 cells·mL-1.

圖5 不同劑量芴對V79細胞的氧化峰電流的影響(a)以及電化學法和MTT法檢測芴對V79細胞的毒性比較(b)注：嵌圖為0～1.5 mmol·L-1芴作用下對應的電化學曲線圖；細胞接種濃度2.0×105 cells·mL-1；芴作用時間30 h。Fig. 5 Effect of fluorene at different doses on the oxidation peak currents of V79 cells (a), and cytotoxicity curves of fluorene acted on V79 cells by the electrochemical method and MTT assay (b)Note: The inset diagram is the corresponding electrochemical curve at 0～1.5 mmol·L-1 concentration of fluorene; cell inoculation concentration is 2.0×105 cells·mL-1; fluorene-treated time is 30 h.

2.4 芴作用時間對V79細胞的影響

考察不同作用時間下0.3 mmol·L-1芴對V79細胞G/X氧化峰電流的影響，進而得到相應的時間-效應關系。圖4(a)為加藥組和對照組細胞的G/X氧化峰電流隨作用時間變化圖，加藥組細胞的G/X氧化峰電流均低于對照組，可能芴的存在抑制了細胞中G/X的產生。對照組細胞的G/X氧化峰電流隨著培養時間的增加而增加，培養至30 h后開始降低，可能是培養基中的營養物質消耗殆盡；而加藥組細胞的G/X氧化峰電流在初期呈下降趨勢，6 h后隨著培養時間的增加而增加，培養至30 h后開始降低，且加藥組與對照組細胞的G/X氧化峰電流差值在30 h時最大。由加藥組和對照組細胞的G/X氧化峰電流計算出芴在不同作用時間下的細胞毒性，如圖4(b)所示，隨著芴作用時間的增加細胞毒性增強，在30 h處達到最大值，為最佳作用時間。

2.5 芴作用劑量對V79細胞的影響

考察不同劑量芴對V79細胞G/X氧化峰電流的影響，并利用MTT法驗證電化學法的準確性，得到芴的V79細胞劑量-效應關系。圖5(a)為不同劑量芴作用下V79細胞G/X氧化峰電流的變化圖，當芴的作用劑量為0.010 mmol·L-1時，細胞的G/X氧化峰電流明顯下降，說明少量的芴便影響了細胞的嘌呤核苷酸代謝；隨著芴作用劑量的增加，V79細胞的G/X氧化峰電流降低，說明隨著細胞培養環境中芴劑量的增加，細胞的嘌呤核苷酸代謝被抑制，V79細胞的G/X含量減少。由不同劑量芴作用下V79細胞的G/X氧化峰電流變化得到對應的毒性曲線，IC50值為0.25 mmol·L-1。利用基于RGOQDs/GCE的細胞電化學法得到的毒性曲線與MTT法測得的毒性曲線趨勢一致，如圖5(b)所示，且電化學法測得的IC50值低于MTT法(0.86 mmol·L-1)，說明電化學法的靈敏度高于MTT法。劉云崗等[14]在對青石棉的細胞毒性研究中發現，青石棉對V79細胞的毒性要強于BALB/c-3T3細胞。由于不同類型細胞的代謝途徑不同，使得芴作用下2種細胞的IC50值有一定的差異，芴對V79細胞毒性的IC50值更小，說明芴對V79細胞的毒性更強。

3 討論(Discussion)

本文研究了芴對BALB/c 3T3和V79這2種細胞毒性的時間-效應和劑量-效應，利用基于RGOQDs/GCE的細胞電化學法測得的IC50值為0.89 mmol·L-1和0.25 mmol·L-1，MTT法測得的IC50值為1.34 mmol·L-1和0.86 mmol·L-1。2種方法測得的BALB/c 3T3細胞的IC50值均大于V79細胞的IC50值，說明芴對V79細胞的毒性更強；電化學法測得的IC50值要小于MTT法測得的IC50值，說明電化學法的靈敏度要更高一些。p53基因具有基因調節作用并參與DNA修復、細胞周期阻滯、凋亡等，而具有基因毒性的PAHs類物質會激活細胞中的p53基因進而影響細胞周期。Chramostová等[15]通過研究PAHs對不同細胞的影響發現，由于細胞類型不同，在G1期阻滯、S期延長或細胞凋亡等方面有一定差異，所示不同細胞在代謝產物上也不同。