酒莊生產廢水灌溉對綠化帶土壤微生物群落的影響

李明 鄭蘭香

摘要：為制定酒莊生產廢水灌溉的可行性、安全性標準提供理論依據，以寧夏回族志輝源石（ZHYS）、銀色高地（YSGD）、沃爾豐（WEF）、米擒（MQ）4個酒莊生產廢水灌溉區綠化帶土壤為研究對象，以清水灌溉區為對照，分析酒莊生產廢水灌溉對綠化帶土壤微生物群落與土壤理化性質的影響，以及廢水灌溉區土壤理化性質和微生物群落之間的關系。廢水灌溉后，4個酒莊土壤的pH值均升高，部分酒莊綠化帶土壤全鹽、有機質含量較對照組升高，而全磷、速效鉀、速效磷含量降低。對土壤微生物群落結構的分析表明：廢水灌溉使米擒和志輝源石酒莊土壤的香農（Shannon）和Chao1指數降低。2種水質灌溉下，優勢種群均為變形菌門（Proteobacteria），其次是酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其含量分別為26.34%～39.77%、18.77%～31.24%、4.45%～13.13%;廢水灌溉抑制了土壤中變形菌門、酸桿菌門、放線菌門微生物的生長，促進了土壤中擬桿菌門（Bacteroidetes）微生物的生長。從屬水平變化來看，廢水灌溉降低了Gp4、Gp6在米擒和志輝源石酒莊的相對豐度，分別降低14.65%、19.69%和17.54%、10.99%。廢水灌溉降低了芽單胞菌屬（Gemmatimonas）在沃爾豐、銀色高地、志輝源石酒莊綠化帶土壤的相對豐度，分別降低23.95%、7.63%、29.67%;提高了Aridibacter的相對豐度，分別提高30.33%、13.44%、6.58%和24.24%。廢水灌溉提高了米擒、沃爾豐、銀色高地酒莊綠化帶土壤中Gp7的相對豐度，分別提高5.56%、24.32%、61.54%。堿解氮含量、電導率、速效鉀含量、全磷含量、pH值是影響綠化帶土壤微生物群落的主要環境因子。在嚴格把控廢水水質指標的情況下，用酒莊生產廢水灌溉綠化帶土壤是可行的。

關鍵詞：土壤微生物;生產廢水;酒莊;綠化帶;群落;理化性質

中圖分類號： S154.3;X703? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0228-08

收稿日期：2021-03-15

基金項目：寧夏回族自治區重點研發計劃（編號：2019BBF02024）;西夏區科技局科研項目。

作者簡介：李 明（1980—），女，寧夏中衛人，博士，副研究員，主要從事土壤修復相關研究。E-mail：lm_y096@126.com。

通信作者：鄭蘭香，博士，教授，碩士生導師，主要從事污水處理與節水灌溉技術相關研究。E-mail：zhenglx@nxu.edu.cn。

我國2018年年用水總量為6 015.5億m3，其中農業用水量占61.4%[1]，淡水資源短缺，環境問題日益嚴重，減少農業用水量勢在必行。工農業生產用水緊張，我國北方地區分布較多干旱區域，水資源短缺成為限制農業發展的主要因素，通常采用污水灌溉、節水措施來補充農田灌溉用水不足的問題[2]。廢水灌溉是目前的研究熱點和難點，污水處理技術日益成熟，處理后的污水達到國家灌溉水質要求后可用于灌溉農田、草地園林等。污水灌溉既是污水的資源化利用，也是緩解水資源匱乏的有效措施[3]?；瘜W需氧量（COD）在10 000 mg/L以上的葡萄酒廢水，屬于高濃度有機廢水，采用單一的工藝無法使出水達標，國內外一般采用組合工藝處理葡萄酒廢水[4]。

目前，相關研究多集中在城市生活污水、農產品加工廢水、農村生活用水、養殖廢水、農業生產廢水對土壤養分、微生物群落的影響等方面，這類污水的氨氮和COD含量較高，多環芳烴、重金屬等有毒有害物質在水中含量較少，適用于農業灌溉[4-8]。但是，關于酒莊廢水灌溉后對土壤各項指標的影響，尤其是對土壤微生物群落影響的相關研究較少。土壤微生物被認為是最有潛力的敏感性生物指標之一[9]。土壤綜合肥力指數隨著微生物多樣性指數的升高呈上升趨勢。因此，研究酒莊生產廢水灌溉對綠化帶土壤微生物群落結構與土壤理化性質的影響具有重要意義。污水灌溉不僅會造成土壤污染，且污水中含有的N、P等營養元素，回灌后也會影響土壤養分含量，對土壤微生物及土壤酶活性產生一定的刺激作用。焦志華等研究發現，再生水灌溉會使大豆根際土壤中有機質、有效磷含量增加，使土壤酶活性發生改變，同時再生水也會對大豆根際土壤中細菌及真菌數量造成一定的影響[4]。

寧夏回族自治區作為我國葡萄酒生產核心地區之一，優質水資源稀缺，而每年灌溉葡萄以及葡萄酒生產榨季的需水量很大。酒莊生產廢水的大量排放不僅造成區域環境污染，而且造成大量水資源的浪費。酒莊生產廢水對環境有2個方面的效應：一方面，廢水中含有大量的營養元素，這些元素是植物生長所必需的，如果根據相關水質要求對酒莊生產廢水進行處理，合理灌溉不僅能夠改善土壤環境、提高土壤肥力，而且還可以通過促進土壤微生物的繁殖來影響植物的生長;另一方面，由于葡萄酒生產廢水含有高濃度的有機污染物，未經處理而直接排放會對環境造成嚴重的污染，廢水散發臭味且高色度，須經過一定處理達到國家排放的標準后方才可以排放。本研究采用經過處理后的廢水灌溉綠化帶土壤，測定并分析土壤的細菌群落和土壤理化性質的變化規律，從而探究酒莊廢水處理后灌溉綠化帶對土壤質量的影響，以期為酒莊生產廢水再利用安全風險評估指標提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

研究區域屬于溫帶大陸性氣候，處于銀川平原西部邊緣。土壤以礫石土為主，還有風沙土、灌淤土以及未被開墾的戈壁荒灘，土壤貧瘠，有機質含量低，透水性較強，土壤持水量低，降水量為150～240 mm。本研究以寧夏賀蘭山東麓米擒（MQ）、沃爾豐（WEF）、銀色高地（YSGD）、志輝源石（ZHYS）4個酒莊綠化帶土壤為研究對象，同時以酒莊生產廢水灌溉區和清水灌溉綠化帶土壤為對照，分析生產廢水灌溉對綠化帶土壤各項指標的影響。綠化帶灌溉為滴灌，酒莊生產廢水經一定措施處理后進行灌溉，對照灌溉區則一直采用清水進行灌溉。酒莊基本信息及其生產廢水水質指標如表1、表2所示。寧夏米擒、沃爾豐、銀色高地、志輝源石4個酒莊總排口廢水監測到的各項指標均符合GB 5084—2021《農田灌溉水質標準》的要求。因此，酒莊總排口廢水水質適于灌溉。

1.2 土壤樣品采集及預處理

2019年9月分別采集4個酒莊的生產廢水灌溉區和正常灌溉區的土壤，采樣之前鏟除土壤表面的雜草和草根，每塊采樣地選取有代表性的樣點采集10～30 cm深度的土壤。在同一酒莊進行多點采樣后充分混合，分成2個部分裝入無菌密封袋中，一部分土樣保存于4 ℃冰箱中用于測定土壤微生物多樣性，另一部分在室內進行風干處理，揀去土樣中的雜物，用0.25 mm和1 mm的篩網分離土壤，裝入密封袋用于土壤理化性質的測定。

1.3 土壤理化性質測定

土壤pH值采用pH計測定（土水比為 1 g ∶2.5 mL），全鹽含量采用電導率測定，堿解氮含量采用堿解擴散法測定，重鉻酸鉀容量法（外加熱法）測定有機質含量，凱氏定氮法測定全氮含量，用HClO4-H2SO4鉬銻抗比色法測定全磷含量，NaHCO3浸提法測定速效磷含量，乙酸銨浸提法測定速效鉀含量[10-11]。

1.4 土壤DNA提取

采用的是DNA試劑盒（MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit）提取土壤樣品總DNA。DNA片段大小用濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[11-13]。

1.5 Illumina HiSeq測序及數據分析

本研究選取細菌的16S rRNA V4區基因片段進行檢測，引物為515F/806R（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。聚合酶鏈式反應（PCR）體系如下：15 μL 高保真聚合酶（New England Biolabs生產）、0.2 μmol/L正反引物、10 ng DNA模板[11，13]。PCR產物檢測回收后進行后續分析。

高通量測序由上海生工Illumina HiSeq 2500平臺運行，所測目標片段長度為250～300 bp[11-13]。原始數據（Tags數據）經所測得原始序列截去條形碼序列和引物序列后，經FLASH（V1.2.7）拼接獲得。通過軟件QIIME處理過濾原始數據獲得高質量Tags數據，并與數據庫進行比對檢測嵌合體序列，獲得有效數據。對有效序列進行聚類分析，利用RDP classifier（v2.2）軟件[12-16]與Greengenes數據庫進行物種注釋，以獲得土壤樣品中細菌群落的多樣性信息。

土壤微生物主要進行的是定性分析，即土壤微生物多樣性指數分析、微生物群落在門水平的變化分析、微生物群落在屬水平的變化分析、聚類分析、微生物群落在門水平相對豐度與土壤環境因子的冗余度排序分析（RDA）。微生物多樣性指數分析用來反映微生物群落的多樣性，指數越大表明群落的復雜程度也越高;可從門、屬水平來分析微生物群落構成差異。經過RDA可以檢測土壤環境、樣品、群落結構之間的關系。

1.6 數據處理

采用SPSS 25.0軟件進行差異顯著性分析;微生物群落在門、屬水平用物種豐度柱形堆積圖來表示，用R的gplots package軟件進行分析;微生物群落在門水平相對豐度與環境因子相關性分析，采用RDA法，所用軟件同上。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

如表3所示，4個酒莊的土壤pH值為9.30～9.58，屬于典型的堿性土壤。各酒莊生產廢水灌溉土壤的pH值均略高于清水灌溉。除了銀色高地酒莊（YSGD）之外，其他3個酒莊廢水灌溉土壤與清水灌溉土壤pH值差異顯著（P<0.05）。除志輝源石酒莊（ZHYS）和沃爾豐（WEF）之外，其他2個采樣地廢水灌溉土壤電導率高于清水灌溉;其中，米擒（MQ）、銀色高地（YSGD）廢水灌溉區土壤電導率分別比清水灌溉高38.78%和7.87%。速效鉀含量在廢水灌溉土壤中均明顯低于清水灌溉區;其中，沃爾豐（WEF）、志輝源石（ZHYS）廢水灌溉土壤速效鉀含量分別顯著低于清水灌溉區23.53%和30.81%（P<0.05）。廢水灌溉區土壤速效磷含量均低于清水灌溉區;其中，沃爾豐（WEF）與志輝源石（ZHYS）廢水灌溉區速效磷含量分別低于對照組19.0%和5.8%。廢水灌溉的大部分土壤中全磷含量均低于清水灌溉區，其中志輝源石酒莊（ZHYS）廢水處理土壤全磷含量高于清水灌溉55.32%。米擒酒莊（MQ）與沃爾豐（WEF）酒莊廢水灌溉土壤有機質含量高于清水灌溉土壤31.29%和3.45%（P<0.05）;在銀色高地（YSGD）和志輝源石（ZHYS）廢水灌溉土壤有機質含低于清水灌溉區，其中志輝源石酒莊（ZHYS）與CK土壤有機質含量差異顯著。米擒酒莊（MQ）廢水灌溉土壤堿解氮含量最高，為17.03 mg/kg，高于對照組73.78%，其他3個酒莊土壤堿解氮含量差異不顯著。

2.2 土壤細菌多樣本聚類分析

在聚類分析中，樣本之間的距離以樹枝長度表示，當樣本聚集到一起時其相似度越高。如圖1所示，將相似性標準值定位0.8，樣本可分成2類：一類是米擒酒莊（MQ、MQ_CK），另一類是志輝源石、沃爾豐、銀色高地酒莊（ZHYS_CK、ZHYS、WEF_CK、WEF、YSGD_CK、YSGD）。廢水灌溉與清水灌溉使得銀色高地酒莊（YSGD、YSGD_CK）土壤細菌群落結構的差異較大，其他酒莊的2種水灌溉對土壤細菌群落影響較小。

2.3 土壤微生物多樣性指數

微生物群落多樣性指標包括香農指數（Shannon）、Chaol、辛普森指數（Simpson）及分類操作單元（OTU），常被用于評價土壤微生物功能多樣性，它們的指數越高，表明樣品中的物種多樣性程度越高。如表4所示，OTU數目在米擒酒莊（MQ）廢水灌溉處理中最低;在志輝源石酒莊（ZHYS）廢水灌溉的土壤中OTU數目顯著少于清水灌溉處理。在米擒（MQ）和志輝源石酒莊（ZHYS）土壤廢水灌溉處理中Shannon指數低于清水灌溉，且在米擒酒莊（MQ）廢水灌溉的土壤細菌群落多樣性最低。在米擒（MQ）和志輝源石（ZHYS）酒莊土壤廢水灌溉處理中Chao1指數低于清水灌溉，且在米擒酒莊（MQ）用廢水灌溉的土壤細菌群落多樣性最低;Simpson指數在米擒酒莊（MQ）廢水灌溉土壤中達到最大值，在WEF、YSGT采樣地Simpson指數與CK沒有顯著差異。

2.4 土壤微生物群落門相對豐度分析

由圖2可知，4個酒莊廢水灌溉和正常水灌溉土壤中的細菌群落結構由變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）等42個微生物群落構成。

變形菌門的相對豐度最高，占26.34%～39.77%，其次是酸桿菌門和放線菌門，分別占18.77%～31.24%、4.45%～13.13%。與對照相比，廢水澆灌處理使得變形菌門的相對豐度在沃爾豐（WEF）和志輝源石（ZHYS）酒莊土樣中分別增加21.65%、8.82%。酸桿菌門相對豐度在米擒（MQ）、銀色高地（YSGD）、志輝源石（ZHYS）酒莊廢水灌溉土樣中較對照組分別降低13.48%、9.03%、9.18%。放線菌門的相對豐度在米擒（MQ）、沃爾豐（WEF）、銀色高地（YSGD）酒莊廢水灌溉土樣中較對照組分別降低31.75%、5.26%、33.37%。廢水灌溉下，擬桿菌門的相對豐度在米擒（MQ）、沃爾豐（WEF）、銀色高地（YSGD）酒莊相對于清水灌溉增加45.07%、4.40%、9.38%。

2.5 土壤微生物群落屬相對豐度分析

由圖3可知，與對照相比，廢水灌溉降低了Gp4在米擒（MQ）、志輝源石（ZHYS）酒莊的相對豐度，分別降低14.65%、19.69%;廢水灌溉降低了Gp6在米擒（MQ）、銀色高地（YSGD）、志輝源石（ZHYS）酒莊的豐度，分別降低了17.54%、37.28%、10.99%。廢水灌溉提高了鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）在米擒（MQ）和志輝源石（ZHYS）酒莊的相對豐度，分別提高173.76%和3.06%。廢水降低了芽單胞菌屬（Gemmatimonas）在沃爾豐（WEF）、銀色高地（YSGD）、志輝源石（ZHYS）酒莊的相對豐度，分別降低23.95%、 7.63%、 29.67%。廢水灌溉提高了

Aridibacter在4個酒莊土壤的相對豐度，分別提高30.33%、13.44%、6.58%和24.24%。廢水灌溉提高了Gp7在米擒（MQ）、沃爾豐（WEF）、銀色高地（YSGD）酒莊土壤中的相對豐度，分別提高5.56%、24.32%、61.54%，未鑒別的屬相對豐度差異不大。

2.6 冗余度分析

如圖4所示，在志輝源石（ZHYS）酒莊，土壤pH值（P=0.02）、全氮含量（P=0.04）顯著（P≤0.05）影響廢水灌溉土壤微生物群落結構，土壤堿解氮（AN，P=0.05）、有機碳含量（SOC，P=0.01）、電導率（EC，P=0.002）顯著影響清水灌溉土壤微生物群落結構（圖4-A）;在米擒酒莊（MQ），土壤堿解氮含量（P=0.05）、有機碳含量（P=0.04）、pH值（P=0.05）顯著影響廢水灌溉土壤微生物群落結構，土壤速效鉀含量（AK，P=0.001）顯著影響清水灌溉土壤微生物群落結構（圖4-B）;在銀色高地（YSGD）酒莊，土壤堿解氮含量（P=0.01）顯著影響廢水灌溉土壤微生物群落結構，全磷（TP，P=0.02）、速效鉀（P=0.008）、有機碳含量（P=0.05）顯著影響土壤微生物群落結構（圖4-C）;在沃爾豐酒莊（WEF），土壤pH值（P=0.006）顯著影響廢水澆灌土壤微生物多樣性，電導率（EC，P=0.001）、速效鉀（AK，P=0.01）、全氮含量（TN，P=0.05）顯著影響清水灌溉土壤微生物群落結構（圖 4-D）。廢水灌溉和清水灌溉下，土壤堿解氮（P=0.002）、速效鉀（P=0.01）、全磷（P=0.03）含量、電導率（P=0.001）、pH值（P=0.03）對細菌群落結構產生的影響較大（圖4-E）。

3 討論

土壤理化性質是評價土壤肥力的重要指標。pH值是土壤重要的基本性質，會影響土壤的肥力狀況，并且對土壤微生物的活動也有顯著的響應。本研究表明，廢水灌溉后土壤的pH值升高。已有的研究通過用再生水灌溉草坪進行不同時間長短的比較試驗，結果表明：長期灌溉二級水和三級水，在一定程度上會引起土壤pH值的升高[13]。也有研究發現再生水灌溉園林綠化灌木，證實土壤pH值在灌溉處理前后變化并不顯著[14]。這表明，不同水質標準、不同試驗植物品種、不同灌溉時間等對土壤pH值的影響變化程度不一定相同[15]。本研究發現，除了米擒和志輝原石酒莊以外，其他酒莊廢水灌溉對土壤電導率的影響不顯著。Beltrao等研究表明，再生水灌溉的時間越長，土壤的電導率或全鹽量逐漸積累最終必然會導致鹽化產生[16]。因此，在鹽漬化土壤廣泛分布地區，如果長期采用廢水灌溉應該防止土壤鹽分積累的現象發生。

土壤氮素和磷素含量在不同的灌溉區均表現出不同的趨勢。也有研究顯示，土壤全氮和全磷含量在各處理間無顯著差異，分析原因可能是不同地區廢水中氮、磷元素的殘余量存在差異[16]。本研究中，廢水灌溉區土壤速效鉀、速效磷、全磷（除ZHYS外）含量均低于清水灌溉區，這與以往研究不同，大量研究結果表明，再生水灌溉后可以增加土壤的養分含量，再生水灌溉可為綠地土壤提供持久的、低劑量的速效養分[13];這可能是與該地區污水處理工藝有關，在今后利用酒莊廢水灌溉中應注意對再生水氮、磷、鉀元素及土壤速效養分的監測。

在本研究中土壤有機質含量在部分酒莊土壤中有積累的現象，這與已有的研究結果相似，長期污水灌溉可顯著提高土壤耕層的有機碳含量[17]。本研究中酒莊土壤有機質含量變化無規律可循，這可能是由于廢水灌溉時間較短引起的。

在研究廢水灌溉對綠化帶土壤微生物群落結構的影響中，微生物多樣性各指數表現出不同的特征，在所有采樣地中廢水灌溉使得WEF和YSGD的Shannon、Chaol指數增加，使MQ和ZHYS的Simpson指數增加。趙加瑞研究表明，農村混合污水灌溉處理使土壤細菌和真菌的 Shannon指數、Chaol指數、ACE和Coverage指數增加，Simpson指數降低，污水灌溉可增加土壤細菌整體活性[18]，這與本研究得出結論不同，可能有以下原因：一是本次研究區域使用廢水灌溉6年左右，有學者研究了30年灌溉周期對土壤的影響[19]，本次研究所選取的試驗地灌溉周期較短，應對水質和土壤同時進行長期監測;二是灌溉方式、土壤質量不同。研究證實微生物豐富度及多樣性與土壤綜合肥力指數具有極顯著相關性[20]，土壤肥力隨微生物多樣性提高而提高[21]，因此推測本研究中的廢水與清水相比較，缺乏植物和土壤微生物生長所需的營養元素，應注意補充。

在2種水灌溉下，優勢種群均為變形菌門，其次是酸桿菌門和放線菌門，分別占26.34%～39.77%、 18.77%～31.24%、4.45%～13.13%，盡管采樣的地點不同，但各樣點間相距不遠，因此處于相同生態環境中的微生物類群具有相似性。李橋的研究中，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門的序列總和占全部序列的67.28%，這些微生物為優勢菌種[22]。研究表明，土壤微生物群落結構對廢水再利用的響應不僅只基于個別微生物種群的響應，同時也基于種群間的群體響應[23]。

在本研究中廢水灌溉使得變形菌門的相對豐度在沃爾豐（WEF）和志輝源石（ZHYS）酒莊土壤中增加，這說明廢水灌溉通過增加有益菌屬的相對豐度，促進土壤中氮元素轉化的有關過程。同時，土壤理化性質結果顯示堿解氮含量在廢水灌溉的沃爾豐（WEF）和志輝源石（ZHYS）酒莊土壤中較清水灌溉土壤中含量低。酸桿菌門可以降解植物殘體、單碳化合物，增加土壤肥力[24]，酸桿菌門的活性受到污水抑制，碳循環過程受到抑制，其中在米擒（MQ）、銀色高地（YSGD）、志輝源石（ZHYS）酒莊對其抑制作用較強;在本研究中放線菌門的相對豐度在米擒（MQ）、沃爾豐（WEF）、銀色高地（YSGD）酒莊廢水灌溉土壤中較對照組分別降低，因此放線菌門生長受到抑制，從而有機物礦化受到抑制，降低土壤營養元素，這與以往的研究結果[25]一致，志輝源石（ZHYS）酒莊的廢水灌溉能促進土壤放線菌生長。

從細菌群落在門水平相對豐度與環境因子的分析表明，細菌群落受到電導率、速效鉀含量、堿解氮含量的顯著影響。RDA顯示代表鹽分的電導率是影響微生物群落重要的土壤因素。鹽分增加并不利于微生物生存，土壤含鹽量增加使土壤酶、土壤生物活性指標明顯降低，并導致土壤生物功能結構發生顯著變化，土壤生物功能多樣性指數下降。因此，酒莊生產廢水灌溉綠化帶植物是可行的，但要做好廢水水質的監測，要做到使植物正常生長的同時又能高效安全利用地表廢水資源。

4 結論

（1）酒莊廢水灌溉土壤的pH值和部分土壤電導率都比清水灌溉區高，因此本研究中土壤鹽堿成分的含量增大，分析其可能的原因是清洗發酵罐時會加入大量的堿，推測廢水中的堿殘留是導致廢水灌溉土壤 pH值升高的原因，因此酒莊生產廢水灌溉土壤要重點防止發生土壤次生鹽堿化。

（2）廢水灌溉區土壤速效鉀、速效磷、全磷含量（除ZHYS外）均低于清水灌溉區，酒莊廢水灌溉后土壤綜合肥力呈現了小幅度下降。

（3）廢水灌溉使得微生物多樣性的Shannon指數在2個酒莊的樣品中降低。2種水質灌溉下，優勢種群均為變形菌門、酸桿菌門和放線菌門。廢水灌溉在一定程度上抑制了細菌群落多樣性。相同的采樣地中的微生物群落相似性較高。酒莊廢水灌溉改變了綠化帶土壤中細菌在屬水平上各物種的相對豐度。

（4）堿解氮含量、電導率、速效鉀含量、pH值、全磷含量是影響土壤微生物群落結構的主要環境因子。

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