原兒茶醛對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經血管單元穩態破壞的保護作用

馮晉 徐婭玲 孟慶婷 顏漢文 何芳雁

摘 要 目的：研究原兒茶醛對大鼠腦缺血再灌注損傷（CIRI）后神經血管單元（NVU）穩態破壞的保護作用。方法：將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和原兒茶醛高、低劑量組（10、20 mg/kg），每組11只。給藥組大鼠灌胃相應藥物，假手術組和模型組大鼠灌胃等體積水，灌胃體積均為10 mL/kg，每日1次，連續5? d。末次給藥后，采用線栓法復制大鼠CIRI模型，采用透射電鏡觀察大鼠腦組織中NVU超微結構的變化;采用Western blot法檢測大鼠腦組織中NVU相關蛋白[神經元標志蛋白（MAP-2）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、水通道蛋白（AQP-4）]的表達水平;采用免疫熒光染色法檢測大鼠大腦皮層中上述蛋白的陽性表達水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠血腦屏障（BBB）結構被嚴重破壞，血管腔變窄，內皮細胞外側嚴重水腫，基底膜厚薄不一;神經元核固縮，周圍組織存在大面積水腫;膠質細胞結構嚴重破壞，胞體皺縮、細胞器損失;腦組織（或大腦皮層）中MAP-2蛋白表達水平（或陽性表達水平）均顯著降低（P<0.05或P<0.01），GFAP、AQP-4蛋白表達水平（或陽性表達水平）均顯著升高（P<0.01）。經原兒茶醛干預后，大鼠BBB損傷減輕，血管腔和基底膜形態未完全被破壞;神經元損傷減輕，神經元核固縮減少，染色質均勻、異染色質減少;膠質細胞結構破壞減輕，腦組織中GFAP、AQP-4（低劑量組除外）蛋白表達水平以及大腦皮層中MAP-2、GFAP蛋白陽性表達水平均顯著逆轉（P<0.05或P<0.01）。結論：原兒茶醛可保護CIRI模型大鼠的NVU穩態免受破壞;其作用機制可能與上調大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白表達，下調腦組織中GFAP、AQP-4蛋白表達有關。

關鍵詞 原兒茶醛;腦缺血再灌注損傷;神經血管單元;大腦皮層;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To observe the protective effect of protocatechuic aldehyde （PAL） on neurovascular unit （NVU） homeostasis damage in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI）. METHODS： SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， PAL high-dose and low-dose groups （10， 20 mg/kg）， with 11 rats in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically. Sham operation group and model group were given the same volume of normal saline intragastrically， 10 mL/kg once a day， for 5 days. After last administration， CIRI model was induced by suture method; the ultrastructural changes of NVU were observed by transmission electron microscope. Western blot assay was used to detect the expression of NUV related proteins （MAP-2， GFAP， AQP-4） in cerebral tissue. Immunofluorescence staining was used to observe the positive expression of above proteins in cerebral cortex. RESULTS： Compared with sham operation group， blood-brain barrier （BBB） structure of model group was destroyed severely， the vascular lumen became narrower， lateral edema of endothelial cells was severe， and the thickness of basement membrane varied; the nuclei of neurons were pyknosis and there was a large area of edema in the surrounding tissues; the structure of glial cells was seriously damaged， the cell body was shrunk and organelles were lost; protein expression （or positive expression） of MAP-2 in brain tissue （or cerebral cortex） were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， while protein expression （or positive expression） of GFAP and AQP-4 were increased significantly （P<0.01）. After PAL intervention， the rats had less BBB damage， and the morphology of vascular lumen and basement membrane were not completely destroyed; the damage of neurons was alleviated， the pyknosis of neurons was decreased， the chromatin was homogeneous and the heterochromatin was decreased; the damage of glial cell structure was alleviated; protein expression of GFAP and AQP-4 （except for low-dose group） in cerebral tissue and positive expression of MAP-2 and GFAP protein in cerebral cortex were reversed significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： PAL can protect the stability of NVU from damage in CIRI model rats; the mechanism may be related to up-regulating the expression of MAP-2 protein in cerebral cortex and down-regulating the expression of GFAP and AQP-4 protein in brain tissue.

KEYWORDS? ?Protocatechuic aldehyde; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Neurovascular unit; Cerebral cortex; Rats

《中國腦卒中防治報告（2018）》顯示，腦卒中居我國死亡原因之首[1]。其中，缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是腦卒中發病率最高的病種，其是由于腦血流的突然中斷導致腦細胞死亡和神經缺陷的一類疾病[2]。在IS的病理發展過程中，血栓脫落、血栓自溶以及缺血區側支循環的建立與開放等均會引起缺血區的血流重建，從而造成腦缺血再灌注損傷（CIRI），進而導致IS惡化[3]。IS的發生不僅影響神經元，還影響位于“膠質細胞-神經細胞-血管小生態環境”中的所有腦細胞、細胞外基質和機體免疫系統?；诖?，美國國家神經疾病和中風學會提出了“腦神經血管單元（neurovascular unit，NVU）”的概念[4]，為臨床治療IS提供了新的策略——NVU穩態的治療，強調從整體研究腦神經血管系統的損傷及其機制，對IS的治療從單一環節擴展為對 NVU 各細胞成分的全面保護，以維持腦微環境的整體穩定，促進神經元存活和神經功能的恢復，以期達到降低IS致殘率和病死率的目標[5-7]。

NVU由神經元、星形膠質細胞（Ast）、小膠質細胞、血腦屏障（BBB）等成分組成[8-10];當腦缺血再灌注后，部分神經元變性壞死、Ast足突水腫、小膠質細胞被大量激活，使得NVU的完整性被破壞，從而導致腦組織內環境的穩態失調[11-12]。

原兒茶醛為天麻的酚類成分（結構式見圖1），具有保護BBB、抗血小板聚集和抗神經炎癥等作用;且經本課題組前期研究發現，其對IS后的CIRI具有保護作用[13-14]。但是，原兒茶醛是否可通過作用于NVU發揮其保護CIRI的作用尚不明確?；诖?，本研究建立大鼠腦缺血再損傷模型，采用透射電鏡觀察NVU各組成成分（BBB、神經元、膠質細胞）的結構變化，采用Western blot法和免疫熒光染色法，研究原兒茶醛干預后對NVU相關蛋白[微管相關蛋白2（MAP-2）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、水通道蛋白（AQP-4）][15-17]表達水平的影響，以期為探討原兒茶醛對CIRI后NVU穩態破壞的保護作用提供參考。

Fig 1 Chemical structure of PAL

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：Secura2250型分析天平（瑞士Precisa公司）、CF16RXⅡ型低溫高速離心機（日本Hitachi Koki公司）、UVP型顯色系統（美國Spectrum公司）、Cryo Star 型冰凍切片機（德國Leica公司）、JEM- 1400Flash型透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：原兒茶醛（北京百靈威科技有限公司，批號P13N，純度98%），TTC試劑（上?；菔郎噭┯邢薰?，批號120808），多聚甲醛（天津化學試劑研究所，批號20100525），水合氯醛（廣東光華化學廠有限公司，批號20100926），兔抗MAP-2多克隆抗體（美國Abcam公司，批號GR288637-1），鼠抗AQP-4多克隆抗體、兔抗GFAP多克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的免疫球蛋白G（IgG）二抗、化學發光顯影劑（美國Proteintech公司，批號分別為C520BA0013、00023078、10004157、20000003、B2202003），二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號090119191205）;其余試劑為實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，雄性，體質量240～270 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（川）2020-020。大鼠每天定時供應食水，并定期更換墊料，飼養環境溫度為18～24 ℃、相對濕度為40%～60%，適應性喂養7 d后進行后續實驗。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將48只大鼠隨機分為假手術組、模型組和原兒茶醛低、高劑量組（10、20 mg/kg，劑量根據前期研究結果和參考文獻[13]設置），每組11只。給藥組大鼠灌胃相應藥物（臨用時以水進行溶解），假手術組和模型組大鼠灌胃等體積水，灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續5 d。末次給藥后，對大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進行麻醉，并以仰臥位固定于37 ℃恒溫加熱鼠板上;參考文獻[18-20]中的線栓法，取大鼠頸正中偏右切口，暴露右側頸總動脈（CCA）和迷走神經并進行鈍性分離。將CCA遠心端打一活結，近心端結扎，并在結扎上部剪一“V”型小口，將栓線沿“V”型小口插入，直至尼龍線前端到達大鼠大腦中動脈（MCA）起始處（線栓插入長度大約為18～20 mm）;栓塞2 h后，緩慢輕拉尼龍栓線，以復制CIRI模型大鼠。假手術組大鼠同法分離血管后，不插入拴線。造模后，參考文獻[21-22]方法，對大鼠進行神經學評分：0分為無神經功能缺損癥狀，1分為輕度局灶性神經功能缺損（即提尾懸空不能伸展左側前爪），2分為中度局灶性神經功能缺損（即行走時向左側轉圈），3分為中度局灶性神經功能缺損（即行走困難，并向左側傾倒），4分為重度局灶性神經功能缺損（即不能自發行走、意識水平下降）;并以激光多普勒檢測大鼠腦血流量。當大鼠神經學評分為1～3分且腦血流量降至其基礎值的20%左右，并在再灌注2 h后腦血流量恢復至其基礎值的50%以上，則表明造模成功。

2.2 大鼠腦組織中NVU超微結構的觀察

造模成功后，各組取2只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，并以生理鹽水和4%多聚甲醛進行心臟灌流;灌流后，斷頭取大鼠額頂區腦組織，將其切成5片厚度為1 mm的切片，以雙醛固定液浸泡3次，每次10 min;以2.5%戊二醛和2%四氧化鋨固定，梯度乙醇脫水，環氧樹脂包埋;再以醋酸鈾、枸椽酸鉛雙重染色，然后采用透射電鏡觀察大鼠腦組織中NVU超微結構的變化。

2.3 大鼠腦組織中NVU相關蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。各組取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，以生理鹽水進行心臟灌流后，迅速取出腦組織，置于冰上分離出缺血側（右側）大腦皮層和海馬組織，加入蛋白裂解液提取蛋白;以14 000 r/min離心10 min，分離上層蛋白液，采用BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE），轉膜，以5%脫脂奶粉封閉1.5 h;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入MAP-2、GFAP、AQP-4、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃條件下孵育過夜;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫下孵育2 h;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入化學發光顯影劑，采用顯色系統成像。采用Image J v1.8.0軟件進行分析，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.4 大鼠大腦皮層中NVU相關蛋白陽性表達的檢測

采用免疫熒光染色法進行檢測。取對照組、模型組和原兒茶醛高劑量組大鼠各3只（因本課題組實驗經費有限，故僅選擇了原兒茶醛高劑量組大鼠進行免疫熒光染色實驗），以生理鹽水和4%多聚甲醛進行心臟灌流后，斷頭取大鼠腦組織，將腦組織于20%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液中脫水過夜;取出腦組織，進行包埋、冰凍切片。切片晾干后，以0.01 mol/L PBST緩沖液沖洗3次×5 min，然后滴加MAP-2、GFAP、AQP-4一抗（稀釋度分別為1 ∶ 100、1 ∶ 50、1 ∶ 500），于4 ℃條件下孵育過夜;以0.01 mol/L PBST緩沖液沖洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫下孵育40 min;以0.01 mol/L PBST緩沖液沖洗5 min×3次，封片。采用顯微鏡觀察切片中大鼠缺血側（右側）大腦皮層中MAP-2、GFAP和AQP-4的陽性表達情況。采用Image J v1.8.0軟件計算各目的蛋白陽性染色面積百分比，其值越大，則表示目的蛋白陽性表達水平越高。

2.5 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。若數據符合正態分布且方差齊，則以x±s表示，多組間比較時采用單因素方差分析，組間兩兩比較時采用LSD檢驗;若不符合正態分布則以中位數表示，采用非參數檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 原兒茶醛對大鼠腦組織中NVU超微結構的影響

假手術組大鼠BBB結構完整，血管內皮細胞正常，基底膜厚薄均一;神經元結構正常、無明顯變化，染色質分布均勻;膠質細胞結構完好，細胞核、細胞器完整，周圍組織無水腫。模型組大鼠BBB結構被嚴重破壞，血管腔變窄，內皮細胞外側嚴重水腫，基底膜厚薄不一;神經元核固縮，周圍組織存在大面積嚴重水腫;膠質細胞結構嚴重破壞，胞體皺縮、細胞器損失。原兒茶醛各劑量組大鼠與模型組比較，其BBB損傷減輕，血管腔和基底膜形態未完全被破壞;神經元損傷減輕，神經元核固縮減少，染色質均勻、異染色質減少;膠質細胞結構破壞減輕，詳見圖2。

3.2 原兒茶醛對CIRI模型大鼠腦組織中NVU相關蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中MAP-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），GFAP、AQP-4蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，原兒茶醛各劑量組大鼠腦組織中MAP-2蛋白表達水平有所升高，但差異無統計學意義（P>0.05），而GFAP、AQP-4（原兒茶醛低劑量組除外）蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），詳見表1、圖3。

注：與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05

Note：vs. sham operation group，*P<0.05，**P<0.01; vs. model group，#P<0.05

3.3 原兒茶醛對CIRI模型大鼠大腦皮層中NVU相關蛋白陽性表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白的陽性表達水平顯著降低（P<0.01），GFAP、AQP-4蛋白的陽性表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，原兒茶醛高劑量組大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白的陽性表達水平顯著升高（P<0.01），GFAP蛋白的陽性表達水平顯著降低（P<0.01），AQP-4蛋白的陽性表達水平差異無統計學意義（P>0.05），詳見表2、圖4。

注：與假手術組比較，**P<0.01;與模型組比較，##P<0.01

Note：vs. sham operation group，**P<0.01; vs. model group，##P<0.01

4 討論

CIRI是一個復雜的病理生理過程，涉及能量代謝障礙、興奮性氨基酸過度釋放、炎癥反應、自由基堆積、細胞凋亡等多個病理環節[23]。NVU是由BBB、神經元、Ast、小膠質細胞等支持細胞組成的功能性結構，各細胞之間相互協調、共同維持腦組織內環境的整體穩態;其對腦缺血早期的炎癥反應以及后期的血管新生進程具有重要的作用[11-12]。當發生局灶性腦缺血時，NVU中BBB、神經元、膠質細胞均受到不同程度的損害，從而使得NVU的完整性被破壞[24]。本研究發現，大鼠CIRI后其BBB結構被嚴重破壞;神經元核固縮，周圍組織存在大面積嚴重水腫;膠質細胞結構嚴重破壞。經原兒茶醛干預后，大鼠BBB、神經元損傷減輕，膠質細胞結構破壞減輕。這表明原兒茶醛能保護大鼠CIRI后NVU超微結構的完整性。

MAP-2是神經元細胞骨架的重要組成部分，其表達水平能反映神經元樹突的破壞情況[6];GFAP是Ast的骨架蛋白，其表達水平能反映Ast的活化情況[25]; AQP-4是腦內主要的水通道蛋白，在BBB和腦-腦脊液屏障的Ast中高度表達，其表達水平可反映腦內水平衡和組成BBB完整性結構的緊密連接蛋白的損傷情況[26]。本研究的Western blot法檢測結果顯示，經低、高劑量原兒茶醛干預后，CIRI模型大鼠腦組織中GFAP、AQP-4（低劑量組除外）蛋白表達水平均顯著降低，而MAP-2蛋白表達水平的變化無統計學意義（P>0.05）;免疫熒光染色法結果顯示，經高劑量原兒茶醛干預后，CIRI模型大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白的陽性表達水平顯著升高，GFAP的陽性表達水平顯著降低，而AQP-4蛋白的陽性表達水平的變化無統計學意義（P>0.05）。這提示原兒茶醛對MAP-2、GFAP蛋白的影響主要在大鼠大腦皮層區，對AQP-4蛋白的影響可能不在大腦皮層區。

綜上所述，原兒茶醛可保護CIRI模型大鼠的NVU穩態免受破壞;其作用機制可能與上調大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白表達，下調腦組織中GFAP、AQP-4蛋白表達有關。

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（收稿日期：2021-02-18 修回日期：2021-05-06）

（編輯：唐曉蓮）