69例室間隔缺損胎兒遺傳學檢測及隨訪觀察

胡輝 ，沈雙雙 ，藍小芳 ，張向東 ，徐夏苑 ，靳春雷 ，雷永良 ，劉姣 *

（1.麗水市婦幼保健院，浙江 麗水 323000；2.金華市婦幼保健院，浙江 金華 321000）

室間隔缺損（VSD）是兒童最常見的先天性心臟?。–HD），占新生兒心臟畸形的25%～30%，患病率1.7%～3.0%[1]。目前已知染色體非整倍體和染色體拷貝數變異（CNV）可導致CHD[2]，但上述病因與輕微先天性心臟?。ㄈ鐔渭冃蚔SD）之間的關聯無法確定。染色體微陣列分析（CMA），如單核苷酸多態性微陣列分析（SNP array），可同時檢測全基因組水平上染色體異常和亞微觀基因組失衡，已被推薦用于胎兒結構異常的遺傳學一線檢測[3]。本研究應用傳統的染色體G顯帶核型分析聯合SNP array分析VSD胎兒遺傳學病因，并觀察VSD胎兒的妊娠結局及預后，旨在探討VSD的遺傳學病因及CMA技術在VSD胎兒中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月-2019年12月經產前診斷中心超聲診斷為VSD 69例胎兒，其中麗水市婦幼保健院43例，金華市婦幼保健院26例。納入標準：（1）產前超聲診斷為VSD胎兒；（2）孕婦及家屬均對研究知情。排除標準：（1）孕婦有遺傳性疾病家族史；（2）孕婦合并嚴重妊娠期疾病或接觸不良環境者；（3）臨床資料不完整者；（4）配合度低，難以隨訪及完成數據收集者。根據“是否合并其他心臟結構異?！狈譃閱渭冃蚔SD組（33例）和非單純型VSD組（36例），后者包括法洛氏四聯癥8例、合并肺動脈狹窄6例、合并房間隔缺損4例、完全性房室間隔缺損3例、合并三尖瓣返流3例及合并其他畸形12例。兩組妊娠期間均無感染、嚴重妊娠期高血壓及糖尿病等病史。兩組孕婦年齡、胎兒孕周差異均無統計學意義（P>0.05）。詳見表1。本研究經上述兩家醫院各自倫理委員會審批通過，且婦知情同意。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

組別 n 年齡（歲） 孕周單純型 VSD 組 33 28.5±8.3 24.3±6.5非單純型 VSD 組 36 27.8±9.2 24.2±7.1

1.2 方法 對所有胎兒進行染色體核型分析和SNP array檢測，根據接受產前診斷的孕周分別通過羊水路徑、臍血路徑獲取胎兒樣本，并收集胎兒父母外周血備用。分析候選致病基因并對生產結局和胎兒發育情況進行隨仿。記錄是否合并心臟外結構異?；虺曑浿笜水惓?，包括NT異常、單臍動脈、脈絡膜囊腫等。

1.2.1 染色體分析 （1）染色體核型分析。孕26周以下在無菌條件下抽取20mL羊水，采用胰蛋白酶消化法常規行羊水細胞培養、收獲、制片，G顯帶；孕26周以上取1～2mL臍血標本接種培養、收獲、制片、G顯帶，顯微鏡下計數20個細胞，如果發現性染色體異常應加倍計數，如懷疑嵌合體，則加數到100個細胞，分析5個核型。（2）CMA。①基因組DNA提?。翰捎玫聡鳴iagen DNA試劑盒提取羊水、臍血或外周血基因組DNA。②CMA檢測：采用美國Affymetrix公司的SNP array檢測平臺和Cyto Scan 750 K芯片檢測的標準操作流程，分別進行基因組DNA的消化、連接、擴增、純化、片段化、標記、雜交、洗滌及掃描，應用ChAS軟件進行數據分析。檢測 CNV 依據 DGV、OMIM、UCSC、DECIPHER 等公共數據庫進行比對分析，同時依據CNV檢測出性質，分成致病性CNV、可能致病CNV、臨床意義不明CNV（VOUS）、可能良性CNV與良性CNV。由于樣本量限制，本研究將可能致病CNV、臨床意義不明 CNV及可能良性 CNV歸類于 VOUS，對VOUS胎兒父母外周血樣本進一步行SNP array檢測，明確胎兒CNV來源以協助判斷CNV的性質。比較兩組染色體核型異常情況，以及致病性CNV、VOUS、良性CNV與未發現CNV的構成情況。

1.2.2 候選基因的篩選 使用以下標準：（1）在正常胎兒心臟組織和細胞系中有蛋白表達。使用Proteomics DB 數據庫（https://www.proteomicsdb.org/）、Eurexpress數據庫（http://www.eurexpress.org/ee/）、小鼠基因組信息學數據庫中的基因表達數據庫（http://www.informatics.jax.org/expression.shtmL）；（2）參與心臟系統發育相關通路的基因和心血管系統發育過程中富集的基因。使用Netpath數據庫（http://www.netpath.org/）；（3）有先天性心臟病相關基因的文獻；（4）小鼠基因組信息數據庫中顯示心血管表型異常的基因；（5）基因劑量敏感性查詢。使用ClinGen數據庫（https://dosa ge.clinicalgenome.org/index.shtmL）、ExAC 數 據 庫 （http://exac.broadinstitute.org）。

1.2.3 隨訪情況 （1）引產情況。觀察并記錄所有胎兒妊娠結局和引產數。（2）合并心外異常情況。（3）VSD自然閉合。1周歲前復查幼兒心臟超聲，比較兩組幼兒VSD自然閉合情況。（4）發育情況。1周歲時，依據《WHO兒童生長發育標準（2006年版）》[4]行體格發育評估，包括頭圍、體質量、身高。其中一項小于同性別、同年齡兒童中位數減2個標準差評為“體格發育落后”。運用《0-6歲兒童神經心理發育量表》[5]進行智力評估，從大運動、精細動作、適應能力、語言、社交行為五個方面進行評估，計算發育商（DQ），DQ＜70，評為“智力低下”。比較兩組體格發育落后和智力發育落后的情況。

1.3 統計學處理 統計學分析采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計數資料以百分率表示，組間差異比較采用χ2檢驗或Fisher’s檢驗。

2 結果

2.1 遺傳學檢測 69例VSD的胎兒中，10例（14.5%）染色體核型異常，其中染色體數目異常7例（18-三體綜合征4例、21-三體綜合征3例），染色體結構異常3例，兩組染色體數目及結構異常比較差異無統計學意義（P＞0.05），其余59例行CMA分析，發現兩組致病性 CNV、VOUS、良性 CNV檢出率差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 兩組室間隔缺損胎兒的遺傳學檢測結果[n（%）]

2.2 CMA分析

2.2.1 染色體核型結構異?；純篊MA分析 3例核型結構異常片段的大小及精確位點，其中1例（編號1）染色體異常片段包含Wolf-Hirshhorn綜合征的關鍵區域；1例（編號3）染色體異常片段包含1q43-q44缺失綜合征的關鍵區域。詳見表3。

表3 染色體核型結構異常VSD胎兒CMA結果

2.2.2 染色體結構正?；純篊MA分析 核型正常的VSD胎兒中檢測出CNV 11例（15.9%），其中7例通過父母驗證發現2例來源于母親；11例中致病性 CNV 5例（7.2%），VOUS占4例（5.8%）；良性CNV有2例（2.9%）。致病性CNV中4例為已知的微缺失/微重復綜合征（16p13.11微缺失綜合征、DiGeorge綜合征、22q11.2遠端缺失綜合征、1p36缺失綜合征），另1例致病性CNV丟失片段大于10Mb，缺失片段包含多個已知致病基因。詳見表4。

表4 染色體核型結構正常檢出CNV胎兒CMA結果

2.3 候選基因的篩選 本文分析了與CHD相關的致病性CNV中以顯性方式發揮作用的基因，通過基因功能富集分析篩選出7個CHD候選基因，其 中 TBX1、CRKL、DGCR6、MAPK1 位 于 22q11.2區段上；PRDM16、SKI、MYH11 分別位于 1p36.32、1p36.33-p36.32、16p13.11區段上。詳見表5。

表5 CHD候選基因

2.4 隨訪及預后 69例VSD胎兒中共24例引產，非單純型VSD組引產率52.8%（19/36）明顯高于單純型VSD組15.2%（5/33），差異有統計學意義（P<0.05）。合并心外異常率兩組差異無統計學意義（P>0.05）。非單純型VSD組17例胎兒分娩并存活，單純型VSD組28例胎兒分娩并存活；隨防至幼兒1周歲，VSD自然閉合者單純型VSD組占10例（30.3%），非單純型VSD組占2例（5.6%），單純型VSD組自然閉合率高于非單純型VSD組，差異有統計學意義（P<0.05）。1周歲時幼兒體檢共發現體格發育落后3例，智力發育落后2例，兩組體格、智力發育落后情況比較差異均無統計學意義（P>0.05）。 詳見表 6。

表6 兩組隨訪情況[n（%）]

3 討論

高達90%的18-三體綜合征患者合并CHD，其最常見的心臟缺陷類型為間隔缺損和動脈導管未閉[6]。在21-三體綜合征患者中，VSD發生率為14%～27%[7]。本研究中經染色體核型分析也發現，最易合并VSD的非整倍體異常為18-三體綜合征和21-三體綜合征。與傳統的核型分析相比，CMA在檢測和識別CNV方面均具有較高的準確性和分辨率，越來越多的研究推薦將CMA用于CHD產前診斷[8]。利用CMA檢測可進一步明確染色體核型結構異常片段的大小及精確位點。本研究明確1號病例和3號病例染色體結構異常片段分別包含Wolf-Hirshhorn綜合征和1q43-q44缺失綜合征的關鍵區域。在核型正常的胎兒中CMA額外檢測出核型無法識別的16p13.11微缺失綜合征、DiGeorge綜合征、22q11.2遠端缺失綜合征，進一步證明這些微缺失、微重復綜合征也是VSD的重要遺傳學病因，通過父母驗證有助于致病性的判定及明確致病性CNV的來源。CMA額外提高7.2%VSD病因檢出率，提示該技術適用于VSD的遺傳學病因診斷。本研究結果顯示單純型VSD組較非單純VSD組核型數目及結構異常率無顯著性差異。非單純VSD組致病性CNV較單純型VSD無增加，結果與鄧瓊等[9]研究一致。

研究發現，全基因組CNV可影響基因的劑量水平或改變基因功能，與CHD密切相關[10]。由于CNV可改變多個連續基因的劑量，不僅導致CHD，還可引起其他臟器的發育異常。通過數據庫和文獻檢索分析致病性CNV中包含的基因，綜合分析基因單倍劑量敏感性、基因在人體和動物模型中的定位及文獻報道基因功能等資料有助于CHD候選基因的篩選。本研究共發現7個CHD候選基因。病例5為22q11.2片段缺失導致的DiGeorge綜合征，該病臨床表型包括CHD、顱面部畸形、神經系統障礙、胸腺發育不良或缺如等。DiGeorge綜合征患者中CHD的發病率約為60%～80%[11]，最常見的CHD類型為法洛氏四聯癥，而VSD是法洛氏四聯癥的缺陷之一。22q11.2區段包含50多個基因，其中與心臟細胞增殖發育有關的TBX1基因是以往研究的焦點，被認為是該病最主要的致病基因。近年來越來越多報道顯示，除了TBX1以外，CRKL、DGCR6也是導致22q11.2缺失綜合征患者心臟表型的重要病因。TBX1+/-，CRKL+/-的復合雜合變異小鼠通常會出現更嚴重的心臟缺陷[12]，表明TBX1和CRKL基因可能存在相互作用，共同影響心臟發育。在雞模型研究中，發現逆轉錄病毒介導的反義轉導對神經嵴細胞DGCR6的抑制導致了與DGS相似的嚴重心血管異常的高發，提示DGCR6可能作為TBX1的轉錄調節因子而發揮作用[13]。病例6為22q11.2遠端缺失綜合征，以往研究顯示本病最常見的CHD類型為VSD，位于LCR22-4和LCR22-5之間的MAPK1基因被認為是引起心臟發育異常的致病基因[14]。在馬凡綜合征小鼠模型中，MAPK1被激活，而通過選擇性抑制MAPK1激活可改善小鼠主動脈生長[15]。1p36缺失綜合征和16p13.11微缺失綜合征所缺失片段中包含的PRDM16[16]、SKI[17]及MYH11[18]基因，上述基因在動物實驗中被證實為參與心臟發育的劑量敏感基因，可能是CHD的候選基因，部分可能與VSD發育有關，具體機制有待進一步研究。本研究顯示，CMA檢測較傳統的核型分析可明確染色體異常片段的大小及精確位點。并可通過基因富集和路徑分析來了解CNV及相關基因與心臟發育的潛在相關性，初步篩選出CHD潛在的候選基因。

隨訪結果顯示，兩組合并心外異常率無差異，而非單純VSD組引產率較單純VSD組增加，可能因非單純VSD合并其他嚴重的心臟畸形，增加了預后不良的風險，影響孕婦繼續妊娠的信心。研究結果顯示，1歲內單純型VSD自然閉合率達30.3%，可見部分室間隔延遲閉合可能屬于正常的變異。以往認為VSD對患兒出生后體格發育有較大的影響，而本研究發現，僅3例VSD患兒體格發育落后，可能與醫療水平的發展、VSD得到及時修補、生活衛生環境的改善等綜合因素有關。本研究中兩組各1例出現智力發育落后情況，說明VSD患兒有合并智力低下的可能，其機制有待進一步研究。

存在VSD的胎兒應進一步分析其染色體情況并行CMA檢查，明確是否合并致病基因型，加強隨訪，為產前診斷提供更準確的依據。