重組人金屬硫蛋白-Ⅲα短肽對UVB致HaCaT細胞氧化損傷的緩解作用

甘俊英，孫左義，秦建新，原海亮，李強，薛玉英,*

1. 環境醫學工程教育部重點實驗室，東南大學公共衛生學院，南京 210000 2. 馬鞍山市疾病預防控制中心，馬鞍山 243000 3. 蘇州匯涵醫用科技發展有限公司，常熟 215500 4. 常熟市市場監督管理局，常熟 215500

隨著環境中污染物的增加，大氣層破壞導致紫外線輻射對人類健康的損傷十分嚴重，超氧化物侵襲超過機體耐受程度，最終出現炎癥、衰老及代謝調節功能的紊亂，甚至誘發基因突變和癌癥[1]。對抗氧化和由脂質過氧化反應引起的疾病研究，已成為人類對健康的新追求[2]。中波紫外線(ultraviolet B, UVB)是造成皮膚損傷的主要光譜，其引起的皮膚光損傷主要通過氧化應激反應產生過多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，導致細胞發生凋亡及細胞氧化損傷，從而引起皮膚光老化，誘發皮膚癌[3]，多年來，研究者們致力于尋求一種天然無毒的防曬修復劑。

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是一類分子量較低、富含半胱氨酸的金屬結合性蛋白，在生物體內分布廣泛[4]，其具有的清除自由基功能，可有效降低機體氧化損傷水平[5]，提示MT可用來預防和治療UVB輻射造成的光氧化損傷。但內源性MT的抗氧化損傷作用有限，隨著氧化損傷的積累，超過機體耐受臨界值之后，MT應答效應逐漸減弱，因此研究者們開始關注外源性補充MT的抗氧化損傷作用研究。

MT可從動植物組織中提取[6-8]，但由于來源不足、純度不高等原因，在一定程度上阻礙了MT的發展，相對于這種方法，基因工程制備的MT[9]純度高，性能更加穩定，使人源MT走向商品化成為可能。本試驗用重組人金屬硫蛋白Ⅲα短肽(recombinant human metallothionein Ⅲα, rh-MT-Ⅲα)，由蘇州匯涵醫用科技發展有限公司利用基因工程制備，與完整MT比較，具有分子量更低，更易被吸收特點。這種rh-MT-Ⅲα在基因序列上與動植物中提純的MT相比具有更高生物相容性，與內源性完整MTα域在結構和巰基含量基本一致。由于rh-MT-Ⅲα屬于新物質，目前尚未有其毒性評價及功能相關研究，若能較完整地闡述和確證外源性補充這種新rh-MT-Ⅲα的安全性及抗氧化功能，將有望替代化學防曬劑。

在前期研究rh-MT-Ⅲα對細胞及線蟲的毒性效應的基礎上[10]，利用體外化學共浴方法研究rh-MT-Ⅲα對自由基清除功能并計算出IC50(rh-MT-Ⅲα對自由基清除率達50%時所需的濃度)，同時建立UVB損傷細胞模型，選用人類皮膚毒性評價常用模型HaCaT細胞，經UVB損傷處理后，加入不同濃度rh-MT-Ⅲα繼續培養24 h后檢測細胞存活率、細胞形態、細胞凋亡及細胞內ROS水平，從細胞水平上初步研究rh-MT-Ⅲα的抗光氧化損傷作用，為其作為化學防曬替代提供實驗參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑儀器與細胞來源

1.1.1 材料與試劑

rh-MT-Ⅲα由蘇州匯涵醫用科技發展有限公司提供，商品名為重組人巰基短肽，利用大腸桿菌基因工程高密度發酵并純化獲得的人源金屬硫蛋白Ⅲα亞基片段，分子量3.7 kD，每分子蛋白含游離巰基6個，蛋白SDS-PAGE純度≥98%。

DMEM高糖培養液(美國Gibco公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(博士德生物工程有限公司)，噻唑藍(MTT)(美國Sigma公司)，活性氧試劑盒(碧云天生物公司)，細胞凋亡試劑盒(美國BD公司)，分析純無水乙醇(南京晚晴生物有限公司)，1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH)(合肥博美生物科技有限公司)。

1.1.2 主要儀器

3423型CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)；Biobase生物安全柜(中國博科控股集團有限公司)，FSX型生物圖像導航儀(日本Olympus公司)，5424R型離心機(德國Eppendorf公司)；Epoch型酶標儀(美國Bio Tek公司)；MVS-1型渦旋混合器(北京金紫光科技發展有限公司)；5424R型離心機(德國Eppendorf公司)；BS-210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；MilliQ Advantage型超純水系統(美國密理博公司)；UV1780紫外分光光度計(日本島津公司)；UVB燈管(313 nm模擬太陽光老化，購自北京中儀商城)；FV3000激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；BD FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)

1.1.3 實驗細胞

HaCaT細胞是非腫瘤來源的人正常皮膚永生化角質形成細胞株，與正常人角質形成細胞分化特性相似，可以繁殖150代以上。HaCaT細胞購自上海名勁生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

染毒液配制：使用超純水配制不同濃度rh-MT-Ⅲα溶液(25、50、100、200和400 μg·mL-1)，現配現用。

80 μg·mL-1DPPH溶液配制：稱取DPPH粉末10 mg，加入無水乙醇定容至125 mL，制得DPPH溶液備用。

1.2.2 實驗劑量與程序

體外自由基清除試驗：實驗方法參照文獻[11]并略作修改。向1.5 mL DPPH溶液中，分別加入1.5 mL不同濃度的rh-MT-Ⅲα溶液(25、50、100、200和400 μg·mL-1)，對照組加入同體積超純水，混勻，室溫避光靜置30 min后，利用紫外分光光度計在517 nm條件下測定吸光度值(OD)，每劑量組設3個平行。按公式計算自由基清除率(K)，K(%)=(1-Ax/A0)×100%，式中：Ax為樣品測定管OD值，A0為空白測定管OD值。計算IC50以評價rh-MT-Ⅲα體外清除自由基能力。

UVB誘導HaCaT細胞損傷模型的構建：將UVB燈管垂直置于UVB照度計上方，調整燈管高度至輻照強度為100 μW·cm-2，固定燈管。選取對數生長期、生長狀態良好的HaCaT細胞，調整細胞懸浮液濃度為1×105個·mL-1，分別接種于96孔板(每孔0.2 mL)中，每組設3個平行，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養12 h后，棄去原培養液，加入200 μL PBS覆蓋，置于UVB燈管正下方分別處理1、2、3、4和5 min，完全培養基為空白對照，含細胞避光處理組(錫箔紙蓋住)為陰性對照。處理結束后，緩慢吸去PBS，加入完全培養基200 μL，于培養箱中繼續培養24 h后，依據MTT法檢測各組細胞存活率，依據細胞存活率來確定UVB模型輻照劑量。細胞存活率(%)=[(Ax-Ak)/A0]×100%，式中：Ax為各UVB處理組吸光度值，Ak為空白對照組吸光度值，A0為避光對照組吸光度值。

建立的UVB模型：依據前期rh-MT-Ⅲα細胞毒性結果，在400 μg·mL-1劑量時，乳酸脫氫酶釋放實驗結果顯示，rh-MT-Ⅲα對HaCaT細胞膜造成了明顯的損傷，低于此劑量時未觀察到明顯毒性。選用不同濃度(25、50、100和200 μg·mL-1)rh-MT-Ⅲα處理經UVB輻照的細胞，繼續培養24 h后，從細胞存活率、細胞形態、細胞凋亡率及細胞內ROS含量各指標與避光對照組和單一UVB處理組進行比較，評價rh-MT-Ⅲα在細胞水平上的抗氧化損傷作用。

細胞內ROS觀察：(1)激光共聚焦顯微鏡觀察ROS。處理結束后，棄去原培養液，PBS緩慢清洗2遍。按照活性氧檢測試劑盒說明書，用無血清的DMEM培養液將DCFH-DA探針按1∶1 000比例稀釋，混勻后加入到激光共聚焦小皿中，每孔0.5 mL，37 ℃細胞培養箱內處理20 min。孵育結束后，將探針液吸出，用不含血清的培養液洗2遍，再用PBS洗2遍，最后向每孔加入1 mL PBS，放置生物導航儀下觀察并拍照。

(2)流式細胞儀檢測ROS。染毒結束后，棄去原培養液，PBS洗2遍，加入0.25%胰酶消化細胞，完全培養基終止消化，將細胞轉移到1.5 mL離心管中，1 000 rmin-1離心5 min。離心結束后，棄上清，加入1 mL PBS，緩慢吹打混勻，1 000 rmin-1離心5 min，離心后，重復PBS清洗一次。按照活性氧檢測試劑盒說明書，用無血清的DMEM培養液將DCFH-DA探針按1∶1 000比例稀釋混勻，加入到含處理好細胞的1.5 mL離心管中，每管1 mL，混勻，37 ℃孵育20 min，期間每隔3 min顛倒混勻一下。孵育結束后，用PBS洗3次，以充分去除未進入細胞的DCFH-DA探針，最后加入500 μL PBS懸浮細胞，用流式細胞儀在Ex/Em=488 nm/525 nm波長下進行檢測。

1.2.3 數據處理

采用SPSS Statistics 22.0軟件進行數據分析，多組之間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。兩組之間比較，若符合方差齊性，則采用LSD-t檢驗方法，若方差不齊，則采用Games-Howell檢驗方法。實驗數據均以mean±SD表示，檢測水平為P<0.05差異有統計學意義。

利用SPSS軟件計算rh-MT-Ⅲα清除DPPH自由基的IC50。計算步驟參照文獻[12]：(1)建立SPSS數據集，包括劑量組、清除率和總數等；(2)按要求計算好的實驗數據輸入，總數均填100；(3)根據順序點擊，Analyze→Regression→Probit→將劑量組導入Covariates，清除率導入Response frequency，總數導入匯總Total，Transform點擊選擇Log based 10→選擇Model Probit→OK，從而計算出IC50及其95%置信區間。

2 結果(Results)

2.1 體外自由基清除率結果

DPPH是研究體外自由基清除的主要材料[13]，在乙醇中是一種穩定的自由基，溶液呈紫色，于517 nm處顯示最大吸收峰。當DPPH遇到質子供體物質，例如抗氧化劑，顏色從紫色變為黃色，隨后吸光度降低[14]，由此可測定化學物質的自由基清除能力。利用紫外分光光度計在517 nm測得吸光度值，按照1.2.2中的公式計算rh-MT-Ⅲα對DPPH清除率，結果如圖1所示，隨著rh-MT-Ⅲα劑量的增加，其對DPPH自由基的清除率逐漸增加，由SPSS軟件計算出rh-MT-Ⅲα對DPPH自由基的清除率達到50%時的濃度為184.23 μg·mL-1(P>0.05)，模型擬合度好。IC50的95%置信區間為151.00～230.90 μg·mL-1。

2.2 UVB誘導HaCaT細胞氧化損傷模型構建

不同UVB輻照劑量對HaCaT細胞存活率影響測定結果如表1所示，隨著UVB輻照時間的增加，HaCaT細胞存活率降低，與避光對照組存活率相比，3、4和5 min處理組顯著降低(P<0.05)?？紤]模型生物學意義，去除與避光對照組無差異的1 min和2 min(該輻照劑量下，細胞損傷不明顯)和細胞損傷過于嚴重的4 min和5 min (該輻照劑量下，細胞損傷大，一定程度上會弱化受試物的抗氧化作用，不利于觀察受試物真實的抗氧化能力)，選定模型UVB輻照時間為3 min，輻照強度為100 μW·cm-2。

2.3 rh-MT-Ⅲα對UVB致HaCaT細胞氧化損傷的抗氧化作用研究

2.3.1 細胞存活率

HaCaT細胞經UVB處理后，利用不同濃度(25、50、100和200 μg·mL-1) rh-MT-Ⅲα繼續培養24 h后，測得細胞存活率結果如圖2所示。結果顯示，與避光對照組相比，UVB處理后細胞存活率均有所下降，隨著rh-MT-Ⅲα濃度的升高，各UVB+rh-MT-Ⅲα處理細胞存活率呈現先增高后略有降低，在50 μg·mL-1和100 μg·mL-1劑量下與避光對照組無顯著差異。尤其在100 μg·mL-1時，細胞存活率較單一UVB處理組細胞存活率顯著升高。

圖1 重組人金屬硫蛋白Ⅲα短肽(rh-MT-Ⅲα)對 1,1-二苯基-2-苦苯肼(DPPH)自由基的清除率Fig. 1 The free radical scavenging rate on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) by recombinant human metallothionein Ⅲα peptide (rh-MT-Ⅲα)

表1 不同UVB輻照劑量對HaCaT細胞存活率 影響(mean±SD, n=3)Table 1 The effect of different dose of UVB on viability of HaCaT cells (mean±SD, n=3)

圖2 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT 細胞存活率的影響注：與避光對照組相比，*P<0.05；與單一UVB處理組相比， # P<0.05；-表示不含有，+表示含有。Fig. 2 The effect of rh-MT-Ⅲα on viability of HaCaT cells after exposed to the UVBNote: Compared with the negative control group, *indicates significant differences at P<0.05 level; compared with the single UVB group, # indicates significant differences at P<0.05 level; - means contained; + means not contain.

2.3.2 細胞形態學結果

經處理完成后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細胞形態學的影響，結果如圖3所示。經UVB處理后，與避光對照組相比，單一UVB組細胞連接不緊密，細胞變圓，單個視野可見細胞數明顯減少。在25～100 μg·mL-1劑量下，隨著rh-MT-Ⅲα濃度的增加，細胞形態較UVB組逐漸改善，細胞連接逐漸緊密，呈鋪路石狀，單個視野可見細胞數明顯增加，在100 μg·mL-1時尤為明顯。在高濃度時，這種改善作用有所降低。

2.3.3 細胞凋亡率

處理結束后，利用流式細胞儀檢測HaCaT細胞凋亡率，結果如圖4和圖5所示，與避光對照組相比，UVB處理后細胞凋亡率均有所上升，隨著rh-MT-Ⅲα濃度的增加，細胞凋亡率呈現先降低后略有升高趨勢。在100 μg·mL-1劑量下，細胞凋亡率較單一UVB處理組顯著降低(P<0.05)，與避光對照組差異無統計學意義。

2.3.4 活性氧檢測結果

激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內ROS的含量情況如圖6所示。與避光對照組相比，經UVB處理后的細胞熒光強度增加。與單一UVB處理相比，rh-MT-Ⅲα處理后細胞熒光強度減弱，在50 μg·mL-1及100 μg·mL-1劑量下細胞熒光強度顯著降低。

流式細胞儀檢測細胞內ROS含量結果如圖7和圖8所示，與避光對照組相比，單一UVB及UVB+rh-MT-Ⅲα(25 μg·mL-1和200 μg·mL-1)組細胞ROS含量顯著增加，UVB+rh-MT-Ⅲα(50 μg·mL-1和100 μg·mL-1)組細胞ROS略有增加，但無統計學意義。與單一UVB劑量組相比，除25 μg·mL-1劑量組外均顯著降低。UVB+rh-MT-Ⅲα處理組細胞ROS含量隨著rh-MT-Ⅲα劑量的增加，呈現先降低后略有升高的趨勢，且在100 μg·mL-1時顯著降低，恢復至正常水平。

圖3 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細胞形態的影響(400×)注：(a)避光對照組；(b)單一UVB處理組；(c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα。Fig. 3 Effect of rh-MT-Ⅲα on morphology of HaCaT cells after exposed to the UVBNote: (a) negative control group; (b) single UVB expose group; (c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα.

圖4 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細胞凋亡率的影響注：FITC/PI表示流式細胞儀熒光通道；(a)避光對照組；(b)單一UVB處理組；(c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα。Fig. 4 Effect of rh-MT-Ⅲα on atoposis of HaCaT cells after exposed to the UVBNote: FITC/PI represents flow cytometer fluorescence channel; (a) negative control group; (b) single UVB expose group; (c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα.

圖5 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后HaCaT細胞凋亡率影響注：與避光對照組相比，*P<0.05；與單一UVB處理組相比， # P<0.05；-表示不含有，+表示含有。Fig. 5 Effect of rh-MT-Ⅲα on atoposis of HaCaT cells after exposed to the UVBNote: Compared with the negative control group, *indicates significant differences at P<0.05 level; compared with the single UVB group, # indicates significant differences at P<0.05 level; - means contained; + means not contain.

3 討論(Discussion)

DPPH在實驗體系中為穩定自由基，其含有以氮為中心的吸電子基團，體系呈紫色，在517 nm可見光下出現強烈吸收峰。向體系中加入受試物，如果受試物能夠清除DPPH，則吸光度值降低，表明其具有清除氧自由基作用，該實驗方法簡捷、重復性好[15]。依照加入rh-MT-Ⅲα后體系吸光度的改變，可間接判斷rh-MT-Ⅲα是否具有清除自由基功能及其功能大小。實驗結果表明，rh-MT-Ⅲα對DPPH自由基具有清除作用，其半數清除率濃度為184.23

圖6 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細胞活性氧(ROS)含量的影響(400×)注：(a)避光對照組；(b)單一UVB處理組；(c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα。Fig. 6 Effect of rh-MT-Ⅲα on reactive oxygen species (ROS) content of HaCaT cells after exposed to the UVB (400×)Note: (a) negative control group; (b) single UVB expose group; (c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα.

圖7 流式細胞術檢測rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細胞ROS含量的影響注：FITC/Count為流式細胞儀熒光通道；(a)避光對照組；(b)單一UVB處理組；(c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα。Fig. 7 Effect of rh-MT-Ⅲα on ROS content of HaCaT cells after exposed to the UVB by flow cytometryNote: FITC/Count represents flow cytometer fluorescence channel; (a) negative control group; (b) single UVB expose group; (c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα.

圖8 流式細胞術檢測rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后 HaCaT細胞ROS含量的定量影響注：與避光對照組相比，*P<0.05；與單一UVB處理組相比， # P<0.05；-表示不含有，+表示含有。Fig. 8 Effect of rh-MT-Ⅲα on ROS content of HaCaT cells after exposed to the UVB by flow cytometryNote: Compared with the negative control group, *indicates significant differences at P<0.05 level; compared with the single UVB group, # indicates significant differences at P<0.05 level; - means contained; + means not contain.

μg·mL-1。本實驗結果與前人的研究結果存在差異[16-17]，已有研究者采用鋅合金屬硫蛋白(Zn-MT)及酵母源金屬硫蛋白Ⅰ和Ⅱ，研究MT對DPPH自由基清除能力，并獲得IC50約為58 μg·mL-1，遠低于184.23 μg·mL-1。金屬硫蛋白主要有4種異構體，MT-Ⅰ、MT-Ⅱ主要分布于哺乳動物器官如肝、腎組織中，MT-Ⅲ主要分布于中樞神經系統，MT-Ⅳ主要在皮膚和胃腸道上部表達。本研究所用材料為人源大腸桿菌發酵所得的金屬硫蛋白Ⅲα短肽，分析研究結果相差較大的主要原因可能有兩方面：一是不同來源及不同亞型的MT在功能方面存在原始差異；二是完整MT包含α和β這2個結構域，其巰基含量遠大于只含α結構域的MT短肽，從而造成其功能上的差異。不同制備方式及MT成品純度在一定程度上，也會對其功能產生影響。對于rh-MT-Ⅲα與不同亞型及來源的完整MT抗氧化能力的差異機制探索及比較，有待進一步研究。

紫外線主要有3種波長范圍：長波紫外線(ultraviolet A, UVA)、UVB和短波紫外線(ultraviolet C, UVC)，波長為280～320 nm的中波紫外線是致人體皮膚光氧化損傷的主要光譜[18]。長期的紫外線輻射，尤其是中波紫外線還可引起皮膚角質形成細胞分泌一系列的炎癥因子，誘導各種皮膚病甚至是皮膚癌的發生[19-21]。體外自由基清除實驗表明，rh-MT-Ⅲα具有較強的自由基清除能力，提示其可能存在抗UVB氧化損傷的作用。我們建立了以細胞為基礎，UVB為處理因素的評價rh-MT-Ⅲα抗氧化損傷功能的模型。結果表明，單一UVB(強度為100 μW·cm-2)處理HaCaT細胞后，隨著輻照時間的增加，細胞存活率隨之降低，表明細胞損傷越嚴重，依據細胞存活結果及損傷修復生物學意義，選定輻照時間為3 min (59.39%±12.01%)，此劑量下既可以觀察到UVB對細胞的損傷，又可以減少過度損傷導致弱化rh-MT-Ⅲα抗氧化損傷的功能，使觀察結果更具可靠性。

UVB輻射使機體內自由基含量增加，超出機體耐受范圍后產生氧化損傷，而氧化損傷的發生常伴有ROS含量的異常升高，如果ROS生成量超過機體的耐受水平，則會導致應激損傷，破壞遺傳大分子及關鍵蛋白質，從而導致衰老與疾病的發生[22]。ROS是細胞代謝不可避免的產物[23]，UVB輻照后可通過直接作用和間接作用產生大量的ROS。UVB模型處理的HaCaT細胞，再經不同濃度(25、50、100和200 μg·mL-1)rh-MT-Ⅲα處理后，在25～100 μg·mL-1劑量下細胞存活率呈上升趨勢，且在100 μg·mL-1劑量下，細胞存活率顯著高于單一UVB染毒組。細胞形態、細胞凋亡和活性氧含量指標與細胞存活率結果一致，均在100 μg·mL-1劑量下顯著改善，與單一UVB處理組細胞相比，100 μg·mL-1劑量組細胞連接更加緊密，細胞凋亡率及活性氧含量均顯著降低，這些結果表明，rh-MT-Ⅲα具有抗氧化損傷功能，且在100 μg·mL-1劑量下作用顯著，可使細胞恢復至正常水平。這種作用在高劑量下有所減弱，結合前期細胞毒性評價研究，考慮是隨著rh-MT-Ⅲα劑量的增加，其對細胞膜的損傷作用越來越明顯，在安全有效劑量(考慮在100～200 μg·mL-1)之間，但需要進一步研究來確證)內，其抗氧化作用隨著劑量的增加而增強，一旦超過安全劑量，rh-MT-Ⅲα對于細胞膜的損傷削弱了其抗氧化損傷作用，從而導致抗氧化損傷作用在高劑量時降低。ROS含量從側面反映了氧化損傷水平，未來需進一步探討氧化損傷程度指標，如丙二醛含量、谷胱甘肽含量以及抗氧化損傷基因的表達量等。

研究首先探索了不同濃度rh-MT-Ⅲα對DPPH自由基的體外清除能力，繼而通過構建UVB損傷HaCaT細胞模型，研究不同濃度rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的細胞各生物學終點的影響，在細胞水平上驗證了rh-MT-Ⅲα抗氧化損傷功能，為天然防曬劑探索提供了實驗數據支持。