生菜子多糖提取方法及其降血脂活性研究

楊豐榕，高建萍，李春燕

（內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 010110）

0 引言

生菜子，菊科植物萵苣(Lactuca satyaL.)的干燥種子，又名黑苣勝，是蒙藥方劑中較常用的藥材之一。蒙醫理論中認為其具有消食、調理胃火等功效，不僅可用于腹部鼓脹，面部浮腫等肝病，還可以治療嘔吐以及飲食后肝區疼痛等[1]?，F代藥理研究后發現生菜子具有降血脂[2]、中樞抑制[3]、抗心律失常[4]等功效，但由于對生菜子的研究較少，其所含化學成分不明確，相關藥理活性的作用機制尚不清楚。

經項目前期研究發現生菜子含有的主要化學成分之一為多糖，而多糖的多種藥理活性中包括降血脂[5]、降血糖[6-8]、抗氧化[9-11]等，其中多糖降血脂的機制包括直接降低體內膽固醇、減少過氧化物生成等[12]，結合文獻中生菜子的降血脂作用，因此本文將生菜子多糖定為研究對象。

多糖的提取方法種類較多，有醇水法[13]、超聲法[14]、酶法[15]、微波法[16]等，其中最常用的還是醇水法，通過設計合理的正交試驗得到最佳工藝。誤差反向傳播神經網絡，簡稱為BP神經網絡，是人工神經網絡中的機器學習方法[17-18]。本研究旨在將BP神經網絡法與生菜子多糖提取的正交試驗結合，利用BP神經網絡法實現過程模擬，考察細微變化對提取結果的影響，進而建立優于正交試驗的生菜子多糖的最佳提取方法，同時研究生菜子多糖結合膽酸鹽能力從而實現對生菜子降血脂作用機制的初步研究，藉此實現對生菜子的深入研究并為多糖降血脂功效的研究提供部分理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生菜子，購自內蒙古天力藥業，由內蒙古醫科大學生藥學教研室渠弼教授鑒定為菊科植物萵苣(Lactuca satyaL.)的干燥黑色種子。膽酸鈉、牛黃膽酸鈉、甘氨膽酸鈉（上海源葉試劑公司）、葡萄糖（040510 天津市化學試劑三廠），其余試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

752-型-紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、電子天平（AB135-S；METTLER TOLEDO，TA5003W，上海菁海儀器有限公司）、FZ-600型酸度計（成都世紀方舟科技公司）、旋蒸儀（N-1300D-WB）

1.3 方法

1.3.1 生菜子預處理 生菜子藥材經粉碎后，先經石油醚脫脂，再以95%乙醇除低聚糖，后將藥材粉末干燥備用。

1.3.2 生菜子多糖提取工藝 采用水醇法：預處理生菜子粉末+蒸餾水→煎煮→真空抽濾→濃縮→80%醇沉→得生菜子多糖，依據公式(1)計算多糖得率。

1.3.3 單因素實驗 實驗采用的提取溫度分別選擇50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，提取時間選擇0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取次數選擇1、2、3、4次，溶劑倍量定為10、20、30、40、50、60倍，將以上4個因素作為生菜子多糖得率的主要影響因素進行單因素考察實驗。

1.3.4 正交試驗 以提取溫度(A)、提取時間(B)、提取次數(C)、溶劑倍量(D)為影響因素，以多糖得率作為指標展開正交設計試驗。

1.3.5 基于正交設計的BP神經網絡優化[19-21]以正交試驗設計中影響生菜子多糖得率的4 個主要因素作為4個輸入節點建立的B P 神經網絡輸入層，以得率作為輸出節點建立輸出層，將綜合評分作為評價指標。采用MAT LAB 7.0軟件實施編程，其中隱含層傳遞函數最終選擇tansig 雙曲正切傳遞函數，而輸出層傳遞函數則選擇purelin線性傳遞函數。

1.3.6 生菜子多糖體外結合膽酸實驗

（1）樣品制備。取生菜子藥材粗粉，44倍蒸餾水，89℃提取1.6 h，提取4次，得生菜子多糖提取液。濃縮后，以60%乙醇、80%乙醇分級醇沉、90%乙醇直接醇沉，得到3 個樣品，分別為：60%醇沉生菜子多糖、80%醇沉生菜子多糖、生菜子粗多糖。

（2）膽酸鹽標準曲線的繪制[22]

步驟：（1）以磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 6.3)配制0.3 mmol/L 的?；悄懰徕c(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)和膽酸鈉(SC)溶液，備用；（2）分別取上述膽酸鹽溶液0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于10 mL 具塞試管中，以磷酸緩沖溶液補充至2.5 mL；（3）加入7.5 mL 硫酸溶液（質量分數60%）；（4）70℃水浴20 min 冰浴5 min；（5）于387 nm處測定吸光度值；（6）以吸光度值和膽酸鹽濃度繪制標準曲線。

（3）膽酸鹽結合實驗。取1 mL 的多糖溶液（粗多糖，60%醇沉，80%醇沉，分別配置成0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL）于10 mL 具塞試管中，加入1 mL HCl 溶液(0.01 mol/L)，37℃恒溫1 h，以NaOH溶液(0.1 mol/L)調節pH 6.3，隨后加入4 mL 胰酶（10 mg/mL，pH 6.3 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制），于37℃恒溫震蕩1 h 后，每個樣品中分別再加入4 mL 不同的膽酸鹽溶液，于37℃恒溫振蕩1 h后，待膽酸鹽被充分結合后，4000 r/min，離心20 min。上清液按1.3.6.2項下方法測定膽酸鹽含量。

2 結果與分析

2.1 單因素考察結果

單因素考察結果見圖1～4。當生菜子多糖的提取溫度為50℃～70℃時，多糖得率與溫度成正比，高溫促使多糖的溶出加速，但是當溫度超過70℃時，高溫可能導致使多糖發生降解或者一定程度的糊化，從而使多糖的得率下降；當提取時間為0.5～1.0 h 時，時間與多糖得率成正比，當提取時間超過1.5 h 時，多糖的得率基本趨于穩定；提取次數與多糖得率成正比，次數越多提取越充分，經過提取3次后多糖得率則趨于平穩；溶劑用量越多，多糖得率越高，但大量提取液需要濃縮，導致時間和能源的浪費，因此應選擇適當的溶劑倍量。

圖1 提取溫度對黑苣勝多糖提取率的影響

2.2 正交試驗結果

依據單因素考察結果建立正交設計實驗，相關因素和水平及試驗結果見表1～3。由表3可知，提取次數是生菜子多糖的提取工藝的主要影響因素，其余各個因素對生菜子多糖得率無顯著影響。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

表3 生菜子多糖提取實驗方差分析表

2.3 BP神經網絡優化結果

本實驗所建立的BP 神經網絡最大學習步長為1000，目標精度0.001，訓練過程穩定迅速，其穩定性結果可見圖5～6。此網絡以正交試驗所得數據作為參考數據，模擬提取實驗中未進行的數據考察，可以由計算機實現1℃、1 倍水量、1 min 對生菜子多糖得率的影響，從而得到最優結果。固定3個影響因素，仿真一個因素后所得的工藝為：89℃，44倍水，提取4次，1.6 h/次，結果見圖7～10。

圖2 提取時間對黑苣勝多糖提取率的影響

圖3 提取次數對黑苣勝多糖提取率的影響

圖4 溶劑的倍量對黑苣勝多糖提取率的影響

圖5 誤差收斂曲線

圖6 回歸相關性擬合曲線

圖7 針對提取溫度的仿真

圖8 針對提取時間的仿真

圖9 針對溶劑倍量的仿真

圖10 針對提取次數的仿真

2.4 生菜子多糖體外結合膽酸實驗結果

由表4可知，生菜子粗多糖（粗）、60%醇沉(60%)、80%醇沉多糖(80%)對?；悄懰徕c(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)和膽酸鈉(SC)都有較好的結合率，并與多糖濃度在一定范圍內呈正比。

表4 不同生菜子多糖對3種膽酸鹽的結合率

3 討論

通過本項目研究補充了目前針對生菜子這味藥食同源蒙藥的研究，發現了其所含主要化學成分是多糖，并對生菜子多糖的提取分離方法進行了研究，填補了此味藥材在化學成分提取方法上的空白。由項目最終多糖得率可知采用BP 神經網絡模型所得的生菜子多糖提取工藝優于正交試驗，并且在不增加試驗次數的基礎上就可以考察到更細微的條件變化，節約人力物力，僅利用少量數據即可通過計算機軟件分析各個影響提取的因素對生菜子多糖得率的影響規律，并找到最佳參數且此結果優于正交試驗結果，說明BP神經網絡法值得用于化學成分提取工藝的改進。

本研究通過利用模擬腸胃條件的方法進行了生菜子多糖膽酸鹽結合試驗，發現多糖濃度高于2 mg/mL時，對膽酸鈉的結合率反而下降，可能是由于多糖分子比較大，當濃度過高時，在空間上阻礙了其與膽酸鈉的結合，尚需結合體內實驗進一步研究。

有學者認為藥食同源的植物中功能性成分能夠于腸道結合內膽酸鹽，部分可以通過影響脂類消化和吸收降血脂，還可以通過影響膽酸鹽的腸肝循環，使之排出體外，并促使膽固醇向膽酸鹽轉化來降低血脂[25-26]，結合本項目研究結果，可初步判斷生菜子降低血脂的藥理作用機制為生菜子多糖對膽酸鹽的結合作用，從而表明多糖是生菜子藥材降血脂效果的主要有效成分之一，能夠為以后蒙藥生菜子藥理活性研究打下了基礎并指明將來的研究方向。

4 結論

正交試驗作為常見的研究設計方法，不但經濟、高效、快速，而且可以針對多因素多水平，局限是只能優化研究者提供的多個水平的組合，而BP神經網絡可以學習規則，并實現自身訓練，不僅能夠給定范圍尋優，還能預測范圍中的最優值，得到更加可靠，穩定的結果[23-24]。

根據本項目優化得到的工藝平行進行3次生菜子多糖的提取實驗，結果發現此工藝中多糖得率優于正交試驗結果，平均為11.17%，證明此最優工藝穩定并且可行，同時具有良好的重復性。

在生菜子多糖的膽酸鹽結合實驗中，隨著3 種多糖的濃度增大，對牛黃膽酸鈉的吸附力增強，當多糖濃度高于2 mg/mL 時，對其結合率基本穩定。多糖濃度增加，對甘氨膽酸鈉的吸附能力呈正比，在多糖濃度為3 mg/mL 時達到吸附最大值，表明生菜子多糖可以重點吸附此類膽酸鹽。而3種多糖對膽酸鈉的吸附在多糖濃度為0.5～2 mg/mL時，逐步增加，但是當多糖濃度高于2 mg/mL 時，對膽酸鈉的結合率反而下降。在3種多糖中，生菜子粗多糖對不同膽酸鹽的結合率最佳，其次是60%醇沉多糖，80%醇沉多糖。

本項目僅從體外對生菜子多糖的降血脂作用進行了研究，后期實驗將進一步對生菜子多糖在高血脂動物模型中的降血脂能力進行研究。