嘉寶果果皮多酚提取工藝優化及生物活性測定

林寶妹 邱珊蓮 吳妙鴻 張帥 李海明 洪佳敏

摘要：以嘉寶果果皮為原料，在單因素試驗的基礎上采用L9（34）正交試驗設計，優化嘉寶果果皮多酚提取工藝，并測定提取物清除·OH、DPPH·和ABTS+自由基的能力以及體外對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。結果表明，嘉寶果果皮多酚提取的最佳工藝為乙醇體積分數70%、時間50 min、溫度70 ℃、料液比1 g ∶50 mL，此條件下嘉寶果果皮多酚的提取率可達10.10%。優化提取后的嘉寶果果皮提取物對·OH、DPPH·和ABTS+自由基的EC50值分別為0.506、0.052、0.437 mg/mL，對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50值分別為0.003、1.348 mg/mL，說明嘉寶果果皮具有良好的抗氧化及體外降糖活性，可作為功能活性成分開發應用。

關鍵詞：多酚;嘉寶果;正交試驗;抗氧化;降糖活性

中圖分類號： S663.901;TS255.36? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0191-05

收稿日期：2021-03-22

基金項目：福建省公益類科研院所專項（編號：2019R1030-4）;福建省自然科學基金（編號：2020J01141638）。

作者簡介：林寶妹（1988—），女，福建漳州人，碩士，助理研究員，主要從事天然產物化學研究。E-mail：yogobm@qq.com。

通信作者：邱珊蓮，博士，副研究員，主要從事天然產物化學研究。E-mail：slqiu79@163.com。

嘉寶果（Myrciaria cauliflora）為桃金娘科常綠灌木，是巴西當地一種常見的可食用漿果，年產量可達5 000 t，目前在福建、廣東、廣西等多省均有種植[1-2]。嘉寶果果實富含蛋白質、糖類、脂肪、纖維、灰分等多種營養成分以及鋅、錳、銅等礦質元素及微量元素，營養價值較高[1，3]。嘉寶果果皮呈紫黑色，含有多種多酚類化合物如花青素（飛燕草素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷）、鞣花酸、蕓香苷、沒食子酸、楊梅苷、槲皮素和異槲皮素等[4-5]，具有多種生物活性如抗氧化[6]、降血脂[7]、降血糖[8]、抗炎[9]等。研究表明，嘉寶果果皮的生物活性與多酚含量呈顯著正相關，即多酚含量越高，相應的生物活性越強。Lamas等研究發現，嘉寶果果皮提取物可通過增加前列腺組織中健康上皮組織的面積、減少分化腺癌灶數量、緩解上皮萎縮、降低纖維肌性組織層厚度從而減輕老齡化小鼠前列腺組織損傷，且該活性隨提取液中花青素、鞣花酸、蕓香苷等多酚含量的增加而增強[4]。嘉寶果果皮提取物按照不同劑量灌胃處理高脂飲食小鼠 60 d，結果發現，嘉寶果果皮提取物呈劑量依賴性地降低高脂飲食小鼠體質量、改善血脂異常（總膽固醇和低密度脂蛋白含量降低、高密度脂蛋白含量升高）、改善糖耐量，減輕胰島素抵抗，從而改善前驅糖尿病和非酒精性脂肪肝病癥的高血糖和脂質代謝紊亂癥狀[10]。邱珊蓮等研究發現，嘉寶果果皮清除DPPH·、ABTS+、·OH等自由基的能力以及體外抑制α-葡萄糖苷酶活性與果皮提取物的總多酚含量呈顯著正相關（P<0.05）[8]。但是，多數關于嘉寶果果皮生理活性的研究采用果皮凍干粉直接添加或者簡單浸提的處理方法[6-7，11]，極少對果皮多酚的提取工藝進行優化。本研究在單因素試驗的基礎上采用正交試驗對嘉寶果果皮浸提工藝進行優化，并測定了果皮提取物的抗氧化和體外降糖活性，以期為嘉寶果果皮多酚提取物的加工利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

嘉寶果成熟果實采自福建省農業科學院亞熱帶農業研究所國家閩臺特色作物種質資源圃，供試品種為沙巴。

1.2 儀器與設備

L5S紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司，中國），iMARK酶標儀（Bio-Rad，美國），HH·S21-8-S型恒溫水浴鍋（上海新苗醫療器械制造有限公司，中國），WBL2521H型粉碎機（佛山美的集團，中國），MIKRO-22R冷凍高速離心機（Hettich，德國），GZX-9246MBE型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠，中國）。

1.3 試驗方法

1.3.1 嘉寶果果皮制備 嘉寶果成熟果實除去籽和果肉，將果皮置于60 ℃熱風干燥箱中烘干至恒質量，粉碎后過40目篩，備用。

1.3.2 總多酚含量測定 采用福林酚法測定提取物中的總多酚含量[12]。以沒食子酸為標準品，配制質量濃度范圍為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的標液、0.1 mol/L的福林酚試劑和7.5%碳酸鈉溶液備用。依次取0.5 mL標液或樣品、2.5 mL 福林酚試劑和2.0 mL 碳酸鈉溶液，混勻后于45 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min，結束后于765 nm波長處測定吸光度，以沒食子酸質量濃度為x值，吸光度為y值繪制回歸曲線。嘉寶果果皮多酚提取率用每克干燥果皮中所含沒食子酸的質量分數進行計算，單位為%。

1.3.3 單因素試驗 稱取適量果皮粉末于50 mL圓底離心管中，采用熱浸提的方法，選取不同乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、不同料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60，單位g ∶mL）、不同提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、不同提取時間（20、30、40、50、60 min）等因素進行試驗，分析各因素對多酚提取率的影響。

1.3.4 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，以乙醇體積分數、料液比、時間和溫度為試驗考查因素，以總多酚提取率為評價指標，設計L9（34）正交試驗（表1），優化多酚提取工藝。

1.3.5 抗氧化試驗 參照林寶妹等的方法[13]，以抗壞血酸為對照品，測定果皮多酚提取物對 DPPH·、ABTS+和·OH等3種自由基的清除能力，以各類自由基的半數清除濃度（EC50值）表示。果皮多酚質量濃度以單位體積提取液所含原材料質量計，單位為mg/mL。

1.3.6 體外降糖試驗 參照林寶妹等的方法[14]，建立體外消化酶反應體系，以阿卡波糖為對照品，測定果皮多酚提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制作用，并稍作修改。

1.3.6.1 α-葡萄糖苷酶抑制作用 配制 0.4 U/mL α-葡萄糖苷酶、3.0 mmol/L PNPG和0.2 mol/L 碳酸鈉溶液備用。取10 μL適當稀釋的樣品和10 μL α-葡萄糖苷酶加入96孔板，混勻后，37 ℃反應 10 min，再加入50 μL PNPG繼續反應 20 min，最后加入100 μL 碳酸鈉溶液終止反應，測定在405 nm波長處的吸光度（D1），并測定對照組（未加樣品）吸光度（D2）和溶劑對照組吸光度（D3）。按照公式（1）計算α-葡萄糖苷酶活性抑制率，并通過繪制回歸曲線計算酶活性被抑制50%時的多酚提取物及阿卡波糖質量濃度（IC50值）。果皮多酚提取物質量濃度以單位體積提取物所含原材料質量計，單位為mg/mL。

α-葡萄糖苷酶抑制率=[（D2-D1）/（D2-D3）]×100%。（1）

1.3.6.2 α-淀粉酶抑制作用 配制0.25 mg/mL α-淀粉酶和0.5%淀粉溶液備用。取200 μL適當稀釋的樣品和100 μL α-淀粉酶于玻璃試管中混勻并于25 ℃恒溫水浴5 min，再加入200 μL 淀粉溶液作為反應底物，混勻后繼續水浴10 min，再加入 0.4 mL DNS，立即沸水浴5 min，自然冷卻至室溫后加入5 mL超純水稀釋，于540 nm 處測吸光度（D1），并測定對照組（未加樣品）吸光度（D2）和溶劑對照組吸光度（D3）。按照“1.3.6.1”節方法計算多酚提取物及阿卡波糖對α-淀粉酶的IC50值。

1.3.7 數據處理 利用Excel軟件統計各參數的平均值和標準誤差并作圖，采用DPS軟件進行統計檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 總多酚標準曲線

以沒食子酸為標準品，在試驗所設質量濃度范圍內測得吸光度并建立回歸方程：y=11.824x-0.008（r2=0.999 2），其中y為吸光度，x為沒食子酸質量濃度（圖1）。沒食子酸在試驗所設質量濃度范圍內與吸光度有良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對總多酚提取率的影響 由圖2可知，隨著乙醇體積分數的增加，果皮總多酚提取率呈先上升后下降趨勢。當乙醇體積分數為40%～70%時，果皮總多酚提取率逐漸上升，于乙醇體積分數70%時達到最大提取率8.40%;當乙醇體積分數70%～90%時，果皮總多酚提取率迅速下降，低至4.25%，約為最大提取率的一半。研究表明，嘉寶果果皮提取物總多酚主要存在于乙酸乙酯部位和正丁醇部位[15]，果皮多酚具有一定的極性，根據相似相容原理，70%乙醇可能與果皮多酚極性最接近，總多酚的溶出量最多[16]。因此，選擇70%為最佳乙醇體積分數。

2.2.2 料液比對總多酚提取率的影響 以70%乙醇為提取溶劑，考察料液比對總多酚提取率的影響。由圖3可知，當溶劑使用量從10 mL/g增加至 40 mL/g 時，果皮多酚的提取率從7.34%上升至最大8.44%;繼續增加溶劑使用量，果皮多酚的提取率呈不斷下降趨勢。提取所用溶劑對果皮多酚的溶解度有限，增加溶劑用量可在一定程度上增加果皮多酚的溶出，料液比1 g ∶40 mL時可能已經達到溶劑對果皮多酚的溶出極限，繼續增加提取溶劑一方面造成溶劑浪費，另一方面可能會溶出其他非酚類雜質而降低多酚純度，或與已經溶出的多酚結合從而降低提取率[17]。因此，選擇1 g ∶40 mL為最佳料液比。

2.2.3 溫度對總多酚提取率的影響 由圖4可知，在設定的提取溫度范圍內，隨著溫度上升，果皮多酚提取率呈先上升后下降趨勢，在30～60 ℃溫度范圍內，果皮多酚提取率呈近直線升高，至60 ℃溫度處，提取率達最大值9.21%，繼續提高溫度，果皮多酚提取率逐漸趨于平穩并有下降趨勢。這可能是因為升高溫度可在一定范圍內提高溶劑的溶解度，增加果皮多酚的溶出，從而提高提取率;其次，溫度升高，分子運動加快，促進酚類物質的溶出，在一定的提取時間內溶出的果皮多酚增加，提取率上升[18]。但是當溫度上升至80 ℃時，果皮多酚提取率反而下降，這可能是因為溫度過高導致溶劑揮發，從而使溶劑量減少，同時溫度過高也容易造成多酚氧化，二者均可造成提取率降低[19]。因此，選擇60 ℃為最佳溫度。

2.2.4 時間對總多酚提取率的影響 由圖5可知，當提取時間從20 min延長至40 min時，果皮多酚的提取率逐漸上升，在40 min時達到最高，繼續增加提取時間，提取率反而逐漸降低。在試驗范圍內，果皮多酚提取率隨時間呈先上升后下降趨勢，可能是因為在多酚溶出速率一定的條件下，延長提取時間可增加多酚溶出量，提高提取率;但當多酚溶出達到平衡后，因為多酚結構的不穩定性，長時間浸提可能會破壞多酚結構，從而降低提取率[20]。因此，選擇40 min為最佳提取時間。

2.3 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，并結合正交試驗法，對提取工藝進行優化，結果見表2。由極差結果可知，各因素對果皮多酚提取率的影響從大到小依次為溫度>乙醇體積分數>時間>料液比，果皮多酚的最佳提取工藝為A2B3C3D3，即乙醇體積分數70%，時間50 min，溫度70 ℃，料液比1 g ∶50 mL。對極差結果得出的最佳提取工藝進行驗證，經過3次平行試驗，在最佳提取工藝條件下，果皮多酚的平均得率為10.10%，高于正交試驗中各試驗的提取率，說明最佳工藝合理。

以極差值最小的D因素為空白方差，進行方差分析和顯著性檢驗，進一步分析各因素對果皮多酚提取率的影響。由表3可知，乙醇體積分數和溫度顯著影響果皮多酚的提取效果（P<0.05）。

2.4 抗氧化活性

由表4可知，在試驗所設質量濃度范圍內，果皮多酚提取物對DPPH·、ABTS+、·OH等3種自由基的清除作用與提取物質量濃度呈良好的對數曲線關系。比較果皮多酚提取物對3種不同自由基的EC50值發現，果皮多酚提取物對DPPH·自由基的清除能力最強，對·OH自由基的清除能力最弱，該結果與苦菜多酚[21]、紫果西番蓮葉多酚[22]、牛肝菌多酚提取物[23]等提取物相似，對DPPH·自由基的清除能力均高于·OH自由基。這可能是因為不同自由基反應機理不同導致同一抗氧化劑對不同自由基清除活性存在差異[15]。研究表明，·OH自由基是人體內高活性的氧自由基，清除體內多余的氧自由基可以延緩衰老，減少疾病及其并發癥發生[24]。通過比較果皮多酚提取物與抗壞血酸對3種自由基的EC50值發現，抗壞血酸對DPPH·和ABTS+等2種自由基的清除能力雖然高于果皮多酚提取物，但是對·OH自由基的清除能力則遠低于果皮多酚提取物。此外果皮多酚提取物雖對以上3種自由基清除能力各有不同，但EC50值均低于 10 mg/mL，說明其具有良好的抗氧化活性[18]。

2.5 體外降糖活性

由表5可知，在試驗所設質量濃度范圍內，果皮多酚提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制作用與提取物質量濃度呈良好的對數曲線關系。結果表明，果皮多酚對α-葡萄糖苷酶的IC50值（0.003 mg/mL）遠低于阿卡波糖（12.158 mg/mL），IC50值越低，抑制活性越強，說明果皮多酚提取物對α-葡萄糖苷酶具有極好的抑制作用，是一種理想的α-葡萄糖苷酶抑制劑。與阿卡波糖相比，果皮多酚提取物對α-淀粉酶的抑制作用較弱，其IC50值約為阿卡波糖的7.5倍，說明果皮多酚提取物對以上2種消化酶的抑制作用具有選擇性。該試驗結果與多種植物提取物不同，例如苦丁茶多酚對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50值分別為1.15、1.31 mg/mL[25]，白豆提取物為5.9、4.2 mg/mL[26]，棗核多酚提取物為6.16、9.81 mg/mL[27]，這些植物提取物對以上2種消化酶的IC50值較為接近，即對這2種酶的抑制選擇性較差。而嘉寶果果皮多酚提取物可以在選擇性抑制α-葡萄糖苷酶時對α-淀粉酶無抑制作用，該特性可用于開發選擇性α-葡萄糖苷酶抑制劑。

3 ?結論

本研究以沙巴品種嘉寶果果皮為原料，通過單因素和正交試驗，采用乙醇熱浸提的方法提取嘉寶果果皮總多酚，優化后的嘉寶果果皮多酚提取工藝為乙醇體積分數70%、時間50 min、溫度70 ℃、料液比1 g ∶50 mL，在此條件下，果皮總多酚的提取率可達到10.10%。各因素對果皮總多酚提取率的影響作用大小表現為溫度>乙醇體積分數>時間>料液比。優化提取后的嘉寶果果皮多酚提取物具有良好的抗氧化活性，其對羥自由基的清除能力高于抗壞血酸，具有天然抗氧化劑開發價值;同時嘉寶果果皮多酚提取物具有一定的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制作用，并且其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有選擇性，具有輔助降血糖藥開發價值。

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