miR-452-5p 靶向SOX5 調控信號通路對乳腺癌細胞增殖與侵襲的影響

魏 濤，馮連杰，付小娜，趙世杰，劉偉鵬，梁 豪

乳腺癌患者的死亡多由局部腫瘤轉移引起［1］，在腫瘤轉移過程中，侵襲性癌細胞的增殖程序受基因的調控［2］。miRNA 是一類內源性非編碼小RNA，可通過與靶基因結合，調控蛋白的表達和細胞功能。已有研究發現，miR-452-5p 可抑制乳腺癌細胞轉移［3］，miR-485-5p 通過靶向survivin 抑制乳腺癌的進展和化學敏感性［4］。在細胞中，小RNA 通過與靶基因的3'-未翻譯區互補結合抑制基因表達，研究顯示，miR-146a-5p 通過調控SOX5 的表達影響三陰性乳腺癌細胞的增殖和轉移［5］。SOX5 作為癌基因發揮作用，抑制SOX5 的表達可抑制非小細胞肺癌和前列腺癌的發展［6，7］。SOX5 被證明是由多個小RNA 調控的，但在乳腺癌中，miR-452-5p 是否調控SOX5 還沒有研究。筆者通過檢測miR-452-5p、SOX5 的表達，探討miR-452-5p 對乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺上皮細胞株HBL-100、人乳腺癌MCF-7、SKBR-3、BT549 細胞株（上海細胞庫）；胎牛血清、RPMI 1640 培養基（美國Gibco 公司）；Tranwell 小室（美國Millipore 公司）；Matrigel 膠（美國BD 公司）；MTT、DMSO（美國Sigma 公司）；miRcon、miR-con mimic 的構建（上海吉凱基因公司）；SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 一抗（美國Abcam 公 司）；Twist、N-cadherin、Vimentin、βactin 抗體（美國CST 公司）；lipofectamine TM2000轉染試劑（美國invitrogen 公司）；SOX5 過表達載體及空載體、SOX5 野生型（WT）或突變型（MUT）熒光素酶報告載體（廣州復能基因有限公司）；miR-452-5p、SOX5 引物（上海生工公司）；IgG 二抗（北京博奧森生物科技有限公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白檢測試劑盒（美國Thermo scientificals 公司）；酶標儀購自Bio-Red 公司；電子熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；Western blot 發光成像系統（美國UVP公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養與分組 HBL-100、MCF-7、SKBR-3、BT549 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。實驗首先分為空白對照組（NC），陰性對照組（miRcon），miR-452-5p 過表達組（miR-452-5p mimic）；miR-con 組：將miR-con 轉染至SKBR-3 細胞中；miR-452-5p mimic 組：將miR-452-5p mimic 轉染至SKBR-3 細胞中。后續實驗分為miR-con 組，miR-452-5p mimic 組，miR-452-5p+pcDNA 組，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組；miR-452-5p +pcDNA 組，將pcDNA空載體轉染miR-452-5p mimic 細胞；miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組，將pcDNA-SOX5 載體轉染miR-452-5p mimic 細胞，比較2 組間檢測數據的差異。

1.2.2 細胞轉染 miR-452-5p mimic、miR-con 使用lipofectamineTM2000 轉染試劑進行轉染，轉染后6 h 后更換培養基，熒光顯微鏡下觀察轉染效率；pcDNA-SOX5 通過慢病毒轉染細胞。

1.2.3 實時熒光定量PCR 細胞中提取總RNA，反轉錄為cDNA，熒光定量PCR 儀進行實時熒光定量PCR，反應參數設置為95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 個循環。以U6 和β-actin 分別為miR-452-5p、SOX5 的內參基因，采用2-ΔΔct方法計算miR-452-5p、SOX5 的相對表達量，實驗重復3 次取平均值。引物序列：miR-452-5p：F 5'-GACCCAATACGAGTCGGCAATTCCA ACT-3'，R 5'-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3'；U6：F 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R 5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3'；SOX5：F 5'-CAGCCAG AGTTAGCACAATAGG-3'，R 5'-CTGTTGTTCCCGT CGGAGTT-3'；β-actin：F 5'-GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT-3'，R 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT GG-3'。

1.2.4 MTT 法檢測細胞增殖情況 調整SKBR-3細胞濃度至5×104個/ml，96 孔板每孔加入100 μl細胞懸液，分別于24 h，48 h，72 h 檢測細胞活力；每孔加入MTT 試劑20 μl，繼續培養4 h，離心保留下層細胞，每孔加入100 μl DMSO，錫箔紙包裹震蕩孵育15 min，酶標儀檢測490 nm 波長的吸光度。

1.2.5 Transwell 實驗檢測乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力 Transwells 小室接種5×104個SKBR-3 細胞，培養24 h 后檢測遷移至小室膜細胞數，200 倍光鏡下隨機選取5 個視野比較穿膜細胞數。Matrigel包被小室基底膜，其余步驟與遷移實驗相同，檢測細胞侵襲能力。實驗均獨立重復3 次。使用相同方法檢測miR-con 組，miR-452-5p mimic 組，miR-452-5p+pcDNA 組，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組SKBR-3 細胞的遷移侵襲能力。

1.2.6 雙熒光素酶實驗檢測miR-452-5p 對SOX5的影響 構建野生型pGL3-SOX5-3’UTR（wt-SOX5 3’UTR）和突變型pGL3-SOX5-3’UTR（mutpGL3-SOX5-3’UTR）表達載體轉染至miR-con、miR-452-5p mimic SKBR-3 細胞，轉染后48 h 裂解細胞，雙熒光素酶檢測系統檢測雙熒光素酶活性，檢測miR-452-5p 對SOX5 熒光活性的調控。

1.2.7 采用蛋白印跡（western blot，WB）法檢測蛋白表達情況 RIPA 裂解液裂解細胞，提取細胞中總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度；SDS 變性蛋白；電泳轉膜封閉1，一抗以1∶500 稀釋后4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，ECL 顯影液顯影，AI600 成像系統觀察目的蛋白條帶，Image J 軟件對目的條帶進行灰度值分析，以β-Actin 為內參進行灰度值比較。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 進行數據分析。2 組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用snk-q 檢驗；以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-452-5p 和SOX5 在乳腺癌細胞系中的表達RT-qPCR 檢測結果顯示，乳腺癌細胞系MCF-7、SKBR-3、BT549 中miR-452-5p 表達顯著低于正 常乳腺癌細胞系HBL-100（P＜0.05），且SKBR-3 細胞中miR-452-5p 表達水平最低（圖1A）。乳腺癌細胞系MCF-7、SKBR-3、BT549 中SOX5 mRNA 及蛋白水平顯著高于HBL-100（P＜0.05），且SKBR-3 細胞中SOX5 mRNA 及蛋白水平均最高（圖1B～D），選擇乳腺癌細胞系SKBR-3 進行后續功能實驗。

圖1 miR-452-5p、SOX5 在乳腺癌細胞系中的表達

2.2 轉染miR-452-5p 抑制乳腺癌SKBR-3 細胞增殖在SKBR-3 細胞中分別轉染 miR-con、NC和miR-452-5p mimic，RT-qPCR 檢測顯示，與NC、miR-con 組比較，轉染miR-452-5p mimic 后，乳腺癌SKBR-3 細胞miR-452-5p 表達水平顯著升高（P＜0.05）（圖2A）。MTT 檢測顯示，與NC、miR-con組比較，過表達miR-452-5p 后乳腺癌SKBR-3 細胞活性顯著降低（P＜0.05）（圖2B）。Western blot 結果顯示，與NC、miR-con 組比較，過表達miR-452-5p 后，細胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4 表達水平顯著降低（P＜0.05）（圖2C、D）。

圖2 轉染miR-452-5p 對乳腺癌細胞增殖的影響

2.3 轉染miR-452-5p 抑制乳腺癌SKBR-3 細胞遷移和侵襲Transwell 侵襲實驗顯示，與NC、miR-con 組比較，轉染miR-452-5p mimic 組乳腺癌SKBR-3 細胞遷移和侵襲數量顯著降低（P＜0.05）（圖3A、B），提示miR-452-5p 能夠抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。Western blot 結果顯示，與NC、miR-con 組比較，過表達miR-452-5p 后，乳腺癌SKBR-3 細胞中與侵襲、轉移密切相關的MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）（圖3C、D）。

圖3 轉染miR-452-5p 對抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響

2.4 miR-452-5p 靶向SOX5TargetScan 軟件預測miR-452-5p 與SOX5 3’UTR 存在結合位點（圖4A），熒光素酶實驗進一步驗證miR-452-5p 與SOX53’UTR 關系，根據預測結果構建SOX5-WT-3’UTR 和SOX5-MUT-3’UTR 質粒，分別與miR-452-5p mimic 或miR-452-5p NC 共轉染至SKBR-3 細胞，熒光素酶報告基因顯示，只有SOX5-WT--3’UTR 與miR-452-5p mimic 共轉染組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），其余三組熒光素酶活性無明顯差異，提示miR-452-5p 可與SOX5 特異性結合（圖4B）。Western blot 結果顯示，過表達miR-452-5p 后SOX5 表達顯著減少，沉默miR-452-5p后SOX5 表達顯著升高（P＜0.05）（圖4C）。

圖4 miR-452-5p 靶向SOX5

2.5 過表達SOX5 降低miR-452-5p 對乳腺癌SKBR-3 細胞的抑制作用MTT 檢測顯示，與miR-con 組比較，過表達miR-452-5p 后，miR-452-5p 組乳腺癌SKBR-3 細胞增殖活性受到抑制，遷移數和細胞侵襲數顯著減少，SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）；過表達SOX5 后，與miR-452-5p+pcDNA 組比較，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組細胞活性顯著增加、遷移和侵襲數顯著增加，SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著增加（P＜0.05）（圖5）。

圖5 過表達SOX5 部分逆轉miR-452-5p 抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲

2.6 miR-452-5p 調控SOX5 影響乳腺癌SKBR-3細胞中Twist1 信號通路和EMT 的發生Western blot 結果顯示，與miR-con 組比較，過表達miR-452-5p 后，Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平顯著降低，E-cadherin 水平顯著升高（P＜0.05）；過表達SOX5 后，與miR-452-5p 組比較，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋 白水平顯著增加，E-cadherin 水平顯著降低，miR-452-5p+pcDNA 組各蛋白水平與miR-452-5p 組無顯著變化（圖6）。

圖6 miR-452-5p 調控SOX5 影響乳腺癌細胞中AKT 信號通路

3 討論

乳腺癌進展緩慢，但仍是引起女性癌癥死亡的主要原因［8］。目前關于乳腺癌的治療主要有手術、化療、放療、激素治療和靶向治療。隨著對乳腺癌研究的深入，目前的治療方法極大地改善了患者的預后，但是耐藥性和腫瘤細胞復發轉移仍然限制了當前治療方法的有效性。

miRNA 是一類長約20～25 個核苷酸的內源性非編碼小RNA，通過堿基互補配對的方式與靶基因結合，調控基因的表達。有研究報道，提高miR-452-5p 的表達可抑制肝癌細胞的惡性侵襲和遷移［9］。該研究結果顯示，miR-452-5p 在乳腺癌細胞中低表達，過表達miR-452-5p 可抑制細胞的增殖、侵襲和轉移，與上述研究結果相似，提示miR-452-5p 在乳腺癌細胞中發揮抑癌基因作用。

Cyclin D1 調控細胞增殖周期的G1-S 過程，其在正常組織中不表達或者低表達，在惡性腫瘤組織中高表達［10］。CDK 也是調節細胞周期的重要蛋白，包括CDK1～7，CDK 蛋白的激活依賴于Cyclin 的結合［11］。CDK4 是細胞增殖周期G1-S 過程的重要成分，其在腫瘤和細胞系中異常高表達［12］。研究報道，喉癌細胞中Cyclin D1、CDK4 表達水平顯著高于正常喉上皮細胞，抑制Cyclin D1 或CDK4 表達后喉癌細胞的增殖受到抑制［13］。該研究中過表達miR-452-5p 后，乳腺癌SKBR-3 細胞Cyclin D1、CDK4蛋白水平顯著降低，提示miR-452-5p 發揮抑癌基因作用，阻滯細胞的增殖。

MMPs 活化可促進細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）降解，促進癌細胞的侵襲和轉移［14］。研究報道，MMP-2、MMP-9 在人卵巢黏液囊腺上皮癌細胞高表達，其表達水平與細胞的惡性程度，侵襲和轉移密切相關［15］。該研究中過表達miR-452-5p后，乳腺癌SKBR-3 細胞MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著降低，提示過表達miR-452-5p 可抑制細胞侵襲和轉移能力，進一步驗證了miR-452-5p 的抑癌作用。

TargetScan 軟件預測miR-452-5p 與SOX5 3’UTR 存在結合位點，該研究進一步采用雙熒光素酶實驗驗證顯示，miR-452-5p 靶向調控SOX5 的表達。SOX 家族可編碼包括SOX1～15、17、18、21、30等一系列轉錄因子，SOX5 基因位于染色體12p12.1區域，其在細胞生長、增殖、分化中發揮重要作用［16］。近年來發現，SOX5 作為癌基因在前列腺癌、三陰性乳腺癌等幾種癌癥中高表達［5，7］。該研究結果顯示，SOX5 在乳腺癌細胞系中的表達水平顯著高于正常乳腺癌細胞，與上述研究結果一致，提示SOX5 在乳腺癌中發揮癌基因作用。研究表明，SOX5 可以被小RNA 調控，在前列腺癌細胞中，miR-139-5p 的升高導致SOX5 表達下降［17］。該研究中過表達miR-452-5p 后，乳腺癌SKBR-3 細胞SOX5 蛋白水平顯著降低，提示miR-452-5p 可調控SOX5 的表達。研究報道，過表達SOX5 可促進胃癌細胞的增殖和侵襲［18］。該研究中過表達SOX5 后發現，細胞的增殖活性顯著增強，細胞遷移和侵襲數顯著增加，SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著增加，提示過表達SOX5，可降低miR-452-5p 對乳腺癌細胞的增殖抑制、侵襲和遷移抑制作用。惡性腫瘤的發展是多因素、多步驟的病理變化，有研究報道，Twist信號通路、EMT 過程與多種腫瘤細胞的侵襲轉移途徑相關，調節前列腺癌細胞中SOX5 的表達，可以抑制Twist 表達進而抑制EMT 過程［19］。該研究中過表達miR-452-5p 后，Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平顯著降低，E-cadherin 水平顯著升高，EMT進程受到抑制。過表達SOX5 后，Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平顯著增加，E-cadherin 水平顯著降低，減弱miR-452-5p 對EMT 的抑制作用，提示可通過調節SOX5 表達調控EMT 過程。從機制上講，miR-452-5p 調控SOX5 的表達，抑制EMT 過程，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，為miR-452-5p作為乳腺癌的治療靶點提供有力的理論依據。

綜上所述，該研究初步證實miR-452-5p 可能通過靶向SOX5 調控Twist 信號通路進而抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移，其機制可能與Twist 通路相關。